程宇 鄭杰 陳浩 李健蘭 黃玲 姚耀聰 陳燦

[摘要] 目的 探究紅景天苷/殼聚糖水凝膠對大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞抗氧化應(yīng)激損傷的影響。 方法 將細胞株分為Control組，H2O2組（模型組），低、中、高濃度實驗組，對模型組和各實驗組進行氧化應(yīng)激造模。通過不同溫度觀察水凝膠溫敏性，使用光鏡觀察細胞形態(tài)，CCK-8法檢測細胞活力，CM-Dil Dye標記細胞進行計數(shù)及3D形態(tài)觀察。 結(jié)果 水凝膠在4℃為溶膠態(tài)，37℃為凝膠態(tài)。光鏡下中濃度實驗組細胞形成明顯集落。第0、1天各組細胞活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。第3、7天，模型組細胞活力低于Control組，各實驗組細胞活力均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。第0、1天各組細胞數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。第3、7天，模型組細胞數(shù)低于對照組，各實驗組細胞數(shù)均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。3D圖像觀察到中濃度實驗組細胞隨時間增長從球形逐漸呈樹枝狀生長。 結(jié)論 紅景天苷修飾的水凝膠促氧化應(yīng)激損傷的大鼠脂肪干細胞存活。

[關(guān)鍵詞] 殼聚糖水凝膠;紅景天苷;脂肪間充質(zhì)干細胞;氧化應(yīng)激

[中圖分類號] R114? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（a）-0004-04

Effect of salidroside/chitosan hydrogel on oxidative stress injury in rat adipose tissue derived mesenchymal stem cells

CHENG Yu? ?ZHENG Jie? ?CHEN Hao? ?LI Jianlan? ?HUANG Ling? ?YAO Yaocong? ?CHEN Can

Department of Cardiology， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Guangdong Province， Zhanjiang? ?524000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of salidroside/chitosan hydrogel on oxidative stress injury in rat adipose tissue derived mesenchymal stem cells. Methods The cell lines were divided into Control group， H2O2 group （model group）， low， medium and high concentration experimental group， while oxidative stress modeling was performed on the model group and each experimental group. The temperature sensitivity of the hydrogel was observed at different temperatures， the cell morphology was observed by a light microscope， the cell viability was detected by the CCK-8 method， while the cells were labeled with CM-Dil Dye for counting and 3D morphological observation. Results The hydrogel was in a sol state at 4℃ and in a gel state at 37℃. The cells in the medium concentration experimental group formed obvious colonies under the light microscope. There was no statistically significant difference in cell viability between the groups on days 0 and 1 （P > 0.05）. On days 3 and 7， the cell viability of the model group was lower than that of the Control group， while the cell viability of each experimental group was higher than that of the model group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. On days 0 and 1， there was no statistically significant difference in the number of cells in each group （P > 0.05）. On days 3 and 7， the number of cells in the model group was lower than that in the control group， while the number of cells in each experimental group was higher than that in the model group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The 3D images observed that the cells in the medium concentration experimental group grew from spherical to dendritic with time. Conclusion Salidroside-modified hydrogel promotes survival of rat adipose stem cells injured by oxidative stress.

[Key words] Chitosan hydrogel; Salidroside; Adipose-derived mesenchymal stem cells; Oxidative stress

隨著再生醫(yī)學(xué)發(fā)展，干細胞在心肌梗死治療中表現(xiàn)出巨大的潛力[1]。大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞（rASCs）因來源廣泛、低免疫原性、高分化潛能等優(yōu)點，已廣泛用于基礎(chǔ)和臨床研究[2]。但移植干細胞存活率及滯留率仍然是阻礙干細胞進一步發(fā)展的難題[3]。殼聚糖水凝膠（CS-gel）為良好的生物相容性天然高分子材料[4]，具有抗菌、調(diào)節(jié)免疫力，促進傷口愈合等作用以及溫敏特性，故廣泛用于生物組織工程和藥物釋放領(lǐng)域[5-6]。紅景天苷（SAL）是紅景天中主要酚苷之一，具有抗衰老、抗氧化、抗炎等廣譜藥理活性[7-8]。關(guān)于SAL修飾的殼聚糖水凝膠（SAL/CS-gel）負載rASCs抗氧化應(yīng)激研究鮮有報道，本實驗旨在探究不同濃度SAL修飾的CS-gel對其承載的rASCs抗氧化應(yīng)激影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞株? rASCs株購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司。

1.1.2 實驗主要試劑和設(shè)備? 紅景天苷標準品（美國Sigma，貨號：05410590）;過氧化氫（H2O2）和Cell Counting Kit-8（上海碧云天生物技術(shù)公司，貨號：S0051、C0039）;殼聚糖（Cs）和β-甘油磷酸鈉（上海阿拉丁公司，貨號：D106347、C105801）;Cell TrackerTM CM-DiI Dye（美國賽默飛，貨號：C7001）;激光共聚焦掃描顯微鏡（日本奧林巴斯，型號：FV3000）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組? 實驗分為五組：Control組，H2O2組（模型組），低、中、高濃度實驗組。Control組包含CS-gel + rASCs;H2O2組包含CS-gel + rASCs+H2O2;低中高濃度實驗組包含SAL/CS-gel+rASCs+H2O2。

1.2.2 SAL/CS-gel制備? CS-gel實驗步驟參照文獻[9]，殼聚糖溶于0.1 mol/L醋酸溶液，高溫高壓滅菌。β-甘油磷酸鈉溶于3 mL雙蒸水，85℃孵育30 min，0.22 μm濾孔過濾除菌。殼聚糖溶液和β-甘油磷酸鈉溶液5.5∶2.0比例混合，冰浴2 h，逐滴添加4.54%碳酸氫鈉溶液，至pH達到7.0～7.2。加入二甲基亞砜溶解的SAL溶液，使SAL終濃度各自為50、100、200 μmol/L，分別在4℃、室溫、37℃條件下觀察SAL/CS-gel凝膠時間。

1.2.3 CCK-8檢測細胞活力? 配制細胞凝膠混合液，接種至96孔板，50 μL/孔，形成凝膠態(tài)后，加入完全培養(yǎng)基50 μL/孔。置于細胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，給予模型組和實驗組500 μmol/L H2O2處理，分別在0、1、3、7 d，加入CCK-8液[無胎牛血清培養(yǎng)基（1∶9）]，置于細胞培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標儀450 nm處測量吸光度OD值。

1.2.4 CM-Dil Dye標記rASCs法? 全程無菌、避光操作，二甲基亞砜稀釋CM-Dil Dye為濃度1 mg/mL的儲存液，用無血清培養(yǎng)基稀釋為1 μmol/L工作液。取對數(shù)生長期rASCs，200 μL工作液重懸（4～5）×106個細胞，置于培養(yǎng)箱孵育5 min，4℃水浴箱孵育15 min，1000 r/min離心5 min，收集細胞并PBS洗兩次。加入溶膠態(tài)水凝膠并形成細胞凝膠混合物。接種到共聚焦皿500 μL/皿，形成凝膠后，再加入等體積完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)1 d后，給予實驗組和模型組H2O2處理，分別在第0、1、3、7天激光共聚焦拍攝觀察3D細胞形態(tài)并細胞計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件制作圖表，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAL/CS-gel溫敏性

SAL/CS-gel在4℃為溶膠態(tài)，室溫靜置30 min后呈凝膠態(tài)，37℃靜置5 min后呈凝膠態(tài)，提示SAL/CS-gel具有溫敏特性。見圖1。

2.2 SAL/CS-gel中細胞明場形態(tài)

第0天，各組細胞均呈散在短梭形或橢圓形，體積略小，折光點強。隨著時間推移，對照組細胞呈散在長梭形，出現(xiàn)分枝，少量聚集成團。模型組細胞數(shù)量明顯減少，第7天，出現(xiàn)碎裂圓點，僅存少數(shù)細胞且形態(tài)各異。SAL處理后，100 μmol/L濃度組細胞呈顯著集落生長，且分枝明顯。隨著時間增加，50 μmol/L和200 μmol/L組濃度，細胞數(shù)緩慢減少，并呈現(xiàn)散在梭形或圓形，可見細胞碎片。見圖2。

2.3 各組細胞不同時間段細胞活力比較

第0、1天各組細胞活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。第3、7天模型組細胞活力低于對照組，SAL各濃度組細胞活力均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖3。

與對照組同期比較，*P < 0.05;與模型組同期比較，#P < 0.05，##P < 0.01

2.4 觀察CM-Dil Dye標記的細胞存活和3D形態(tài)

2.4.1 CM-Dil Dye標記的細胞存活? 第0、1天各組細胞數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。第3、7天模型組細胞數(shù)低于對照組，各SAL濃度組細胞數(shù)均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖4。

2.4.2 觀察細胞3D形態(tài)? SAL 100 μmol/L組，第1天細胞橫截面呈散在圓形或橢圓形，膜光滑完整，3D成像細胞呈球形，見圖5A、B。第3天3D成像細胞呈樹枝狀，且體積增大，呈集落生長。見圖5C、D。

3 討論

心肌梗死仍然是全世界非傳染性疾病死亡的主要原因之一[10]，心肌因缺血、缺氧而壞死，嚴重影響心功能，甚至危及生命。目前主要采取再灌注療法，減少心肌梗死面積、挽救瀕死心肌細胞[11]，但對缺血組織恢復(fù)血液供應(yīng)和氧氣供應(yīng)后，因過量自由基產(chǎn)生，使氧化/抗氧化動態(tài)平衡失調(diào)，導(dǎo)致再灌注損傷。因此，尋找新型治療手段迫在眉睫[12]。已有研究顯示[13]，rASCs移植用于改善心肌梗死損傷，一方面是通過干細胞直接分化為心肌樣細胞;另一方面，通過旁分泌作用于受損心肌細胞[14]。本研究通過采用溫敏水凝膠作為干細胞支架擬用于心肌梗死輔助治療，然而氧化應(yīng)激微環(huán)境不僅影響心肌細胞，也同時影響移植干細胞。例如縮短干細胞滯留時間、誘導(dǎo)干細胞凋亡，從而削弱干細胞對損傷組織的修復(fù)作用[15]。而有研究顯示[16]，H2O2誘導(dǎo)脂肪干細胞氧化應(yīng)激損傷，是通過產(chǎn)生大量活性氧簇、丙二醛以及抑制抗氧化酶活性、激活凋亡通路，從而引起脂肪干細胞存活率和滯留率降低。因此，尋找不影響水凝膠生物特性且能增強干細胞抗氧化能力的物質(zhì)成為現(xiàn)今研究熱點。SAL提取于傳統(tǒng)中藥紅景天，其抗氧化活性主要部位是酚羥基。已有研究顯示[17-18]，SAL通過激活PI3K/Akt/Nrf2通路減輕缺血再灌注大鼠神經(jīng)細胞凋亡，提示SAL作為植物化學(xué)物質(zhì)可激活抗氧化應(yīng)激通路。而本實驗觀察到，隨培養(yǎng)時間延長，對照組細胞活力呈逐漸增高到降低過程，但細胞數(shù)量無明顯變化。提示rASCs適應(yīng)水凝膠環(huán)境后無明顯增殖，與貼壁培養(yǎng)具有強細胞增殖活性rASCs區(qū)別顯著[19]。值得注意的是，不同材料支架對ASCs培養(yǎng)會向不同方向分化。如脂肪顆粒包埋ASCs向脂肪細胞分化、淫羊藿苷對與復(fù)合支架共培養(yǎng)ASCs促成骨分化等[20-21]，提示rASCs在SAL/CS-gel中可能存在向終末細胞分化。氧化應(yīng)激處理后，模型組細胞活力和細胞數(shù)量隨時間明顯降低，光鏡觀察到細胞碎裂，提示殼聚糖水凝膠對氧化應(yīng)激損傷的rASCs無保護作用。而本研究結(jié)果顯示，第3、7天，SAL 100 μmol/L組rASCs細胞活力顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），提示SAL/CS-gel具有抗rASCs氧化應(yīng)激損傷作用。

目前SAL/CS-gel中干細胞不可重回收，無法對干細胞表型及細胞內(nèi)在變化進行檢測，為進一步明確SAL修飾的水凝膠調(diào)控干細胞存活機制，探尋可回收干細胞生物材料十分必要。且氧化應(yīng)激因不同病理環(huán)境、作用時間長短、發(fā)生程度等存在多種調(diào)控機制，故完善多種抗氧化應(yīng)激指標，如活性氧簇、超氧化物歧化酶等，可以進一步證實SAL/CS-gel抗氧化能力。綜上所述，SAL修飾的殼聚糖水凝膠可以有效促進rASCs在氧化應(yīng)激環(huán)境下存活，從而為rASCs移植后發(fā)揮持久作用奠定了基礎(chǔ)，為設(shè)計功能性生物材料提供新思路。

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（收稿日期：2020-01-12? 本文編輯：王曉曄）