李亞平，項福星，韓建國，方曉春，肖衛(wèi)華，韓魯佳

(1. 承德市農(nóng)林科學(xué)院，河北 承德 067000；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083)

隨著煤炭、石油、天然氣等化石資源的日益枯竭，且在開發(fā)利用過程中造成大量溫室氣體排放和環(huán)境污染，木質(zhì)纖維作為自然界中儲量最豐富的可再生資源長期以來受到研究者廣泛關(guān)注[1]。作為木質(zhì)纖維之一的農(nóng)作物秸稈來源廣泛，是儲量豐富的可再生生物質(zhì)資源[2]。我國是農(nóng)業(yè)大國，每年各類生物質(zhì)秸稈產(chǎn)量巨大，其中，玉米秸稈的產(chǎn)量最大，約為2.2 億 t[3]，資源豐富。但利用率低，大量秸稈低效燃燒造成資源浪費，且污染環(huán)境。因此，將玉米秸稈資源化開發(fā)利用具有很大的社會經(jīng)濟效益，對“美麗鄉(xiāng)村”建設(shè)、節(jié)能減排、實現(xiàn)低碳經(jīng)濟轉(zhuǎn)型發(fā)揮著積極而重要的作用。

秸稈的資源化利用主要表現(xiàn)在利用纖維素酶等酶降解玉米秸稈轉(zhuǎn)化為還原糖，然后發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精、單細胞蛋白(SCP)及乳酸等有機酸物質(zhì)[4～6]。玉米秸稈主要由纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素組成，由于纖維素分子內(nèi)和分子間存在著大量的氫鍵，并在固態(tài)下聚集成不同水平的結(jié)晶性原纖結(jié)構(gòu)，以及木質(zhì)素、半纖維素對纖維素的保護作用，使得秸稈顯示出剛性和高度水不溶性，對試劑的可及度低，溶解困難，反應(yīng)均一性差[7～8]。因此，要對其進行預(yù)處理，提高酶解效率。

盡管已有學(xué)者對玉米秸稈酶解做了大量研究[4,6,9]，但對短時間超微粉碎預(yù)處理對酶解效果的影響研究甚少[10]。因此筆者擬采用短時間超微粉碎預(yù)處理手段對玉米秸稈進行預(yù)處理，并對預(yù)處理后的玉米秸稈樣品進行酶解試驗研究。探究不同預(yù)處理時間對玉米秸稈粒徑分布和酶解后總還原糖及葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖等各種糖產(chǎn)量的影響，同時分析比較原樣和超微粉碎預(yù)處理樣品酶解的固體回收率、葡萄糖收率，研究超微粉碎預(yù)處理對玉米秸稈酶解效果的影響，以期對生物質(zhì)秸稈的資源化利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

玉米秸稈，采自承德市農(nóng)林科學(xué)院“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新基地”。取回后于通風(fēng)處自然晾干，粉碎至40目后封裝于密封袋中室溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

葡萄糖(≥99.5%)、阿拉伯糖(≥99%)、纖維素酶(Cellulast 1.5L)、纖維二糖酶(Novozyme 188)和pNPG來自 Sigma；木糖(≥99%)和纖維二糖(≥99%)來自Sigma-Aldrich；氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、酒石酸鉀鈉和一水合檸檬酸等均為分析純，來自北京化工廠；偏重亞硫酸鈉，分析純，來自西隴化工股份有限公司；pNP，分析純，來自百靈威科技有限公司；四環(huán)素鹽酸鹽，分析純，來自北京藍弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

RT-34靜音研磨粉碎機：香港榮聰精密科技有限公司；CJM-SY-B高能納米球磨粉碎機：秦皇島市太極環(huán)納米制品有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計：SHIMADZU公司；Waters e2695高效液相色譜儀：Waters公司；Mastersizer 3000激光粒度儀：Malvern公司；XS205電子天平：METTLER TOLEDO公司；SevenEasy pH計：METTLER TOLEDO公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：MILLIPORE公司；SHA-B(A)水浴恒溫振蕩器：金壇市科析儀器有限公司；TW 20恒溫水浴鍋：優(yōu)萊博儀器有限公司。

1.3 玉米秸稈超微粉碎預(yù)處理

用高能納米球磨粉碎機對玉米秸稈 40 目粗粉樣品進行超微粉碎，超微粉碎過程中不添加任何助磨劑、抗結(jié)塊劑，用循環(huán)冷卻水保持罐體溫度低于 30 ℃。選用強化不銹鋼磨罐，氧化鋯球作為磨介質(zhì)，球料體積比 2∶1，球磨介質(zhì)填充率為 35%，分別干法粉碎 0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h和2.0 h，將得到的樣品分別裝入密封袋內(nèi)室溫避光保存，分別命名為 BM0 h(即秸稈原樣)、BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h。

1.4 粒徑分布

筆者試驗采用馬爾文公司的 MASTERSIZER 3000 激光衍射技術(shù)測量不同球磨時間的玉米秸稈的粒徑分布。系統(tǒng)由樣品分散裝置、光學(xué)平臺和軟件三部分構(gòu)成。樣品用 Aero S 干法附件分散，當(dāng)激光束穿過分散的顆粒時，通過測量散射光強來完成粒度測定[11]。測定時，取適量玉米秸稈粉體放于樣品分散裝置入口，空氣做為分散介質(zhì)進行測量，測定粒徑范圍為0.01～3 000 μm。粒徑大小以中值粒徑表示，粒徑均勻度用粒徑跨度[12]表示。每個樣品測量 3 次。粒徑跨度如公式1所示。

粒徑跨度= (D90-D10)/D50

(1)

其中：D50、D10和D90分別代表粉體樣品累計分布百分數(shù)分別達到 50%、10%、90%時所對應(yīng)的粒徑大小。

1.5 分析測定方法

纖維素酶濾紙酶活參照美國國家可再生能源實驗室(National Renewable Energy Laboratory，NREL)的 NREL/TP-510-42628 標(biāo)準(zhǔn)方法[13]測定。纖維二糖酶活力采用 pNPG 法測定[14]。采用 Miller 的 3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[15]測定酶解濾液中的總還原糖含量，每個樣品進行 2 個重復(fù)測定。參考美國國家可再生能源實驗室(NREL)的NREL/TP-510-42623 標(biāo)準(zhǔn)方法[16]，測定酶解濾液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖等各種糖的含量。

1.6 酶解方法

對玉米秸稈原樣、超微粉碎預(yù)處理后樣品分別進行72 h酶解試驗。稱取7 g樣品于500 mL的錐形瓶中，加入140 mL用 pH4.8 的檸檬酸鈉緩沖溶液稀釋的纖維素酶和纖維二糖酶混合液，使酶解過程中干物質(zhì)的含量達到 5%(w/v)，混合液中纖維素酶的加載量為 20 FPU·g-1干物質(zhì)，纖維二糖酶的加載量為 40 CBU·g-1干物質(zhì)，同時為避免酶解過程中微生物的干擾，在混合液中加入 0.08 g·L-1的四環(huán)素鹽酸鹽。充分混勻后，將所有的錐形瓶用保鮮膜密封好，放入水浴恒溫振蕩器中，在 50 ℃、150 rpm 的條件下進行酶解反應(yīng)，72 h 后離心分離，取出上清液用于測定總還原糖含量和葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖等各種糖含量，固體部分用去離子水多次沖洗至中性后，真空冷凍干燥 24 h 后測定固體回收率。

1.7 固體回收率的測定

固體回收率通過公式(2)進行計算：

固體回收率=(m1/m2)×100

(2)

式中，m1代表預(yù)處理后或酶解后玉米秸稈質(zhì)量，g；m2代表預(yù)處理前或酶解前玉米秸稈質(zhì)量，g。

1.8 葡萄糖收率

酶解后葡萄糖收率是指秸稈殘渣酶解后所產(chǎn)生的葡萄糖量與用于預(yù)處理的秸稈中纖維素完全水解理論上應(yīng)該產(chǎn)生的葡萄糖的總量之比[17]。葡萄糖收率的計算如公式3所示。

葡萄糖收率(%)=ab/(c/0.9)×100

(3)

式中，a表示預(yù)處理后玉米秸稈的固體回收率；b表示秸稈酶解后葡萄糖產(chǎn)量，mg·g-1；c表示玉米秸稈原樣中的纖維素含量，此處c=30.50%；0.9 為葡萄糖與纖維素間的質(zhì)量轉(zhuǎn)化系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑分布

激光粒度法是目前測定粉體粒徑一個常用的方法，能直觀反映粉體的平均粒徑和粒度累計分布。不同超微粉碎時間后玉米秸稈粉體的的D10、D50、D90、粒徑跨度和平均粒徑分布曲線分別如表1和圖1所示。

表1 不同超微粉碎時間玉米秸稈粉體的D10、D50、D90和粒徑跨度

由表1可看出，在超微粉碎0～1.5 h期間，隨著粉碎時間的延長，中值粒徑減小，并在BM1.5 h時達到最小值8.23 μm，說明經(jīng)超微粉碎后，能有效減小其粉體平均粒徑，同時粉碎時間越長，其平均粒徑越小，在超微粉碎1.5 h時，玉米秸稈粒徑尺寸達到表觀粉碎極限。延長粉碎時間到2 h發(fā)現(xiàn)，D10、D50和D90相比BM1.5 h都有所增加。這可能是粉碎時間達2 h時，粉體中出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，因分子間力大于破碎力，粉體中有小顆粒附著在大顆粒表面，形成部分大顆粒，導(dǎo)致平均粒徑增大[18～19]。粒徑跨度表示粒徑的均勻度、粒度分布范圍，粒徑跨度越小表示粒徑越均勻，粒度分布范圍越窄[12]。 由表1可看出，當(dāng)玉米秸稈經(jīng)超微粉碎后，粒徑跨度增大，說明超微粉碎后粒徑均勻度不如粗粉樣品。

由圖1可看出，相比于粗粉樣品，玉米秸稈超微粉碎后平均粒徑分布曲線整體左移，這是由于超微粉碎破壞了玉米秸稈的維管束[20]。由表1可知，超微粉碎后樣品的D50均小于30 μm，表明超微粉碎后顆粒向微細化發(fā)展，且已粉碎到細胞尺度[21]。

2.2 酶解糖產(chǎn)量

選擇玉米秸稈原樣、超微粉碎預(yù)處理后玉米秸稈(BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h)進行酶解72 h試驗。測定酶解72 h后總還原糖及葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖等各種糖產(chǎn)量如圖2所示。總還原糖產(chǎn)量指酶解后產(chǎn)生的包含本試驗中葡萄糖等4種糖在內(nèi)的所有還原糖產(chǎn)量的總和。玉米秸稈原樣直接酶解后還原糖產(chǎn)量是155.05 mg·g-1，BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h酶解后還原糖產(chǎn)量分別為346.48 mg·g-1、466.80 mg·g-1、530.27 mg·g-1、613.60 mg·g-1，分別是原樣直接酶解的2.23倍、3.01倍、3.42倍、3.96倍。玉米秸稈原樣直接酶解后葡萄糖產(chǎn)量是90.43 mg·g-1，BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h酶解后葡萄糖產(chǎn)量分別為198.03 mg·g-1、267.39 mg·g-1、307.55 mg·g-1、351.47 mg·g-1，分別是原樣直接酶解的2.19倍、2.96倍、3.40倍、3.89倍。由圖可知，在0～2 h內(nèi)，預(yù)處理時間越長，酶解后總還原糖及葡萄糖等各種糖產(chǎn)量均越高。這是由于超微粉碎主要通過碰撞、擠壓和研磨等降低物料粒徑和增大比表面積和孔體積，使表面多糖物質(zhì)含量升高、木質(zhì)素和抽提物含量降低、增大纖維素表面積和木質(zhì)素表面積、降低結(jié)晶度，增加酶作用位點[22～24]，酶解效率相對于原樣提高很多，且在0～2 h內(nèi)，預(yù)處理時間越長，酶解效率越高。

2.3 酶解后固體回收率

玉米秸稈原樣和經(jīng)過預(yù)處理后樣品酶解72 h的固體回收率如圖3所示。由圖可知，固體回收率隨預(yù)處理時間延長而降低。原樣酶解后產(chǎn)糖量很低，固體回收率較高，為72.86%。超微粉碎預(yù)處理0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后，酶解固體回收率分別為61.50%、49.46%、42.02%、37.46%，依次降低。預(yù)處理時間越長，酶解時產(chǎn)糖量越高，水解程度越高，所剩固體殘渣越少，固體回收率越低。與產(chǎn)糖量結(jié)果一致。

2.4 葡萄糖收率

葡萄糖收率可以反映酶解過程中秸稈中纖維素的降解程度，一定程度上反映了秸稈的酶解效率。葡萄糖收率越高，表示纖維素降解程度越高，酶解效率越高[17]。玉米秸稈原樣和預(yù)處理樣品酶解72 h的葡萄糖收率見表2。由表2可看出，原樣直接酶解后葡萄糖收率較低，為26.68%，超微粉碎預(yù)處理后酶解的葡萄糖收率升高，且預(yù)處理時間越長，葡萄糖收率越高。超微粉碎預(yù)處理2 h的葡萄糖收率高達98.57%，酶解效率相比原樣提高了2.69倍。由此可見，超微粉碎預(yù)處理對酶解具有重要的促進作用。

表2 玉米秸稈原樣和預(yù)處理樣品酶解72 h的葡萄糖收率

3 結(jié) 論

(1)超微粉碎能有效減小玉米秸稈粉體平均粒徑，同時粉碎時間越長，其平均粒徑越小，在超微粉碎1.5 h時，玉米秸稈粒徑尺寸達到表觀粉碎極限。延長粉碎時間達2 h時，粉體中出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，因分子間力大于破碎力，粉體中有小顆粒附著在大顆粒表面，形成部分大顆粒，導(dǎo)致平均粒徑增大。超微粉碎后樣品的D50均小于30 μm，表明超微粉碎后顆粒向微細化發(fā)展，且已粉碎到細胞尺度。

(2)在0～2 h內(nèi)，預(yù)處理時間越長，酶解后總還原糖及葡萄糖等各種糖產(chǎn)量均越高。BM2.0 h酶解還原糖和葡萄糖產(chǎn)量分別是玉米秸稈原樣直接酶解的3.96倍、3.89倍。超微粉碎預(yù)處理可以大幅度地提高秸稈酶解糖產(chǎn)量。

(3)玉米秸稈原樣酶解72 h的固體回收率較高，為72.86%。超微粉碎預(yù)處理時間越長，酶解時產(chǎn)糖量越高，水解程度越高，所剩固體殘渣越少，固體回收率越低。

(4)原樣直接酶解后葡萄糖收率較低，為26.68%。超微粉碎預(yù)處理后酶解的葡萄糖收率升高，且預(yù)處理時間越長，葡萄糖收率越高。超微粉碎預(yù)處理2 h的葡萄糖收率高達98.57%，酶解效率相比原樣提高了2.69倍。由此可見，短時間超微粉碎預(yù)處理可促進秸稈降解為還原糖，提高酶解效率，對酶解具有重要的促進作用。