田茜，段乃彬，張文蘭，李群，顏廷進(jìn)，戴雙，丁漢鳳

（山東省農(nóng)作物種質(zhì)資源中心，山東 濟(jì)南 250100）

種子使植物能夠在惡劣環(huán)境下生存，并將遺傳信息傳給下一代。然而種子成熟后，隨著貯藏時間延長其生理生化狀態(tài)會發(fā)生一系列變化，導(dǎo)致其生活力、活力逐漸下降，直至衰老死亡，這種伴隨著種子貯藏時間的增加而發(fā)生和發(fā)展的自然的不可逆的過程，即為種子劣變或老化［1］。種子老化過程中會產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS會導(dǎo)致種子內(nèi)部發(fā)生一系列的生化裂變，包括膜透性增加、酶活性降低、貯藏物質(zhì)減少等［2-4］。種子老化不僅能夠降低種子貯藏期間的生活力，同時也是影響植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量的主要原因之一［5］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，種子老化會導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失和遺傳資源損失［6］。因此，如何延緩種子老化及提高老化種子活力的研究備受關(guān)注，研究種子老化過程中的各種生理生化變化、提高種子活力和保存期限，對農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和種質(zhì)保存有著重要的指導(dǎo)意義。

種子含水量、貯藏溫度和氣體成分是影響種子貯藏壽命的關(guān)鍵因素，調(diào)控適宜的貯藏條件可以延緩種子老化速度，提高種子貯藏壽命。氣調(diào)貯藏作為一種綠色環(huán)保、安全有效的貯藏技術(shù)，通過控制氣體成分來降低氧含量，從而有效降低種子貯藏過程中的氧化損傷，延長種子的貯藏壽命，得到越來越多的關(guān)注。目前，氣體對種子貯藏過程中活力及品質(zhì)影響的研究主要集中在N2和CO2。羅廣華等［7］研究發(fā)現(xiàn)，N2和CO2有延緩38～40℃人工老化貯藏花生種子老化的效果；涂杰等［8］對比了CO2氣調(diào)儲藏與常規(guī)儲藏對粳秈稻谷品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)CO2氣調(diào)儲藏比常規(guī)儲藏品質(zhì)變化緩慢；王若暉等［9］也發(fā)現(xiàn)，高溫下充CO2氣調(diào)儲藏能延緩青稞品質(zhì)的降低。近年來開展充氮?dú)庹{(diào)貯藏對種子品質(zhì)影響的研究較多，研究發(fā)現(xiàn)充氮?dú)庹{(diào)可以有效減緩高溫對玉米、高粱、秈糙米品質(zhì)的影響［10-12］；付家榕等［13］研究發(fā)現(xiàn)，充氮?dú)庹{(diào)能在一定程度上延緩大豆貯藏過程中的老化。

氬氣（Ar）屬于惰性氣體，無毒無味，化學(xué)活性低，價格低廉。用氬氣進(jìn)行瓜果蔬菜保鮮是近年的一種新穎的食品保鮮技術(shù)。在一定的壓力下，氬氣可以與水果和蔬菜細(xì)胞間的水分子形成一種特殊的“籠形水合物”［14］，這種水合物不僅限制了水果和蔬菜中水分子的活動，而且能抑制酶活性和代謝生理活動，降低呼吸速率，最終抑制其褐變和成熟，從而達(dá)到保鮮的效果［15，16］。該技術(shù)具有無毒副作用、操作簡單、效果明顯等優(yōu)點(diǎn)，得到了越來越多的關(guān)注。但目前尚未見氬氣用于種子保存及其對種子老化影響的相關(guān)報道。因此，本研究用人工老化模擬自然老化，采用氬氣和空氣貯藏兩種方式，研究氬氣氣調(diào)貯藏對玉米種子老化過程中活力和生理生化特性的影響，探討氬氣對種子老化的影響，以期為種子安全保存新方法的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理方法

試驗(yàn)所用玉米（Zea mays L.）品種為‘鄭單958’，由山東省農(nóng)作物種質(zhì)資源中心種質(zhì)保存中期庫提供。種子初始發(fā)芽率為99%，初始含水量為10.2%。

取種子樣品500 g儲存于廣口瓶中用雙孔塞子進(jìn)行密封，按圖1工藝充入氬氣，用氣體分析儀檢測氣體濃度，當(dāng)模擬倉內(nèi)充滿氬氣時，立即關(guān)掉閥門，密封瓶口。以充滿空氣為對照。將種子置于60℃的人工老化箱內(nèi)進(jìn)行老化處理，每隔12 h取樣，測定種子活力及各項(xiàng)生理指標(biāo)。

圖1 模擬倉充氬氣工藝流程

1.2 生理指標(biāo)的測定

發(fā)芽指標(biāo)的測定參照國際種子檢驗(yàn)協(xié)會（ISTA）的《種子檢驗(yàn)規(guī)程》（1996）［17］進(jìn)行。隨機(jī)選取100粒種子，放入鋪有兩層濾紙的發(fā)芽盒中，重復(fù)4次，將發(fā)芽盒置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每日統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)。發(fā)芽結(jié)束后分別計算不同處理種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

發(fā)芽勢Gp＝第3 d時發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽率G＝第7 d時發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)GI＝Σ（Gt/Dt）；

活力指數(shù)VI＝GI×DW。式中，Gt為第t天發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)，DW 為幼苗干重。

種子電導(dǎo)率：取3份玉米種子，每份20粒，用去離子水沖洗3次，迅速用濾紙吸干種子表面水分，置于100 mL三角瓶中，加入30 mL去離子水，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h。用METTLERTOLEDO 326電導(dǎo)率儀（Delta 326，METTLERTOLEDO，China）測定種子初始電導(dǎo)率（a1），然后將種子及其浸出液置于100℃水浴中煮沸30 min，取出冷卻至25℃，測定煮沸后種子浸出液的電導(dǎo)率（a2）。根據(jù)公式計算浸出液的相對電導(dǎo)率。

相對電導(dǎo)率（%）＝（a1/a2）×100。

將老化不同時間的玉米種子置于濕潤濾紙上吸脹24 h，剝?nèi)∥浄N胚測定丙二醛（MDA）和H2O2含量、超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）、抗壞血酸過氧化物酶（APX，EC 1.11.1.7）活性［18］。蛋白質(zhì)濃度測定采用Bradford法［19］，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氬氣氣調(diào)貯藏對玉米種子萌發(fā)特性的影響

由表1可以看出，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均隨著老化時間的延長而逐漸降低。空氣貯藏條件下各指標(biāo)下降幅度較大，氬氣貯藏條件下各指標(biāo)下降較空氣貯藏的緩慢，延緩了玉米種子的老化進(jìn)程。在老化初期（12 h），空氣貯藏和氬氣貯藏種子的發(fā)芽指標(biāo)差異不顯著；老化24 h后，二者的萌發(fā)指標(biāo)均差異顯著，此時，氬氣貯藏仍能保持92.00%的發(fā)芽率，而空氣貯藏的發(fā)芽率已降至78.00%，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)也分別比空氣貯藏的提高了42.62%、19.75%、28.71%。至老化48 h時，氬氣貯藏種子的發(fā)芽率為52.00%，而空氣貯藏的僅為17.00%；氬氣貯藏種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)也維持在中等水平，而空氣貯藏的則均處于較低水平。人工老化72 h后，空氣貯藏種子的發(fā)芽率降為零，而氬氣貯藏的發(fā)芽率仍為17.00%。此外，空氣貯藏條件下種子發(fā)芽率下降50%的時間約為36 h，而氬氣貯藏的約為48 h。由此可見，氬氣貯藏延緩了種子活力下降的速度，對延緩種子老化進(jìn)程、延長種子壽命具有一定的作用。

表1 氣調(diào)貯藏條件下老化不同時間玉米種子的發(fā)芽情況

2.2 氬氣氣調(diào)貯藏對玉米種子浸出液電導(dǎo)率及MDA和H2 O2含量的影響

MDA是不飽和脂肪酸氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低是衡量脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)。種子浸出液電導(dǎo)率是表示細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)。圖2顯示，在空氣貯藏和氬氣貯藏條件下，種子浸出液的相對電導(dǎo)率、MDA和H2O2含量均隨老化時間的延長逐漸升高。氬氣貯藏的相對電導(dǎo)率、MDA和H2O2含量均低于空氣貯藏，且從老化24 h開始，二者差異顯著。人工老化36 h時，氬氣貯藏玉米種子的電導(dǎo)率、MDA和H2O2含量比空氣貯藏分別降低了22.87%、26.84%、33.02%。表明，隨著老化時間的延長，種子中活性氧（ROS）大量產(chǎn)生并積累，但氬氣貯藏在一定程度上抑制了老化種子中ROS的產(chǎn)生，降低了脂質(zhì)過氧化程度，有效緩解了老化引起的氧化損傷。

圖2 老化不同時間玉米種子的相對電導(dǎo)率及MDA和H2O2含量變化

2.3 氬氣氣調(diào)貯藏對玉米SOD、APX活性的影響

SOD和APX是清除活性氧的重要抗氧化酶。SOD是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，它可以把O·-2歧化成H2O2。APX是ASC-GSH循環(huán)中的關(guān)鍵酶，也是清除H2O2的主要酶。由圖3可知，在兩種貯藏方式下，玉米種胚中SOD、APX活性表現(xiàn)出相同的變化趨勢，都在老化初期增加，而后迅速下降，氬氣貯藏的酶活性顯著高于空氣貯藏。老化12 h，SOD、APX活性達(dá)到峰值，空氣貯藏的較未老化的分別增加5.17%、4.10%，氬氣貯藏的則分別增加19.25%、15.57%，且氬氣貯藏種子的酶活性顯著高于空氣貯藏，分別比空氣貯藏高出13.39%、11.02%。老化48 h，與空氣貯藏相比，氬氣貯藏種子種胚中SOD、APX活性分別高出86.25%、46.43%。表明人工老化過程中，氬氣貯藏抑制了種子中SOD、APX活性的降低，維持了較高的保護(hù)酶活性，提高了老化種子抵御ROS侵害的能力。

圖3 老化不同時間玉米種子的SOD、APX活性

3 討論與結(jié)論

老化是貯藏過程中影響種子質(zhì)量和活力的主要因素。本研究結(jié)果表明，在人工老化過程中，反映玉米種子萌發(fā)特性的各個指標(biāo)（發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)）均下降，這與孫守江等的研究結(jié)果一致［20］，與空氣貯藏相比，在氬氣貯藏條件下玉米種子各萌發(fā)指標(biāo)降速緩慢，這與CO2氣調(diào)［7-9］和充氮?dú)庹{(diào)［10-13］對種子老化研究的結(jié)果一致。羅廣華等［7］推測，這與種子的氣相缺氧有關(guān)，充氬氣貯藏實(shí)質(zhì)上是阻斷了O2與種子接觸，直接抑制了種子的呼吸作用；而種子呼吸作用的減弱又可以減少呼吸鏈中ROS的產(chǎn)生，降低細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度和其他細(xì)胞器損傷，從而延緩種子老化。

老化的自由基理論認(rèn)為，ROS的產(chǎn)生和積累是導(dǎo)致種子老化的主要原因；在種子貯藏過程中，ROS的積累會導(dǎo)致脂類、DNA和蛋白質(zhì)的氧化損傷，從而導(dǎo)致種子萌發(fā)能力降低，活力喪失［21］。本試驗(yàn)中隨著老化時間的延長，種子中H2O2逐漸積累，MDA含量和相對電導(dǎo)率不斷增加，這與前人對玉米的研究結(jié)果一致［22-24］，說明老化導(dǎo)致ROS積累，引發(fā)了膜脂過氧化，細(xì)胞膜透性增加。SOD、APX是植物體內(nèi)ROS的清除劑，可以使細(xì)胞內(nèi)的ROS維持在正常水平，防止氧化損傷。本試驗(yàn)中SOD、APX活性均逐漸降低，這與鮮萱等［25］的研究結(jié)果一致，說明老化導(dǎo)致種子的抗氧化能力下降。而在氬氣貯藏條件下，與空氣對照相比，相對電導(dǎo)率、MDA和H2O2含量增加緩慢，SOD、APX活性降低也緩慢，說明氬氣貯藏延緩了種子裂變的速度。這可能是由于氬氣降低了脂質(zhì)的氧化程度，減少了ROS的產(chǎn)生和積累，同時又通過維持較高的抗氧化酶活性，不斷清除ROS，避免ROS過量積累，從而降低其對細(xì)胞的氧化損傷，延緩種子的老化進(jìn)程。

綜上所述，相較于空氣貯藏，氬氣貯藏能夠減緩玉米種子各萌發(fā)指標(biāo)的降低速度，降低種子的相對電導(dǎo)率及MDA和H2O2含量，提高SOD、APX活性，在一定程度上延緩了玉米種子的老化進(jìn)程。