饒鐘鳴，馬慧，關(guān)耀武

作者單位：駐馬店市中心醫(yī)院胸外科，河南 駐馬店463000

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，而非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占其75%～80%[1-2]，因此，闡明肺癌發(fā)病的分子機(jī)制對于肺癌的治療具有重要意義。

據(jù)報(bào)道，多種基因改變與肺癌發(fā)生和腫瘤進(jìn)展有關(guān)，一些致癌基因如HER2、EGFR等被過表達(dá)[3-6]。相反，許多腫瘤抑制基因如P53等被滅活或下調(diào)[7-8]。

MEG2是蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）家族的成員[9]。PTPs在細(xì)胞酪氨酸磷酸化水平調(diào)節(jié)和多種生理過程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。最近的研究報(bào)道，MEG2能夠通過促進(jìn)EGFR和ErbB2的去磷酸化，從而抑制STAT3的激活，是乳腺癌的負(fù)調(diào)控因子。另外，MEG2在胃癌中也作為抑癌基因發(fā)揮功能，提示在惡性腫瘤中，MEG2可能充當(dāng)著病理因子的角色[10-12]。雖然部分報(bào)道發(fā)現(xiàn)MEG2在肺癌中低表達(dá)[13]，但是對于MEG2在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中異常低表達(dá)及作用機(jī)制尚不完全清楚。

miRNAs是大小為20～22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，它通過與靶mRNAs 3′-UTR結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制，從而沉默靶基因的表達(dá)[14]。研究表明miRNAs參與各種細(xì)胞過程的調(diào)控，包括細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡、發(fā)育以及代謝[14-15]。

本研究于2015年6月至2018年6月間在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)上探究了miR-21作為腫瘤抑制因子是否可通過靶向MEG2從而影響肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡及其中分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和人體組織 人肺癌細(xì)胞系，A549和H1975，均來自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用10%胎牛血清的DMEM（Gibco，Carlsbad，CA，USA）培養(yǎng)基，在含5%二氧化碳的加濕空氣中37℃培養(yǎng)。肺癌和癌旁組織從駐馬店市中心醫(yī)院病人的外科手術(shù)中獲取，并同每個(gè)捐贈者都簽署了一份簽名同意的表格。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。7例肺癌病人的臨床信息分別如下：①男，64歲，ⅡA型；②女，60歲，ⅠB型；③男，47歲，ⅡA型；④男，49歲，ⅡB型；⑤女，41歲，ⅠB型；⑥男，39歲，ⅢA型；⑦男，54歲，ⅢB型。

1.2 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和TaqMan實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）均按照生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行操作，如前所述。為了定量MEG2的mRNA，1 μL的總RNA用oligo dT和Thermoscript（TaKaRa）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件如下：42℃，60 min，85℃，5 min。SYBER Green染料（Invitrogen）、MEG2和GAPDH的特異引物用于qRTPCR。引物的序列如下：MEG2正向引物為5′-CCTGCCTTAGACTGGGACT-3′，MEG2 反向引物為 5′-TTCGCTTTGTTAGCTTCACT-3′。

GAPDH正向引物為5′-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3′，GAPDH反向引物為5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。MEG2 mRNA的相對定量以GAPDH基因進(jìn)行歸一化處理。

1.3 miRNA的過表達(dá)或敲降 合成的RNA分子，包括前體miR-21、反義miR-21和無義對照RNA（miR前體對照和反義對照）購買于GenePharma（上海）。細(xì)胞接種在6孔板中，將細(xì)胞分為四組，24 h后細(xì)胞密度在70%時(shí)分別用Lipofectamine 2000（Invitrogen）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔中前體miR-21、反義miR-21和無義對照RNA的用量均為100 pmol。24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)。

1.4 質(zhì)粒的構(gòu)建和siRNA干擾分析 MEG2過表達(dá)質(zhì)粒（pReceiver-M02-MEG2）購買于GeneCopoeia（Germantown，MD，USA），空載質(zhì)粒作為對照。2種靶 向 人 MEG2 基 因 的 siRNAs（siRNA-1：5′-ACAGUUUCAUAGAGCCAUGAAGUAU-3'；siRNA-2：5′-ACUUUGCUGUAACCCUGUA-3′）購買于 GenePharma，無義的 siRNA（GenePharma）作為對照?？俁NA或蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)染后24 h或48 h提取。MEG2蛋白表達(dá)水平用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測。

1.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證miR-21與MEG2的直接結(jié)合，我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。由GenePharma直接合成MEG2的正常和突變的3′-UTR序列，然后插入PGL3質(zhì)粒（Ambion）。293 T細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)，每孔均用Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染了β-半乳糖苷酶（β-gal）表達(dá)質(zhì)粒（Ambion）和0.2 μg的螢火蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，以及等量的前體miR-21和無義對照RNA，其中β-半乳糖苷酶質(zhì)粒用作對照。24 h后，這些細(xì)胞通過熒光素酶分析試劑盒（Promega，Madison，WI，USA）進(jìn)行分析。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)水平通過蛋白質(zhì)印跡法檢測，并且用GAPDH抗體進(jìn)行歸一化處理。所用抗體如下：MEG2抗體（Abcam ab32441，Cambridge，MA，USA）和GAPDH抗體（sc-365062；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）。運(yùn)用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將A549細(xì)胞以1×104的密度接種在96孔板中，并在12 h后轉(zhuǎn)染。經(jīng)轉(zhuǎn)染后，每孔加入10 μLCCK-8試劑盒中的WST-8溶液（Beyotime，China）。孵育2 h，分別在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0 h，12 h和60 h）讀取在450 nm下的吸光度值。計(jì)算出的相對細(xì)胞數(shù)值即為60 h和12 h的吸光度之比。

1.8 細(xì)胞侵襲和凋亡分析實(shí)驗(yàn) A549細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)和凋亡分析分別用Transwell Boyden Chamber（6.5 mm，Costar，Corning，NY，USA）和 Annexin VFITC/PI staining試劑盒（BD Biosciences，San Diego，CA，USA）進(jìn)行測試?？偟蛲黾?xì)胞是早期凋亡（PI-AV+）和晚期凋亡（PI+AV+）細(xì)胞的總和。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有的蛋白質(zhì)印跡圖都代表了三次以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。qRT-PCR、熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖和凋亡分析也均為重復(fù)3次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所有結(jié)果均以表示，兩組之間的檢驗(yàn)方法為Student's t-test，兩組以上的檢驗(yàn)方法為one-way ANOVA，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織中蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2蛋白和mRNA水平變化不一致 首先，我們檢測了7對人肺癌組織的MEG2蛋白水平（圖1A）。我們發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中MEG2蛋白水平均被下調(diào)（變化倍數(shù)依次為：0.19，0.83，0.21，0.05，0.42，0.37，0.09），隨后，我們用qRT-PCR檢測同樣的7對癌和癌旁組織的MEG2 mRNA水平。結(jié)果顯示MEG2 mRNA水平在癌和癌旁組織之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（變化倍數(shù)依次為：0.95，1.02，0.98，0.96，0.99，0.93，0.98）。在肺癌組織中，MEG2蛋白和mRNA水平之間的這種差異，提示了MEG2的調(diào)節(jié)機(jī)制存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

2.2 蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡 MEG2在肺癌組織中的異常表達(dá)提示MEG2可能發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，可能參與肺癌細(xì)胞增殖、凋亡或其他生理過程。因此，我們主要研究了MEG2對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。首先，我們分別在A549細(xì)胞中改變MEG2的表達(dá)水平檢測MEG2在肺癌細(xì)胞生長中的作用。通過構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA分別過表達(dá)或抑制MEG2，功能實(shí)驗(yàn)檢測顯示過表達(dá)MEG2能抑制肺癌細(xì)胞的增殖速率（P＜0.001），促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡（細(xì)胞凋亡率：對照組5.16，質(zhì)粒組17.82，P＝0.000），而轉(zhuǎn)染了MEG2 siRNA的肺癌細(xì)胞增殖速率加快（P＝0.000），凋亡減少（細(xì)胞凋亡率：對照組5.88，質(zhì)粒組3.28，P＝0.000），見圖1B～E。綜上結(jié)果證明，MEG2能夠影響肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

2.3 miR?21作為靶向蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2的預(yù)測microRNA miRNA抑制mRNA的翻譯是一種常見的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式。為了確定哪些miRNAs可以在肺癌細(xì)胞中靶向MEG2，我們運(yùn)用了三種算法，TargetScan，miRanda和PicTar進(jìn)行預(yù)測分析。在候選的miRNAs中，miR-21是一種在肺癌中普遍被上調(diào)的促癌因子[16-17]。

2.4 肺癌組織中miR?21和蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2水平呈負(fù)相關(guān) 依據(jù)miRNAs與其目標(biāo)基因的負(fù)相關(guān)表達(dá)模式，我們接著研究了miR-21在臨床病人組織中是否與MEG2水平呈負(fù)相關(guān)。在檢測了7對肺癌組織和癌旁組織中的miR-21水平后，發(fā)現(xiàn)miR-21在肺癌組織中顯著升高（值：LN組為0.96 0.33 0.23 0.18 0.06 0.11 0.08；LC組為2.86 1.32 0.96 0.85 0.94 0.54 0.62；P＝0.000）?；谏镄畔W(xué)預(yù)測和人肺癌組織中miR-21和MEG2水平呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果，提示了MEG2是miR-21的潛在靶基因。

2.5 驗(yàn)證蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2是miR?21的直接靶基因 通過對人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1975中miR-21的過表達(dá)或敲降，進(jìn)一步證實(shí)miR-21和MEG2的直接相關(guān)性。如預(yù)期一樣，A549細(xì)胞和H1975細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21 mimic后，miR-21的水平顯著提高，轉(zhuǎn)染反義miR-21后miR-21水平急劇下降。對應(yīng)的，在兩種細(xì)胞中，miR-21的過表達(dá)顯著抑制了MEG2蛋白的表達(dá)（變化倍數(shù)：A549 0.26；H1975 0.18），促進(jìn)Vimentin表達(dá)（變化倍數(shù)：A549 2.04；H1975 3.22）；而miR-21的下調(diào)顯著增加了肺癌細(xì)胞中的MEG2蛋白水平（變化倍數(shù)：A549 2.48；H1975 2.18）并抑制Vimentin表達(dá)（變化倍數(shù)：A549 0.16；H1975 0.08），見圖2。

圖1 肺癌組織中MEG2蛋白和mRNA表達(dá)水平及MEG2對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響：A為7對肺癌和癌旁組織MEG2的蛋白質(zhì)印跡法代表圖，B為在A549中過表達(dá)MEG2抑制細(xì)胞增殖（P＝0.001），C為在A549中過表達(dá)MEG2促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P＝0.000），D為在A549中敲降MEG2能促進(jìn)細(xì)胞增殖（P＝0.001），E為在A549中敲降MEG2能抑制細(xì)胞凋亡（P＝0.000）

圖2 miR-21直接轉(zhuǎn)錄后調(diào)控MEG2的表達(dá)：A為MEG2 3′UTR和miR-21形成雙鏈的結(jié)合位點(diǎn)；B為A549細(xì)胞和H1975細(xì)胞轉(zhuǎn)染了等量miR-21 mimics，反義miR-21（anti-miR-21）或無義對照RNA后蛋白質(zhì)印跡法分析

為了證明miR-21對MEG2表達(dá)的負(fù)調(diào)控是通過miR-21與MEG2 mRNA 3′UTR預(yù)測位點(diǎn)的直接結(jié)合，我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。在報(bào)告質(zhì)粒中，我們把含有miR-21預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)的全長3′UTR序列放置在螢火蟲熒光素酶基因的下游。然后將重組質(zhì)粒和miR-21 mimics共同轉(zhuǎn)染進(jìn)A549細(xì)胞。如預(yù)期一樣，熒光素酶活性在共轉(zhuǎn)入熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和miR-21 mimics的細(xì)胞中顯著減少（過表達(dá)：0.26，P＝0.001；抑制：2.82，P＝0.036）。然后我們引入點(diǎn)突變，以消除miR-21與MEG2 3'UTR預(yù)測位點(diǎn)的結(jié)合。突變后的熒光素酶活性無論是在miR-21過表達(dá)還是敲降后均不受其影響。這一結(jié)果表明，該結(jié)合位點(diǎn)對miR-21和MEG2 mRNA之間的結(jié)合有著強(qiáng)烈的影響。綜上所述，該結(jié)果證實(shí)了miR-21直接識別并結(jié)合到MEG2轉(zhuǎn)錄本的3'UTR區(qū)域進(jìn)而抑制MEG2的翻譯。

2.6 肺癌細(xì)胞中miR?21對蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2的調(diào)控作用 我們進(jìn)一步分析了miR-21通過抑制MEG2表達(dá)對肺癌細(xì)胞功能的影響。鑒于MEG2已報(bào)道能抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)凋亡[18]，我們猜測miR-21可能通過抑制MEG2表達(dá)，繼而影響細(xì)胞的增殖和凋亡。如預(yù)期，A549細(xì)胞中miR-21過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞增殖（P＝0.020）并抑制了細(xì)胞凋亡（細(xì)胞凋亡率：對照5.68，miR-21過表達(dá)3.28；P＝0.000）；而抑制miR-21對肺癌細(xì)胞增殖（P＝0.004）和凋亡有相反的影響（細(xì)胞凋亡率：對照4.36，miR-21抑制13.08；P＝0.000）。接著我們在A549細(xì)胞中進(jìn)行了回復(fù)實(shí)驗(yàn)，蛋白分析結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-21能夠減弱MEG2過表達(dá)質(zhì)粒對MEG2的上調(diào)作用。更為重要的是，增殖和細(xì)胞凋亡分析顯示，miR-21抵抗的MEG2過表達(dá)顯著降低了miR-21對細(xì)胞增殖的促進(jìn)（P＝0.003）作用和對凋亡的抑制作用（細(xì)胞凋亡率：對照5.21，miR-21過表達(dá)3.66，MEG2過表達(dá)11.88，miR-21+MEG2過表達(dá)4.02；P＝0.002）。綜上所述，MEG2對肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡至關(guān)重要，而miR-21可能通過沉默MEG2進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡。見圖3。

圖3 miR-21和MEG2對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響：A為A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染了等量的miR-21 mimics或無義對照RNA、等量的反義miR-21或無義對照RNA后的24 h，分別進(jìn)行了細(xì)胞凋亡檢測（P＝0.000，P＝0.000）；B為 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染了等量的前體對照、miR-21 mimics、MEG2過表達(dá)質(zhì)?；騧iR-21 mimics和MEG2過表達(dá)質(zhì)粒48 h，蛋白質(zhì)印跡法分析MEG2蛋白表達(dá)變化；C為A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染了等量的前體對照、miR-21 mimics、MEG2過表達(dá)質(zhì)?；騧iR-21 mimics和MEG2過表達(dá)質(zhì)粒后檢測細(xì)胞的凋亡水平變化（P＝0.002）

2.7 信號轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子3在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)miR?21的表達(dá) 我們進(jìn)一步探究了miR-21在肺癌細(xì)胞中異常上調(diào)的分子機(jī)制，通過檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子STAT3可直接與miR-21啟動子區(qū)結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)miR-21的表達(dá)，為了在肺癌中驗(yàn)證這一現(xiàn)象，我們在A549細(xì)胞中分別用過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA上調(diào)和下調(diào)STAT3蛋白，然后檢測miR-21的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)STAT3可顯著促進(jìn)miR-21表達(dá)（變化倍數(shù)：3.79；P＝0.000），而下調(diào)STAT3則顯著抑制miR-21表達(dá)（變化倍數(shù)：0.42；P＝0.000），說明在肺癌細(xì)胞中STAT3同樣可直接促進(jìn)miR-21的表達(dá)。

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，NSCLC約占所有原發(fā)性肺癌的75%～80%[1-2]。新療法的療效目前仍然受到藥物耐藥性以及對腫瘤細(xì)胞信號通路缺乏了解的限制。許多基因，如癌癥抑制因子（抑癌基因）和癌癥誘導(dǎo)因子（致癌基因）影響著肺癌的發(fā)生。蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein Tyrosine Phosphatases，PTPs）是細(xì)胞功能的重要調(diào)控因子，PTPs失調(diào)是人類癌癥的主要原因之一[19-20]。蛋白酪氨酸磷酸酶MEG2（MEG2）是屬于PTP組的細(xì)胞質(zhì)磷酸酶[21-22]。MEG2可以抑制STAT3（信號轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子3）和ErbB家族[包括EGFR（表皮生長因子受體）和ErbB2]的去磷酸化，從而抑制受體酪氨酸激酶（RTK）的激活[10-11]。MEG2蛋白在乳腺癌、前列腺癌、胃癌和肝癌中表達(dá)減少[10，23-24]。然而，在肺癌的發(fā)展過程中，MEG2的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制尚未見報(bào)道。

本研究中我們觀察到過表達(dá)MEG2能抑制肺癌細(xì)胞的增殖以及促進(jìn)凋亡，而siRNA去沉默MEG2的表達(dá)則導(dǎo)致相反的效果，這提示MEG2蛋白在肺癌的發(fā)展過程中扮演著重要的抑癌基因的角色。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)了人肺癌組織中MEG2蛋白和mRNA水平之間的不一致趨勢。這表明了調(diào)節(jié)MEG2表達(dá)的機(jī)制中存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。這種調(diào)控方式的一個(gè)重要模式是通過miRNAs抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄。因此，我們預(yù)測了靶向MEG2的miRNAs，并將miR-21作為候選對象。機(jī)制研究表明，miR-21可以直接結(jié)合MEG2的3'UTR，并抑制其在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)miR-21抑制MEG2表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，且轉(zhuǎn)錄因子STAT3可在肺癌中上調(diào)miR-21的表達(dá)。上述結(jié)果闡明了一條新的調(diào)控軸，即STAT3-miR-21通過靶向MEG2調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

在過去數(shù)十年中，miRNAs在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著一個(gè)重要的角色[15]。在目前的研究中，我們觀察到，與鄰近的癌旁組織相比，肺癌組織的miR-21水平更高。這表明，miR-21可能會作為腫瘤促進(jìn)因子影響腫瘤發(fā)生。事實(shí)上，miR-21在多種癌癥中都被上調(diào)，包括胃癌、乳腺癌和前列腺癌[25-27]。此外，miR-21通過對增殖、轉(zhuǎn)移、上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)換以及細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)，在癌癥中發(fā)揮促腫瘤的作用[28-30]。圖7中，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-21促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，體內(nèi)外的miR-21功能與沉默MEG2表達(dá)的效果類似。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)MEG2的表達(dá)減弱了miR-21對肺癌細(xì)胞的促增殖和抗凋亡的作用。盡管miR-21靶向多個(gè)目標(biāo)，但上述結(jié)果表明其對MEG2的靶向調(diào)節(jié)是一種在肺癌中促進(jìn)腫瘤的主要機(jī)制。

綜上，本研究描述了一種新的調(diào)控軸，即miR-21作為促癌因子，在肺癌發(fā)生時(shí)抑制MEG2的表達(dá)。此研究可能為肺癌治療開辟新的視野。