路保賽 國平英 劉凱隆 尹躍偉 張艷平 齊進(jìn)春 賈江華 馮騰飛 梁壯 黎瑋

機(jī)體在物理、化學(xué)損傷或病原體感染等病理狀態(tài)下，可發(fā)生系統(tǒng)性炎癥，附睪特殊的免疫微環(huán)境平衡被破壞，導(dǎo)致附睪炎和男性不孕不育等并發(fā)癥[1]。因此，深入研究和探討附睪功能損傷的因素和分子機(jī)制，有助于為附睪炎提供治療及預(yù)防的手段。在眾多睪丸炎的誘發(fā)因素中，炎癥十分重要[2]。研究表明，造成附睪功能損傷的可能機(jī)制是病原微生物感染進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量炎癥因子，從而影響附睪正常的生理功能[2-3]。Ge等[3]報道了脂多糖（LPS）誘發(fā)的小鼠附睪炎模型中，炎癥反應(yīng)明顯，各類炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6、干擾素-γ（IFN-γ）、IL-10、一氧化氮合酶2（NOS2）等mRNA表達(dá)水平明顯升高。同時有學(xué)者提出，LPS能明顯下調(diào)附睪特異蛋白Bin1b的表達(dá)，進(jìn)一步影響精子活力[4]。本研究團(tuán)隊體外實驗發(fā)現(xiàn)，LPS可以誘導(dǎo)附睪上皮細(xì)胞中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá)（待發(fā)表）；但在附睪炎中發(fā)揮作用的細(xì)胞因子是否會造成附睪功能損傷以及誘發(fā)附睪炎的相關(guān)信號通路及分子機(jī)制尚未闡明。因此，本研究通過建立LPS刺激誘導(dǎo)小鼠附睪炎模型，探討LPS引起小鼠附睪炎的機(jī)制，尋找誘導(dǎo)附睪損傷的重要細(xì)胞因子，為臨床治療提供新的思路和靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 8～12周、體重（30±5）g的雄性昆明小鼠，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。每天光照、黑暗各12h規(guī)律交替飼養(yǎng)，室溫（25±5）℃，濕度 30%～50%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。期間小鼠正常攝食飲水，每天觀察小鼠毛色、狀態(tài)等。

1.2 主要試劑及儀器 LPS（L2630-100 MG）購自Sigma-Aldrich公司，小鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（KE-10003-96 assays）購自 Proteintech公司，小鼠睪酮ELISA試劑（RNH94007-5 Kits）購自Demedtec公司，兔抗小鼠β-actin單克隆抗體（ab179467，100μl）購自Abcam 公司，兔抗小鼠核因子-κB（NF-κB）p65 單克隆抗體（ab2072977，100μg）購自Abcam 公司，山羊抗兔 HRP-IgG（SA00001-15，200μl）購自 Proteintech 公司，JSH-23（HY-13982，10mg）購自MCE 公司。ECL 顯影液（WBULS0500，500ml）購自 Millipore 公司，10×RIPA 裂解液（ab156034，15ml） 購自Abcam公司，引物由上海生工公司合成，SYBG Green PCR master Mix（12351080-100 reactions）購自 Invitrogen 有限公司，TrizolTMReagent（R6830-02，100ml）購自O(shè)MGA公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（10928042-100 reactions）購自Invitrogen有限公司。

1.3 動物分組及處理 將40只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成3組：LPS組30只，磷酸鹽緩沖液（PBS）組5只，LPS+JSH-23組5只。小鼠用10%水合氯醛注射麻醉后固定四肢及尾巴，局部消毒。（1）LPS組：按3mg/kg劑量稱取LPS并溶解于PBS；將小鼠左側(cè)睪丸輕輕拉出注射200μl LPS注射液后送回原位，縫合腹部。（2）PBS組：將小鼠左側(cè)睪丸輕輕拉出注射200μl PBS后送回原位，縫合腹部。（3）LPS+JSH-23組：按3mg/kg劑量稱取LPS并溶解于PBS，按3mg/kg劑量稱取JSH-23（依據(jù)文獻(xiàn)[5]）并溶解于二甲基亞砜；將小鼠左側(cè)睪丸輕輕拉出注射100μl LPS注射液+100μl JSH-23注射液后送回原位，縫合腹部。LPS 組小鼠于造模 0、6、12、24、48h及3周，PBS組、LPS+JSH-23組分別于造模3周采用頸椎脫臼法處死，收集血清及附睪（0.9%氯化鈉溶液沖洗3遍）。

1.4 血清及附睪組織IL-1β濃度檢測 采用ELISA法。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管收集血液，室溫凝血30min，1 000g離心10min，分離血清至另一新管中，-20℃保存?zhèn)溆?。附睪組織用液氮迅速冷卻研磨粉碎，超聲勻漿，600g離心5min，取上清液進(jìn)行檢測。從冰箱中取出IL-1β檢測試劑盒恢復(fù)至室溫；分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白對照孔和待測樣本孔，每孔加入待測的血清100μl或附睪組織研磨上清液 100μl（含附睪組織50mg），37℃孵育1.5h；0.01M PBS洗板3 次，每孔加入生物素標(biāo)記的抗鼠IL-1β抗體工作液100μl，37℃孵育60min；0.01M PBS洗板3次，每孔加入ABC工作液100μl，37℃孵育30min；0.01M PBS洗板5次，每孔加入TMB顯色劑 90μl，37℃避光孵育30min；最后，每孔加入終止液100μl，終止反應(yīng)后以空白孔調(diào)零，并15min內(nèi)用450nm波長測量各孔吸光度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用待測樣本的OD值計算對應(yīng)的樣品濃度。

1.5 附睪組織IL-1β mRNA表達(dá)水平檢測 采用熒光定量PCR（qRT-PCR）法。取100mg附睪組織，加入Trizol試劑及氯仿提取總RNA，使用Nanodrop核酸定量儀檢測提取RNA的濃度和純度。按照Invitrogen qRT-PCR的M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以18S為內(nèi)參在ABI7500 Fast Realtime PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，以檢測各組附睪組織中IL-1β mRNA的表達(dá)水平。擴(kuò)增引物由上海生工公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：50℃預(yù)處理2min，循環(huán) 1次；95℃預(yù)變性 10min，循環(huán) 1次；95℃變性15s，循環(huán) 40 次；60℃退火 30s，循環(huán) 40 次；72℃延伸30s，循環(huán)40次。各組均設(shè)3個復(fù)孔。以2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.6 附睪組織精子常規(guī)參數(shù)檢測 取造模3周小鼠右側(cè)整個附睪組織，置于1ml PBS中剪碎，37℃孵育5min，混勻后用精液分析系統(tǒng)分析精子常規(guī)參數(shù)，包括精子總數(shù)、活動精子百分比、前向運動精子百分比、非前向運動精子百分比、不活動精子百分比。

1.7 附睪組織NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測 采用免疫印跡試驗（western blot）法。取附睪組織，加入RIPA細(xì)胞裂解液充分研磨，離心收集上清液提取細(xì)胞蛋白。BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度。各孔取15μg蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離（濃縮膠90V電壓，30min；分離膠120V電壓，90min）。將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移（200mA電流，35min）至PVDF膜。加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉2h。分別加入兔抗鼠NF-κB p65和β-actin單克隆抗體（體積稀釋比例均為1:1 000）4℃反應(yīng)過夜。次日先以TBST洗膜5次，10min/次。加入HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG（體積稀釋比例為1:20 000），室溫反應(yīng)1h。再用TBST洗膜5次，10min/次。按ECL試劑盒說明進(jìn)行顯影。采用LK5100電化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.8 血清睪酮濃度的檢測 采用ELISA法。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管收集血液，室溫凝血30min，1 000g離心10min，分離血清至另一新管中，-20℃保存?zhèn)溆?。取出睪酮檢測試劑盒，室溫平衡30min。取出酶標(biāo)板，加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品和待測血清各50μl，空白對照加入50μl ddH2O。每個樣品重復(fù)檢測3次。加入生物素化抗體工作液50μl/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育120min。洗板5次，加入洗滌液350μl/孔，甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。加入酶結(jié)合物工作液100μl/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育30min。洗板5次，方法同前述。加入顯色劑100μl/孔，避光、室溫孵育10～20min。加入終止液100μl/孔，酶標(biāo)儀檢測OD450值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用待測樣本的OD值計算對應(yīng)樣品濃度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；組內(nèi)不同時點比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模期間LPS小鼠血清、附睪IL-1β濃度及mRNA表達(dá)水平變化 與0h比較，LPS組小鼠6、12、24h血清及附睪IL-1β濃度明顯升高，且呈時間依賴性（P＜0.05）；至48h開始降低（P＜0.05），見表2和圖1a-b。附睪組織IL-1β mRNA表達(dá)水平變化，與血清及附睪IL-1β濃度變化一致，見表2和圖1c。提示LPS可以誘導(dǎo)附睪組織炎性反應(yīng)。

表2 造模期間LPS小鼠血清、附睪IL-1β濃度及mRNA表達(dá)水平變化（n=5）

2.2 造模3周后LPS組與PBS組小鼠附睪精子常規(guī)參數(shù)比較 造模3周后，LPS組精子總數(shù)、活動精子百分比、前向運動精子百分比、非前向運動精子百分比較PBS組均明顯降低，不活動精子百分比高于PBS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

圖1 造模期間LPS小鼠血清、附睪IL-1β濃度及mRNA表達(dá)水平變化（與0h比較，*P＜0.05，n=5）

表3 造模3周后LPS組與PBS組小鼠附睪精子常規(guī)參數(shù)比較

2.3 造模3周后PBS組、LPS組與LPS+JSH-23組小鼠附睪組織NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 與PBS組（1.02±0.03）比較，LPS組小鼠附睪組織NF-κBp65蛋白表達(dá)（1.61±0.08）明顯上調(diào)（P＜0.05），LPS+JSH-23 組（0.64±0.07）明顯下調(diào)（P＜0.05），見圖 2。

圖2 3組小鼠附睪組織NF-κB p65蛋白表達(dá)的電泳圖（n=5）

2.4 造模3周后PBS組、LPS組與LPS+JSH-23組小鼠血清、附睪IL-1β濃度及mRNA表達(dá)水平比較 與PBS組比較，LPS組小鼠血清、附睪IL-1β濃度及附睪組織mRNA表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05），LPS+JSH-23組較LPS組明顯降低（均P＜0.05），見表4和圖3。

表4 造模3周后PBS組、LPS組與LPS+JSH-23組小鼠血清、附睪IL-1β濃度及mRNA表達(dá)水平比較

2.5 造模3周后PBS組、LPS組與LPS+JSH-23組小鼠血清睪酮濃度比較 LPS組小鼠血清睪酮濃度為（0.22±0.06）ng/ml，較 PBS 組（1.76±0.33）ng/ml明顯降低（P＜0.05）；LPS+JSH-23組小鼠血清睪酮濃度為（0.70±0.15）ng/ml，較 LPS 組明顯升高（P＜0.05）。

3 討論

附睪具有特殊的免疫保護(hù)屏障，可以防御病原微生物的感染，是精子成熟的主要場所。機(jī)體受到某些微生物的感染后，會破壞附睪的免疫保護(hù)屏障，引起其功能障礙，最終導(dǎo)致男性不育[6-7]。然而，干擾附睪功能的主要細(xì)胞因子及分子機(jī)制尚未明確。因此，本文針對細(xì)胞因子IL-1β在LPS誘導(dǎo)小鼠附睪炎中的作用作一探討。

有文獻(xiàn)報道睪丸內(nèi)注射LPS，短時間內(nèi)可以抑制小鼠睪丸雄激素合成，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡[8]。該研究表明，LPS處理12～24h可以誘導(dǎo)小鼠睪丸功能障礙，但48h后睪丸功能逐漸恢復(fù)。因此，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立長時間LPS誘導(dǎo)模型，觀察睪丸內(nèi)注射LPS1～3周對小鼠附睪功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS注射 3周后小鼠精子總數(shù)、活動精子百分比、前向運動精子百分比和非前向運動精子百分比均明顯低于PBS組，而不活動精子百分比明顯高于PBS組，這說明長時間LPS注射可導(dǎo)致附睪功能損傷。臨床研究發(fā)現(xiàn)，無精癥患者的炎癥因子水平明顯增高[9-10]。另有文獻(xiàn)報道，LPS可以誘導(dǎo)IL-6、IL-1β和TNF-α等多種炎癥因子的表達(dá)，而這些炎癥因子可以抑制激素的合成[11-12]，進(jìn)一步提示炎癥因子可能參與了附睪功能的損傷。研究表明，IL-6和IL-1β可以通過抑制激素合成酶的表達(dá)從而抑制睪酮產(chǎn)生[13-14]，但是IL-1β在附睪炎中的作用及相關(guān)機(jī)制尚未報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射LPS后小鼠附睪及血清IL-1β濃度及附睪組織mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。由于NF-κB是炎性反應(yīng)的經(jīng)典信號通路，NF-κB p65表達(dá)水平可以代表NF-κB通路的活化水平[15]，故本研究同時檢測了小鼠附睪組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS組附睪組織NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，誘導(dǎo)NF-κB信號通路的活化，提示睪丸內(nèi)注射LPS可以顯著誘導(dǎo)附睪組織的炎性反應(yīng)。為了進(jìn)一步明確NF-κB p65在LPS誘導(dǎo)的附睪炎性反應(yīng)中的作用，筆者進(jìn)一步觀察了LPS與NF-κB抑制劑JSH-23同時注射小鼠附睪后炎性因子IL-1β的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-1β的表達(dá)依賴于NF-κB p65的活化，提示NF-κB抑制劑可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠附睪炎性因子IL-1β的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制小鼠附睪的炎性反應(yīng)。但在LPS誘導(dǎo)的附睪炎中，小鼠精子參數(shù)及血清睪酮濃度的改變是否依賴于NF-κB/IL-1β的活化，有待進(jìn)一步明確。

圖3 造模3周后PBS組、LPS組與LPS+JSH-23組小鼠血清、附睪IL-1β濃度及mRNA表達(dá)水平比較（與PBS組比較，*P＜0.05；與 LPS 組比較，△P＜0.05；n=5）

綜上所述，LPS能顯著誘導(dǎo)小鼠附睪炎中IL-1β表達(dá)，而NF-κB抑制劑能有效抑制LPS誘導(dǎo)小鼠附睪炎中炎癥因子IL-1β的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制小鼠附睪的炎性反應(yīng)。NF-κB/IL-1β軸的調(diào)控可能作為臨床治療附睪炎的手段。