韓文素，袁忠華，高景林，趙冬香*，王釋婕，趙 珊，鐘義海

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?571101；2. 海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228；3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜂業(yè)技術(shù)研究中心，?？?571101)

設(shè)施甜瓜是海南等地的支柱產(chǎn)業(yè)，為農(nóng)民帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)收入。但由于設(shè)施棚室內(nèi)高溫、密閉的小氣候環(huán)境，授粉媒介昆蟲較少，嚴(yán)重影響了甜瓜的坐果。農(nóng)戶常常使用激素類藥物輔助授粉，不僅費時費力，還存在激素污染等安全隱患。采用蜜蜂授粉提質(zhì)增效，受到了廣大農(nóng)戶的歡迎。但由于海南氣候濕潤，蟲害發(fā)生嚴(yán)重。蚜蟲、薊馬、粉虱、螨、瓜絹螟、根結(jié)線蟲等嚴(yán)重危害甜瓜的生長(楊小鋒等，2007)。據(jù)調(diào)查，生產(chǎn)上對這些害蟲的防治主要依靠化學(xué)防治，其中新煙堿類殺蟲劑及其混配制劑是當(dāng)前普遍使用的藥劑。然而，這類殺蟲劑在防治害蟲的同時，也會對授粉蜜蜂的生存和健康造成一定的影響。新煙堿類殺蟲劑屬于煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptor, nAChRs)抑制劑，具有內(nèi)吸性，經(jīng)植物的韌皮部和木質(zhì)部運輸，可到達(dá)植物的花粉、花蜜以及吐水液中(Jeschkeetal., 2011)，從而對采集蜂以及取食采集蜂采集的花粉、花蜜的幼蜂存在潛在的威脅。

噻蟲嗪屬于第二代新煙堿類農(nóng)藥，較第一代新煙堿類農(nóng)藥更廣譜、高效、低毒，其與昆蟲乙酰膽堿受體結(jié)合力差，但在昆蟲體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為噻蟲胺，因此被作為高效殺蟲劑推廣(Maienfischetal., 2001)。但大量研究表明噻蟲嗪對意大利蜜蜂Apismelliferaligustica高毒(蒼濤等，2017)，甚至劇毒(裴暉等，2013)。亞致死劑量噻蟲嗪能削弱意大利蜜蜂的歸巢能力，從而降低其覓食成功率和存活率(Henryetal., 2012)。歐盟要求2018年 4月27日后禁止戶外施用吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪(https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=OJ ∶L ∶2018 ∶132 ∶TOC)。但我國還沒有出臺類似法律法規(guī)。當(dāng)前我國農(nóng)藥登記品種中混配制劑占比約34%，相比單劑產(chǎn)品，農(nóng)藥混配制劑的環(huán)境風(fēng)險評估更為復(fù)雜(陳朗等，2017)。

目前關(guān)于殺蟲劑對蜜蜂毒性的風(fēng)險評價主要基于室內(nèi)蜜蜂攝入含藥劑的糖漿以及點滴藥劑到蜜蜂背板上的生物測定，鮮有模擬蜜蜂在田間暴露方式下的毒性測定與評價。且大多數(shù)的急性毒性測定都集中在意大利蜜蜂，而中華蜜蜂Apisceranacerana相對研究較少。中華蜜蜂是我國特有的蜜蜂種質(zhì)資源，具有抗寒耐熱和善于采集零星蜜源的特性(Chenetal., 2017)，是我國設(shè)施農(nóng)業(yè)中的優(yōu)良授粉蜂種，在植物授粉、養(yǎng)蜂生產(chǎn)及保護(hù)物種多樣性方面起著重要的作用。蜜蜂授粉是提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和農(nóng)民增收的一項有效措施(祁海萍等，2018)，但蜜蜂授粉如何與農(nóng)藥協(xié)調(diào)發(fā)展是當(dāng)前急需解決的任務(wù)。因此，為明確噻蟲嗪及其混配制劑對中華蜜蜂的毒性效應(yīng)，本文在實驗室條件下模擬中華蜜蜂暴露農(nóng)藥的3種方式(蜂體接觸、取食接觸、植株接觸)，研究噻蟲嗪及其混配制劑對采集蜂存活率的影響，評估這些農(nóng)藥對中華蜜蜂的風(fēng)險性，旨在為我國設(shè)施作物蜜蜂授粉實踐中保障蜜蜂的安全有效提供重要的技術(shù)指導(dǎo)，為減肥減藥提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蜜蜂：試驗所用中華蜜蜂采集蜂，來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜂業(yè)技術(shù)研究中心試驗蜂場(N19°32′，E109°32′)。供試蜜蜂在試驗當(dāng)天清晨收集，要求為健康良好、齡期相同、飼喂?fàn)顩r一致的個體。

供試藥劑：噻蟲嗪及其混配制劑，每種藥劑均用蒸餾水稀釋為田間最大推薦劑量后進(jìn)行噴灑(表1)。

表1 試驗所用殺蟲劑及其噴灑濃度

供試試劑及材料：75%乙醇(化學(xué)純，廣州化學(xué)試劑廠)；蔗糖(海南椰威糖業(yè)有限公司)；甜瓜種子(河北麒麟種苗有限公司)；育苗盤、基質(zhì)土、花盆、壓力噴壺(1 L)(儋州物質(zhì)有限公司)；蜂蜜(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜂業(yè)技術(shù)研究中心)。

所需儀器設(shè)備：TLE204E電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；試驗蜂籠(13 cm×6 cm×10 cm的長方體鋼盒，正面為玻璃板，頂部有飼喂口，底部有通風(fēng)口)；BJ-800A多功能粉碎機(jī)(上海拜杰實業(yè)有限公司)；自制人工氣候室(面積3.8 m2)。自制飼喂器(15 mL離心管蓋子，面積為2.27 cm2)。

試驗條件：直接噴灑蜂體與藥膜飼喂試驗在溫度(27±1℃)，相對濕度50%～70%，黑暗條件下進(jìn)行；噴灑植物接觸試驗在溫度(27±1℃)，相對濕度50%～70%，光照和黑暗各12 h交替條件下進(jìn)行。

1.2 試驗方法

參照Costaetal.(2014)方法，略有改進(jìn)。

1.2.1蜂體接觸法

將工蜂4℃低溫麻醉3 min后模擬田間噴藥的方式，用手動噴霧器以0.63 mL/s的速度和平均0.0063 mL/cm2的噴灑率，噴灑各種藥劑。每藥劑處理10組，每組10頭蜜蜂(放入一試驗蜂籠)。空白對照為等量的蒸餾水處理。在試驗蜂籠底部放入飼喂器，隨機(jī)飼喂50%(w/w)的蔗糖溶液。

1.2.2藥膜飼喂法

將20 mL蜂蜜和50 g蔗糖(用粉碎機(jī)將蔗糖粉碎為粉末)攪拌均勻混合成糊狀食物，再把這些食物填充在飼喂器中。模擬田間噴藥的方式將藥劑(濃度同1.2.1)噴灑在食物表面。噴藥時先將10個飼喂器放在一起，然后按一下噴霧器，待液滴在食物表面形成藥膜，放入10個試驗蜂籠底部，每蜂籠放入10頭蜜蜂(每藥劑10個處理，每處理1個飼喂器，10頭蜜蜂)。空白對照噴灑蒸餾水。同時每蜂籠放入足量蒸餾水以補(bǔ)充水分。一旦飼喂器中食物消耗完，換新的飼喂器并加入無污染的50%蔗糖溶液隨機(jī)飼喂。

1.2.3植株接觸法

待育苗盤中甜瓜苗長到4真葉時移入花盆，直到植株長勢良好(蜜蜂可停留葉片上)。模擬田間噴藥的方式，用手動噴霧器以0.63 mL/s的速度和平均0.0063 mL/cm2的噴灑率噴灑植物，以便使液滴均勻的附著在瓜葉表面。然后將植株轉(zhuǎn)移到通風(fēng)陰涼的環(huán)境下1 d致使藥液干燥。試驗前每盆套上塑料罩子(直徑8 cm，高30 cm的圓柱體，頂部為紗布)。每藥劑10個處理，每處理10盆，每盆10頭蜜蜂，每盆底部放入飼喂器含50%(w/w)的蔗糖溶液進(jìn)行隨機(jī)飼喂。空白對照噴灑蒸餾水。

1.2.4蜜蜂中毒癥狀及死亡數(shù)觀察

蜜蜂暴露藥劑1，2，3，4，5，6，12，15，18，21，24，30，36，42，48，60和72 h記錄蜜蜂的死亡數(shù)和蜜蜂的中毒癥狀。用毛筆輕觸中毒蜜蜂，蜜蜂不能運動即視為死亡。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件概率回歸分析計算不同實驗組每種藥劑處理后中華蜜蜂的致死中時LT50，用GraphPad Prism5軟件Survival中的Kaplan-Meier生存分析確定不同實驗組每種藥劑處理后中華蜜蜂的存活情況，繪制生存曲線，并采用Log-rank (Mantel-Cox) Test比較處理組間生存曲線是否有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 噻蟲嗪及其混配制劑對中華蜜蜂的毒性癥狀

3種暴露方式下中華蜜蜂中毒的癥狀類似。處理組中毒蜜蜂起初表現(xiàn)為急躁亂飛，后續(xù)掉落在實驗蜂籠底部，身體失去平衡。大部分身體翻轉(zhuǎn)，顫抖，足部抽搐，隨后麻痹而死亡。對照組蜜蜂多數(shù)群聚安靜的趴在蜂籠壁上。

圖1 直接噴灑蜂體噻蟲嗪及其混配制劑后中華蜜蜂的生存曲線和致死中時Fig.1 Survivorship of Apis cerana cerana, after exposure to direct spraying with thiamethoxam and its mixture, and lethal times in hoursNote:Kaplan-Meier with the statistical test Log-rank. Log-rank (Mantel-Cox) Test: χ2=197.8,df=5, P<0.0001. Different letters behind the curves indicate significant differences between treatments.

2.2 噻蟲嗪及其混配制劑直接噴灑蜂體后對中華蜜蜂存活的影響

噻蟲嗪及其混配制劑直接噴灑蜂體后，根據(jù)各個處理組及空白對照各個時間點中華蜜蜂的死亡數(shù)量繪制了中華蜜蜂的生存曲線(圖1)。生存分析結(jié)果表明，各處理組中華蜜蜂的生存曲線與對照間存在顯著差異(Log-rank (Mantel-Cox) Test: χ2=197.8, df=5,P<0.0001)，噻蟲嗪混配制劑直接噴灑中華蜜蜂后致使中華蜜蜂72 h內(nèi)全部死亡，其中25%噻蟲嗪·異丙威可濕性粉劑對中華蜜蜂的毒性最強(qiáng)，藥后1 h中華蜜蜂數(shù)量降低了50%，42 h時全部死亡；25%噻蟲嗪水分散粒劑相對毒性較低，但藥后72 h中華蜜蜂的存活率僅為8%。25%噻蟲嗪·異丙威可濕性粉劑、25%噻蟲·吡蚜酮可濕性粉劑、40%氯蟲·噻蟲嗪水分散粒劑、30%噻蟲·高氯氟懸乳劑、25%噻蟲嗪水分散粒劑的致死中時LT50分別為1.23 h、2.97 h、3.53 h、4.80 h、6.50 h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照的LT50值1 437.31 h。由此可見，中華蜜蜂在采集花粉花蜜時若遭遇噴灑噻蟲嗪及其混配制劑類殺蟲劑，對蜜蜂的生存危害性極大，且混配制劑毒性高于單劑。

2.3 噻蟲嗪及其混配制劑藥膜飼喂對中華蜜蜂存活的影響

噻蟲嗪及其混配制劑噴灑食物形成藥膜后飼喂中華蜜蜂，根據(jù)各個處理組及空白對照各個時間點中華蜜蜂的死亡數(shù)量繪制了中華蜜蜂的生存曲線(圖2)。生存分析結(jié)果顯示：藥劑處理組中華蜜蜂的存活率極顯著低于對照組(Log-rank (Mantel-Cox) Test: χ2=302.9, df=5,P<0.0001)。25%噻蟲·異丙威可濕性粉劑對中華蜜蜂的毒性最強(qiáng)，2 h左右致使中華蜜蜂死亡50%，24 h時全部死亡；25%噻蟲嗪水分散粒劑對中華蜜蜂毒性最低，但藥后72 h中華蜜蜂的存活率僅為10%。25%噻蟲嗪·異丙威可濕性粉劑、25%噻蟲·吡蚜酮可濕性粉劑、40%氯蟲·噻蟲嗪水分散粒劑、30%噻蟲·高氯氟懸乳劑、25%噻蟲嗪水分散粒劑的LT50分別為2.15 h、7.83 h、2.09 h、9.19 h、17.24 h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照的LT50值169.60 h。由此可見，田間推薦劑量的噻蟲嗪及其混配制劑噴灑于蜜源植物的花粉或花蜜上，對覓食的中華蜜蜂危害性極大，且混配制劑毒性高于單劑。

圖2 中華蜜蜂取食含噻蟲嗪及其混配制劑后的生存曲線和致死中時Fig.2 Survivorship of Apis cerana cerana, after ingestion of thiamethoxam and its mixture contaminated diet and lethal times in hoursNote:Kaplan-Meier with the statistical test Log-rank. Log-rank (Mantel-Cox) Test: χ2=302.9, df=5, P<0.0001. Different letters behind the curves indicate significant differences between treatments.

2.4 噻蟲嗪及其混配制劑噴灑植株后藥劑殘留對中華蜜蜂存活的影響

噻蟲嗪及其混配制劑噴灑甜瓜植株1 d后，將中華蜜蜂暴露于此環(huán)境下。根據(jù)各個處理組及空白對照各個時間點中華蜜蜂的死亡數(shù)量繪制了中華蜜蜂的存活曲線(圖3)。生存分析結(jié)果可知，藥劑處理組中華蜜蜂的存活率極顯著低于對照組(Log-rank (Mantel-Cox) Test: χ2=172.5, df=5,P<0.0001)。25%噻蟲·異丙威可濕性粉劑對中華蜜蜂的毒性最強(qiáng)，12 h時中華蜜蜂的存活率僅為37%，36 h時全部死亡；25%噻蟲嗪水分散粒劑對中華蜜蜂的毒性最低，但72 h后存活率僅為4%。25%噻蟲嗪·異丙威可濕性粉劑、25%噻蟲·吡蚜酮可濕性粉劑、40%氯蟲·噻蟲嗪水分散粒劑、30%噻蟲·高氯氟懸乳劑、25%噻蟲嗪水分散粒劑的LT50分別為6.77、8.34、6.75、7.52、8.90 h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照的LT50值119.88 h。由此可見，藥劑植株暴露噻蟲嗪混配制劑毒性高于單劑。

圖3 中華蜜蜂接觸甜瓜植株殘留噻蟲嗪及其混配制劑后的生存曲線和致死中時Fig.3 Survivorship of Apis cerana cerana, after contact with melon plants contaminated with thiamethoxam and its mixture residues and lethal times in hoursNote:Kaplan-Meier with the statistical test Log-rank.Log-rank (Mantel-Cox) Test: χ2=172.5, df=5, P<0.0001. Different letters behind the curves indicate significant differences between treatments.

3 結(jié)論與討論

本研究是模擬農(nóng)藥在田間實際使用時3種暴露方式下對蜜蜂存活的影響而設(shè)計的室內(nèi)試驗，室內(nèi)評估可為田間評估農(nóng)藥對蜜蜂的影響提供重要的參考依據(jù)。試驗中觀察到，在田間最高推薦劑量下，噻蟲嗪及其混配制劑對中華蜜蜂的存活存在高風(fēng)險性。

噻蟲嗪是硝基胍類新煙堿類殺蟲劑的典型代表，已有研究表明，噻蟲嗪對意大利蜜蜂高毒，納克級甚至更低水平即會對意大利蜜蜂產(chǎn)生影響(Iwasaetal., 2004; Laurinoetal., 2011; Pisaetal., 2014; Christenetal., 2016)。本研究結(jié)果表明，25%噻蟲嗪水分散粒劑通過3種暴露方式(蜂體、取食、植株)對中華蜜蜂采集蜂的致死中時分別為6.50、17.24、8.90 h，顯著影響了中華蜜蜂的存活，說明田間推薦劑量的噻蟲嗪對中華蜜蜂高毒，此研究結(jié)果與Costaetal.(2014)報道一致。Costa采用同樣的方法研究了噻蟲嗪對意大利蜜蜂的毒性，意大利蜜蜂的致死中時分別為1.00、1.51、2.61 h。噻蟲嗪對中華蜜蜂和意大利蜜蜂的致死中時有些差異，可能原因為蜂種不同、蜜蜂的生理狀態(tài)不同、使用的藥劑劑型不同，蜂體、蜜糖及植株著藥量不同。除急性毒性外，環(huán)境中噻蟲嗪的亞致死劑量也會對蜜蜂產(chǎn)生一定的影響，如岳孟等(2017)研究證實亞致死劑量噻蟲嗪對意大利蜜蜂工蜂生存造成一定的影響。噻蟲嗪具有極強(qiáng)的內(nèi)吸性，在很多作物的花蜜、花粉和吐水液滴中均檢測到不同程度的殘留(Tapparoetal., 2011; Stoner & Eitzer, 2012; Sánchez-Hernándezetal., 2016; Tongetal., 2016)。亞致死劑量噻蟲嗪能夠引起意大利蜜蜂大腦蘑菇體、視葉和中腸消化、再生細(xì)胞的損傷(Oliveiraetal., 2014)，影響運動和飛行能力(Charretonetal., 2015)，學(xué)習(xí)記憶能力和嗅覺功能(Alkassab & Kirchner, 2016; Démaresetal., 2016)，從而縮短其壽命。

農(nóng)藥混配制劑在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)病蟲草害防治和新型農(nóng)藥的研制和使用中占有重要地位，殺蟲劑的合理混配可以延緩害蟲抗藥性，提高藥效、降低成本(唐振華，1993)。由于近年來新煙堿類殺蟲劑的大量使用，已導(dǎo)致很多害蟲產(chǎn)生了抗藥性。為了盡可能阻止和延緩害蟲抗藥性的發(fā)展，延長新煙堿類殺蟲劑的使用壽命，國內(nèi)外學(xué)者研制出很多新煙堿類殺蟲劑的混配制劑?？梢哉f混配制劑是一把雙刃劍，在有效防治害蟲的同時，加強(qiáng)了對非靶標(biāo)害蟲的危害。本研究結(jié)果表明，田間推薦劑量的噻蟲嗪混配制劑對中華蜜蜂采集蜂的毒性高于噻蟲嗪單劑。3種暴露方式下，藥后72 h，中華蜜蜂的存活率均為0。25%噻蟲嗪·異丙威可濕性粉劑毒性最高，其次為40%氯蟲·噻蟲嗪水分散粒劑，30%噻蟲·高氯氟懸乳劑，25%噻蟲·吡蚜酮可濕性粉劑。異丙威屬于取代苯類氨基甲酸酯類殺蟲劑，具有較強(qiáng)的觸殺作用，亦有一定的滲透和傳導(dǎo)作用，因此噴灑蜂體，致使蜜蜂死亡的更快。氯蟲苯甲酰胺屬于鄰甲酰胺基苯甲酰胺類殺蟲劑，激活昆蟲魚尼丁受體，影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡，引起昆蟲的肌肉癱瘓、麻痹而逐漸死亡(Hanetal., 2012)。研究表明，氯蟲苯甲酰胺對意大利蜜蜂低毒(游泳，2017)。高效氯氟氰菊酯屬于擬除蟲菊酯類殺蟲劑，對中華蜜蜂高毒(趙怡楠等，2014)。吡蚜酮的作用機(jī)制主要是對刺吸式害蟲口針產(chǎn)生阻塞效應(yīng)，導(dǎo)致其停止取食后致死，并且此過程不可逆(Fuogetal., 1998)。吡蚜酮單劑對意大利蜜蜂的接觸毒性為中毒(吳若函等，2016)。由本實驗結(jié)果可以看出，噻蟲嗪與不同作用方式的殺蟲劑混配增強(qiáng)了對中華蜜蜂的毒性，應(yīng)加強(qiáng)混配制劑的風(fēng)險評估。

綜上所述，本研究通過藥劑的3種暴露方式對中華蜜蜂采集蜂進(jìn)行毒性試驗，闡明了噻蟲嗪及其混配制劑對中華蜜蜂的存活存在高風(fēng)險性。因此噻蟲嗪及其混配制劑的施用應(yīng)遠(yuǎn)離蜜源植物和放蜂區(qū)，以免造成采集蜂及取食帶藥的蜂群中毒死亡。在設(shè)施溫室內(nèi)，蜜蜂授粉期間禁止噻蟲嗪及其混配制劑的噴灑，應(yīng)加強(qiáng)蜜蜂授粉與綠色防控技術(shù)的研究與示范，為減肥減藥以及蜜蜂授粉提質(zhì)增效提供科學(xué)依據(jù)。