劉志強(qiáng)

(1.鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鶴壁，458030； 2.鶴壁市天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鶴壁,458030)

黃芩射干湯首見(jiàn)于翁藻的《醫(yī)鈔類編》,全方由黃芩、射干兩藥配伍而成,主治肺胃熱毒壅盛所致的喉中腥臭等病[1]。藥材黃芩為唇形科植物黃芩的根,富含黃酮、萜類、揮發(fā)油、多糖等,其最主要的藥效物質(zhì)成分為黃酮類，具有解熱、抗炎、抗菌以及抗病毒等藥理作用[2]。藥材射干為鳶尾科植物射干的根莖,主要含有鳶尾苷、鳶尾素等黃酮類,具有抗炎、抗氧化、雌激素樣作用,且抗菌抗病毒效果明顯[3]。黃芩與射干均為常用清熱解毒中草藥,具有抗病毒活性,能抑制H7N9病毒的復(fù)制生長(zhǎng)[2-3]。

H7N9病毒屬于正黏病毒科、RNA病毒,具有外包膜,核衣殼為螺旋對(duì)稱狀顆粒,主要經(jīng)呼吸道在人類之間進(jìn)行傳播,具有變異性和潛在大流行性風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。其神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase)是該病毒復(fù)制、感染過(guò)程中的關(guān)鍵酶,也是扎那米韋、奧司他韋等抗流感藥物阻斷病毒感染和傳播的主要靶酶[6]。神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)高度保守,是抗流感病毒藥物研究中的理想靶標(biāo),許多黃酮類等天然物質(zhì)可以通過(guò)抑制神經(jīng)氨酸酶產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)[7-8]。以往研究表明:H7N9病毒對(duì)奧司他韋、扎那米韋等神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感,而對(duì)利巴韋林、M2阻滯劑金剛烷胺等抗病毒藥耐藥[9],但目前研究發(fā)現(xiàn),H7N9病毒的神經(jīng)氨酸酶R292K、R152K，E119V和I222K/R的突變,會(huì)導(dǎo)致對(duì)奧司他韋、扎那米韋等神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥[10],因此,開發(fā)研究新一代抗H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑,提高對(duì)H7N9流感的防控治療措施刻不容緩。

鑒于黃芩射干湯中黃酮類物質(zhì)具有一定抗流感病毒作用,本研究利用分子對(duì)接技術(shù)將黃芩射干湯中主要黃酮類成分與H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶逐一對(duì)接,探究其抗病毒作用機(jī)制,為進(jìn)一步研究黃芩射干湯抗流感病毒物質(zhì)基礎(chǔ)與藥理機(jī)制提供線索與參考。

1 材料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)

(1)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP[11](網(wǎng)址更新為:http:∥tcmspw.com/tcmsp.php)。(2)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB(https:∥www.rcsb.org/)。(3)化學(xué)成分繪制軟件ChemBio3D Ultra 14.0。(4)分子對(duì)接圖像處理軟件PyMOL。(5)分子對(duì)接軟件AutoDock Vina與AutoDock Tools。

1.2 H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶準(zhǔn)備

本研究以WU等[12]發(fā)現(xiàn)的扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶的共晶體為模型,將扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶用PyMOL分離,對(duì)神經(jīng)氨酸酶進(jìn)行前處理,去除水分子、磷酸根以及一些非活性位點(diǎn)的其他配體,利用AutoDock Tools對(duì)靶蛋白進(jìn)行加氫、加電荷、設(shè)置為半柔性對(duì)接模式,統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為AutoDock Vina軟件可識(shí)別的pdbqt文件。

1.3 黃酮類成分收集與前處理

檢索CNKI數(shù)據(jù)庫(kù),查閱文獻(xiàn)[13-16]收集黃芩射干湯中主要黃酮活性成分,黃芩含有漢黃芩素、黃芩苷、黃芩素、千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶素A；射干含有白射干素、次野鳶尾黃素、芒果苷、射干苷、射干苷元、野鳶尾苷、野鳶尾黃素以及鳶尾黃素。本課題組以以上13種主要黃酮類成分為研究對(duì)象,研究黃芩射干湯主要黃酮類成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對(duì)接情況。

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載以上13種活性成分的mol2格式文件,然后利用ChemBio3D Ultra 14.0軟件進(jìn)行能量最小化處理,最后利用AutoDock Tools將活性分子轉(zhuǎn)換為AutoDock Vina軟件可識(shí)別的pdbqt文件,以備分子對(duì)接使用。

1.4 分子對(duì)接方法

以扎那米韋的坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn),設(shè)置活性口袋位置,將標(biāo)準(zhǔn)品扎那米韋進(jìn)行分子對(duì)接,測(cè)試分子對(duì)接的準(zhǔn)確性,研究扎那米韋的分子對(duì)接結(jié)合能、氨基酸殘基作用情況。并以扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶作用情況為“金標(biāo)準(zhǔn)”,研究黃芩射干湯中主要黃酮活性成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶的分子對(duì)接結(jié)合能、氨基酸殘基作用情況。

2 結(jié)果

2.1 分子對(duì)接結(jié)合能

如圖1所示,扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對(duì)接前后位置基本不變,說(shuō)明AutoDock Vina分子對(duì)接準(zhǔn)確性高,得到扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對(duì)接結(jié)合能為-8.3 kcal/mol(1 kcal/mol=4.18 kJ/mol)。將13種主要黃酮類成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶逐個(gè)分子對(duì)接,結(jié)果如表1所示。從表1可見(jiàn)，大多數(shù)黃酮類成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶具有一定結(jié)合力,其中漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A與H7N9神經(jīng)氨酸酶的結(jié)合能最佳,分別為-7.1，-7.2和-7.2 kcal/mol。如圖2所示,漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對(duì)接位置基本重合、作用模式一致,表明黃芩射干湯抗H7N9的主要成分為漢黃芩素、黃芩素以及木蝴蝶素A。

圖1 扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶結(jié)合情況 Fig.1 Combination of zanamivir with H7N9 neuraminidase

圖2 漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A與H7N9神經(jīng)氨酸酶結(jié)合情況Fig.2 Combination of hanbaicalin,huangqinsu,wood butterfly A and H7N9 neuraminidase

表1 黃芩射干湯主要黃酮成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對(duì)接結(jié)合能
Table 1 The binding energy of main flavonoids components of huangqin-shegan decoction and H7N9neuraminidase molecular

中藥來(lái)源黃酮類物質(zhì)最佳結(jié)合能/(kcal·mol-1)黃芩漢黃芩素-7.1黃芩黃芩苷-4.5黃芩黃芩素-7.2黃芩千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷-5.8黃芩木蝴蝶素A-7.2射干白射干素-5.8射干次野鳶尾黃素-5.4射干芒果苷-6.9射干射干苷-1.6射干射干苷元-6.3射干野鳶尾苷-2.2射干野鳶尾黃素-6.0射干鳶尾黃素-6.4

2.2 分子對(duì)接情況

WU等[12]發(fā)現(xiàn)扎那米韋主要是通過(guò)與H7N9神經(jīng)氨酸酶的Arg-119，Asp-152，Arg-153，Trp-180，Glu-278，Lys-294和Arg-372等氨基酸殘基相互作用,產(chǎn)生抑制作用。如圖3～6和表2所示,扎那米韋、漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A能與神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)上的Arg-119，Asp-152，Arg-153，Trp-180，Arg-372，Glu-278和Lys-294產(chǎn)生相互作用,可能具有抑制H7N9神經(jīng)氨酸酶的作用。

表2 研究藥物與H7N9神經(jīng)氨酸酶相互作用情況
Table 2 Study on drug interaction with H7N9neuraminidase

成分相互作用的氨基酸殘基扎那米韋Arg-119,Glu-120,Leu-135,Asp-152,Arg-153,Arg-157,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Thr-227,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Arg-372,Tyr-406漢黃芩素Arg-119,Glu-120,Asp-152,Arg-153,Arg-157,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Asn-347,Asn-348,Arg-372,Gly-349,Tyr-406黃芩素Arg-119,Glu-120,Asp-152,Arg-153,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Thr-227,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Asn-347,Asn-348,Arg-372,Gly-349,Tyr-406木蝴蝶素AArg-119,Glu-120,Leu-135,Asp-152,Arg-153,Trp-180,Ser-181,Ile-224,Arg-226,Glu-229,Ala-248,Glu-278,Glu-279,Lys-294,Asn-296,Asn-348,Arg-372,Gly-349,Tyr-406

圖3 扎那米韋與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對(duì)接Fig.3 Zanamivir and H7N9 neuraminidase molecular docking

圖4 漢黃芩素與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對(duì)接Fig.4 Hanbaicalin and H7N9 neuraminidase molecular docking

圖5 黃芩素與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對(duì)接Fig.5 Huangqinsu and H7N9 neuraminidase molecular docking

圖6 木蝴蝶素A與H7N9神經(jīng)氨酸酶分子對(duì)接Fig.6 Wood butterfly A and H7N9 neuraminidase molecular docking

3 討論與結(jié)論

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)、分子對(duì)接等新概念迅速發(fā)展,為藥物研發(fā)注入了新的活力[17],本研究將黃芩射干湯中13種主要黃酮成分與H7N9神經(jīng)氨酸酶進(jìn)行了分子對(duì)接,發(fā)現(xiàn)漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A與H7N9神經(jīng)氨酸酶結(jié)合能最高,能與神經(jīng)氨酸酶Arg-119，Asp-152，Arg-153，Trp-180，Arg-372，Glu-278和Lys-294產(chǎn)生相互作用,具有類似扎那米韋樣抗H7N9神經(jīng)氨酸酶作用,這可能是黃芩射干湯抗H7N9病毒的藥理學(xué)作用之一。漢黃芩素是從唇形植物黃芩、半枝蓮等分離出的一種天然活性物質(zhì),具有顯著抗病毒作用,能對(duì)乙肝病毒以及呼吸道合胞病毒產(chǎn)生抑制作用[10]。本研究分子對(duì)接發(fā)現(xiàn),漢黃芩素能抑制H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶活性,說(shuō)明漢黃芩素抗病毒效果確切。吳瑩等[18]發(fā)現(xiàn),漢黃芩素還能調(diào)控病毒感染的肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB p62的核轉(zhuǎn)移,減輕病毒導(dǎo)致的炎癥反應(yīng),說(shuō)明漢黃芩素具有抗炎、抗病毒等多靶點(diǎn)藥理作用。黃芩素是從中藥黃芩提取的一種黃酮類物質(zhì),對(duì)小鼠流感模型有明顯抗病毒作用[19]。楊令芝等[20]發(fā)現(xiàn),黃芩素不僅能抑制神經(jīng)氨酸酶,而且對(duì)耐藥型神經(jīng)氨酸酶也具有明顯的抗性作用,該報(bào)道與本研究結(jié)果相互佐證,表明黃芩素確能抑制神經(jīng)氨酸酶作用。木蝴蝶素A與漢黃芩素是一對(duì)同分異構(gòu)體[21],同為黃芩中的黃酮類活性物質(zhì),目前暫未見(jiàn)有關(guān)其具有神經(jīng)氨酸酶抑制劑作用的報(bào)道,但本研究發(fā)現(xiàn),其與H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶結(jié)合能為-7.2 kcal/mol,結(jié)合模式與結(jié)合能與黃芩素、漢黃芩素的相當(dāng),推測(cè)木蝴蝶素A亦能通過(guò)抑制神經(jīng)氨酸酶活性發(fā)揮抗病毒作用。

綜上所述,黃芩射干湯黃酮類成分抗H7N9病毒神經(jīng)氨酸酶效果顯著,其中漢黃芩素、黃芩素、木蝴蝶素A結(jié)合能最高,還具有一定抗炎作用,對(duì)耐藥型神經(jīng)氨酸酶也具有一定抗性。本研究基于中藥有效成分配伍模式,以黃芩射干湯主要藥效成分——黃酮類化合物為研究對(duì)象,分析了其抑制H7N9神經(jīng)氨酸酶的分子機(jī)制,在一定程度上反映了黃芩射干湯抗H7N9病毒的藥理作用。但鑒于中藥湯劑化學(xué)成分復(fù)雜、計(jì)算機(jī)技術(shù)與現(xiàn)實(shí)的差異,黃芩射干湯抗H7N9病毒的更深層次藥理機(jī)制仍待進(jìn)一步深入研究。