李善政 郭銳 陳永旭 鮑鈺瑩 王佳杰 常振宇

摘要：肉雞肺動(dòng)脈高壓是以肺動(dòng)脈壓血管重構(gòu)為特征的一種疾病，眾多研究揭示肺血管重構(gòu)是其中心環(huán)節(jié)之一。細(xì)胞內(nèi)鈣離子（[Ca2+]）濃度的升高是誘發(fā)并導(dǎo)致血管重構(gòu)的重要機(jī)制，鈣敏感受體（CaSR）在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)及低氧性肺血管收縮和肺血管重構(gòu)中起著重要的作用。應(yīng)用免疫組化和Western blot方法研究了缺氧條件下CaSR在AA肉雞和藏雞肺動(dòng)脈平滑肌組織中的表達(dá)情況，為肉雞腹水綜合征（PAH）的肺動(dòng)脈重構(gòu)提供新的證據(jù)。結(jié)果表明，肉雞組有肺水腫發(fā)生，藏雞組無(wú)肺水腫發(fā)生，缺氧條件下飼養(yǎng)的肉雞肺動(dòng)脈平滑肌CaSR表達(dá)明顯高于藏雞組（P<0.05）。通過(guò)探討CaSR在AA肉雞和藏雞肺動(dòng)脈平滑肌組織中的表達(dá)情況，從新的角度闡明了肉雞腹水綜合征發(fā)生的分子機(jī)制。

關(guān)鍵詞：肉雞;藏雞;肺動(dòng)脈平滑肌;鈣敏感受體（CaSR）

中圖分類號(hào)：S858.31? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-273X（2020）04-0005-03

肉雞肺動(dòng)脈高壓（PAH） 綜合征，也稱肉雞腹水綜合征，是家禽發(fā)生的以一種缺氧、不愿運(yùn)動(dòng)、腹部膨大和肺動(dòng)脈壓力升高及右心衰竭為特點(diǎn)的疾病或綜合征。目前公認(rèn)發(fā)病機(jī)制為缺氧—血管重構(gòu)—PAH—右心衰竭—右心容量負(fù)荷增加直至腹水死亡[1，2]。王建琳等[3]證實(shí)血管重構(gòu)及PAH的形成是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。肉雞PAH綜合征形成過(guò)程中具有血管重構(gòu)這一特征，即血管壁厚度、管腔直徑的比值增加，血管內(nèi)徑、外徑減小，而血管壁的橫截面積不變[4，5]。有證據(jù)表明鈣敏感受體（CaSR）介導(dǎo)了肺血管收縮和重構(gòu)以及肉雞腹水綜合征發(fā)生的分子機(jī)制[6]。

鈣敏感受體（Calcium-sensing receptor，CaSR）是G蛋白耦聯(lián)受體的C家族成員。1993年，Brown等首次由牛甲狀旁腺克隆出CaSR。CaSR主要由胞內(nèi)羧基尾部、氨基胞外域以及7個(gè)跨膜螺旋的跨膜域所組成[7]。CaSR主要分布在骨組織、血管、胃腸道、參與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的甲狀旁腺及腎組織等。其功能主要是維持鈣離子和其他金屬離子的穩(wěn)定狀態(tài)，并且能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化，控制離子通道的開(kāi)啟和激素分泌等[8]。本研究通過(guò)比較肉雞和藏雞在高原缺氧條件下肺水腫發(fā)生率、CaSR表達(dá)差異兩個(gè)方面來(lái)闡述腹水綜合征發(fā)生的分子機(jī)制。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

7 日齡健康白羽肉仔雞50只購(gòu)于宜昌某正大孵化廠（由飛機(jī)運(yùn)往林芝）;7日齡健康藏仔雞50只購(gòu)于拉薩某商業(yè)孵化廠。白羽肉仔雞和藏雞在西藏農(nóng)牧學(xué)院畜牧場(chǎng)按常規(guī)飼養(yǎng)條件進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2? 主要儀器與試劑

高速冷凍離心機(jī)（3K15，Sigma）;RM-2245型萊卡組織切片機(jī);Olympus光學(xué)顯微鏡;CaSR抗體;TBS濃縮緩沖液、中性樹(shù)膠、水楊酸甲酯、二甲苯、福爾馬林、PVDF 膜、顯影定影試劑、轉(zhuǎn)移緩沖液、電泳緩沖液。

1.3? 免疫組化檢測(cè)CaSR

肉雞和藏雞肺動(dòng)脈平滑肌組織經(jīng)包埋切片后，3%H2O2溶液避光室溫條件下作用30 min，修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%TBST封閉，分別滴加兔抗鼠CaSR 抗體（1∶100，一抗）、山羊抗兔 HRP-IgG（二抗），孵育，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺法顯色操作，蘇木素染液復(fù)染2 min、梯度乙醇脫水、透明和封片（用PBS緩沖液替代一抗作陰性對(duì)照），用Olympus光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.4? Western blot檢測(cè)CaSR蛋白的表達(dá)

將肉雞和藏雞肺動(dòng)脈平滑肌組織裂解，勻漿并提取肺動(dòng)脈平滑肌總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定其蛋白濃度和含量。SDS-PAGE、考馬斯亮蘭染色確定各樣品總蛋白含量，將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。加兔抗鼠CaSR抗體（1∶500，一抗），4 ℃孵育過(guò)夜，室溫下TBST脫色搖床上洗3次，每次5 min;山羊抗兔HRP-IgG（二抗）用TBST稀釋3 000 倍，室溫下孵育30 min，用TBST在室溫下脫色、搖床上洗3次，每次5 min。內(nèi)參是GAPDH（1∶10 000），顯色后凝膠成像系統(tǒng)拍攝。應(yīng)用光密度法測(cè)定目標(biāo)蛋白豐度。使用SPSS 17.0軟件對(duì)所得灰度值進(jìn)行分析，并用Graph pad prism 5.0軟件作圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 肉雞和藏雞肺水腫發(fā)病情況

由圖1可知，在高原缺氧環(huán)境下，從第2天起，肉雞開(kāi)始出現(xiàn)肺水腫，并呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，截至第15天，共有11只肉雞出現(xiàn)肺水腫情況，其發(fā)病率為22%。藏雞從飼養(yǎng)開(kāi)始到結(jié)束無(wú)肺水腫發(fā)生，發(fā)病率為0。

2.2? CaSR免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果（圖2）表明，與肉雞組（圖2A）肺動(dòng)脈平滑肌組織比較，藏雞組肺動(dòng)脈平滑肌組織有弱陽(yáng)性表達(dá)，顏色較淺（圖2B）。陰性對(duì)照組（不加一抗）則無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)顯色（圖2C）。

2.3? Western blot 檢測(cè)CaSR蛋白的表達(dá)

免疫印跡結(jié)果（圖3）表明，與肉雞組比較，藏雞組肺動(dòng)脈平滑肌組織CaSR蛋白水平顯著降低（P<0.05）。

3? 討論

肉雞肺動(dòng)脈高壓是以肺動(dòng)脈壓血管重構(gòu)為特征的一組疾病，且眾多研究揭示肺血管重構(gòu)是其中心環(huán)節(jié)之一。研究證實(shí)，CaSR在肺血管重構(gòu)和低氧性肺血管收縮以及維持肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定狀態(tài)均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[9]。Tfelt-Hansen等[10]發(fā)現(xiàn)CaSR 在新生大鼠心室肌細(xì)胞有功能性表達(dá)。試驗(yàn)表明，CaSR在血管重構(gòu)的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌也有功能性表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子超載主要是由于CaSR激活G蛋白-PLC-IP3途徑，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多;在慢性缺氧期間由瞬時(shí)受體電位基因編碼的鈣庫(kù)操縱的陽(yáng)離子通道和受體操縱的陽(yáng)離子通道在肺動(dòng)脈平滑肌中上調(diào)，從而認(rèn)為這可能是導(dǎo)致肉雞腹水綜合征發(fā)生的新途徑[11]。Molostvov等[12]、Li等[13]發(fā)現(xiàn)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌缺氧時(shí)有CaSR 的功能表達(dá)，并可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管緊張度。Ziegelstein等[14]在培養(yǎng)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human aortic endothelial cell）時(shí)運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）和熒光免疫法證明了CaSR的存在，通過(guò)RT-PCR方法獲得了CaSR的預(yù)期產(chǎn)物。Ohanian等[15]證實(shí)，大鼠皮下動(dòng)脈存在CaSR的功能表達(dá)，后者參與肌張力調(diào)節(jié)，進(jìn)而參與外周血管阻力的調(diào)節(jié)。研究表明，CaSR激動(dòng)劑可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異性靶向CaSR的siRNA、NO及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度產(chǎn)生均會(huì)缺失或減少，但是細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增高為誘發(fā)血管重構(gòu)的重要機(jī)制之一，在缺氧條件下其增高機(jī)制尚未了解。王關(guān)嵩等[16]認(rèn)為慢性缺氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度顯著增加，這可能與缺氧誘導(dǎo)的膜靜息電位變化有關(guān)，從而引起電壓門(mén)控鈣離子通道活性的改變、鈣通道開(kāi)放和鈣離子內(nèi)流。膜靜息電位在細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，如果細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，則可以導(dǎo)致細(xì)胞增殖、收縮和基因表達(dá)等變化。

對(duì)于低氧性肺動(dòng)脈高壓導(dǎo)致的肉雞腹水綜合征發(fā)病機(jī)制，肺血管重構(gòu)、收縮被普遍認(rèn)為是導(dǎo)致肉雞腹水綜合征發(fā)病的病理學(xué)和生理學(xué)基礎(chǔ)[17]。試驗(yàn)結(jié)果表明，CaSR可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、離子通道開(kāi)啟等，缺氧激活血管CaSR表達(dá)增加，CaSR表達(dá)增加是血管重構(gòu)的啟始階段，因而是肺動(dòng)脈高壓形成和血管平滑肌增殖的上游調(diào)控因子。盡管肉雞肺動(dòng)脈高壓綜合征的發(fā)病原因各不相同，動(dòng)物機(jī)體的器官形態(tài)功能和體內(nèi)生化指標(biāo)改變多樣，但都具有呼吸困難和肺動(dòng)脈高壓的臨床特征和血管重構(gòu)等病理學(xué)特征，由此我們有理由假設(shè)其發(fā)病機(jī)制：肉雞快速增長(zhǎng)—心肺發(fā)育滯后—心肺功能不全—缺氧—激活血管CaSR表達(dá)—啟動(dòng)血管重構(gòu)—血管壁增厚—進(jìn)一步缺氧—右心衰竭—腹水形成，Julian等[18]在1987年首次提出此假說(shuō)。CaSR介導(dǎo)了血管重構(gòu)并促進(jìn)PAH的形成，亦證實(shí)低氧條件下培養(yǎng)可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖反應(yīng)，研究表明低氧是導(dǎo)致肺血管重構(gòu)和PAH發(fā)生的重要原因。本假說(shuō)如果成立，研究CaSR在PAH肉雞血管重構(gòu)中的作用將具有重要意義[19]。

4? 結(jié)論

本研究首次證明了藏雞和肉雞肺動(dòng)脈平滑肌組織中有CaSR的表達(dá)。通過(guò)本試驗(yàn)確定并掌握了CaSR在白羽肉雞和藏雞肺動(dòng)脈平滑肌組織中的表達(dá)情況，為闡明肉雞腹水綜合征的肺動(dòng)脈重構(gòu)提供了新的科學(xué)證據(jù)。免疫組化和Western blot結(jié)果表明，肉雞肺動(dòng)脈平滑肌CaSR表達(dá)明顯高于藏雞組，我們前期進(jìn)行了肉雞常氧條件下飼養(yǎng)試驗(yàn)[20]，與本試驗(yàn)中缺氧條件下肉雞CaSR表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)缺氧條件下肉雞CaSR表達(dá)量明顯高于常氧條件下CaSR表達(dá)量。本試驗(yàn)通過(guò)研究缺氧條件下肉雞和藏雞CaSR表達(dá)差異，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)CaSR表達(dá)與雞的品種有關(guān)。

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