潘翠柳，陸小蓮，吳捷梅，黃裕華，唐云麗，梁臣艷，鄭作文，黃美玲

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

惡性腫瘤是人類面臨的重大難題，已經(jīng)成為影響我國(guó)居民健康及威脅生命的疾病之一［1-3］?；熕幬镌谥委煇盒阅[瘤方面具有重要的地位，但化療藥物具有較大的毒副作用［4］。因此，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物和對(duì)化療藥具有減毒增效作用的輔助藥物成為目前研究的熱點(diǎn)。

藤茶系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄Ampelop?sis grossedentata（Hand.-Mazz.）W.T.Wang，主要用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎等病癥［5］。其主要成分雙氫楊梅樹(shù)皮素（APS）是該植物中含量最高的黃酮類化合物［6］，多項(xiàng)研究表明，APS具有抗炎鎮(zhèn)痛［7-8］、抗腫瘤［9-13］、降血糖及降血脂［14-15］、抗氧化［16］、抗過(guò)敏［17］、抗粥樣硬化［18-19］、保肝［20-21］等藥理作用。基于前期研究基礎(chǔ)，本文建立H22荷瘤小鼠模型，探討APS對(duì)化療藥環(huán)磷酰胺（CTX）抗腫瘤的增效減毒作用，為后續(xù)深入研究藤茶黃酮類化合物及臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康SPF級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（桂）2009-0002。

1.2 細(xì)胞株及試藥 H22細(xì)胞由廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；雙氫楊梅樹(shù)皮素（由貴州苗藥生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：DH20180712）；環(huán)磷酰胺（CTX，由山東西亞化學(xué)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：ZB98974）；RPMI 1640培養(yǎng)基［由賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司生產(chǎn)］；胰蛋白酶-EDTA消化液（由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：SLBT1300-100）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 H22原代細(xì)胞的培養(yǎng) 取H22細(xì)胞適量，用生理鹽水稀釋為 1×107～10×107個(gè)/ml，取 0.2 ml H22細(xì)胞皮下注射接種在小鼠右腋窩，小鼠自由成長(zhǎng)至瘤體積大于500 mm3時(shí)，開(kāi)始準(zhǔn)備剝瘤，進(jìn)行原代培養(yǎng)。采用無(wú)菌操作取出瘤體，取下瘤體組織以后，加入PBS緩沖液清洗干凈，去外周組織后用消毒剪刀剪成1～2 mm3小塊，加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液研磨，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液后，加入胰酶消化2 min，終止消化，過(guò)200目的細(xì)胞篩，離心（1 000 r/min，5 min），加完全培養(yǎng)液輕輕吹散均勻制成細(xì)胞懸液。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 無(wú)菌條件下取小鼠H22原代培養(yǎng)的瘤細(xì)胞，用生理鹽水稀釋瘤細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，于小鼠右腋窩皮下接種瘤液，每只0.2 ml；接種后每日觀察小鼠接種部位腫瘤生長(zhǎng)情況，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠的瘤體積，瘤體積大小為500 mm3時(shí)，顯示小鼠造模成功，選出皮下瘤體積生長(zhǎng)大小接近的荷瘤小鼠，隨機(jī)分為6組：模型對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、APS高劑量組、APS低劑量+環(huán)磷酰胺組、APS中劑量+環(huán)磷酰胺組、APS高劑量+環(huán)磷酰胺組，每組14只。環(huán)磷酰胺組予環(huán)磷酰胺溶液灌胃，劑量為0.02 g/kg，容積為10 ml/kg；APS高劑量組予雙氫楊梅樹(shù)皮素溶液灌胃，劑量為0.60 g/kg，容積為10 ml/kg；APS低劑量+環(huán)磷酰胺組：灌胃雙氫楊梅樹(shù)皮素溶液0.15 g/kg+腹腔注射環(huán)磷酰胺0.02 g/kg，容積為10 ml/kg；APS中劑量+環(huán)磷酰胺組：灌胃雙氫楊梅樹(shù)皮素溶液0.30 g/kg+腹腔注射環(huán)磷酰胺0.02 g/kg，容積為10 ml/kg；APS高劑量+環(huán)磷酰胺組：灌胃雙氫楊梅樹(shù)皮素溶液0.60 g/kg+腹腔注射環(huán)磷酰胺0.02 g/kg，容積為10 ml/kg。小鼠每日給藥前稱量體重，首次給藥前先量取瘤體積即為初體積，末次給藥后量取瘤體積即為末體積，從而計(jì)算出APS聯(lián)合CTX對(duì)H22荷瘤小鼠給藥前后腫瘤體積的影響。末次給藥后24 h后頸椎脫臼處死小鼠，取血清用于生化檢測(cè)，取瘤塊、脾、胸腺和肝組織并稱取重量。

2.3 H22荷瘤小鼠的腫瘤抑制率 按照公式計(jì)算各組的抑瘤率，抑瘤率（%）=（模型對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重）/模型對(duì)照組瘤重×100%。

2.4 脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及肝臟指數(shù)的測(cè)定 末次給藥24 h后，用眼科鑷取出小鼠的脾臟、胸腺和肝臟組織，使用濾紙吸干殘血，稱重。計(jì)算各組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和肝臟指數(shù)。計(jì)算公式：器官指數(shù)（mg/g）=器官重量（mg）/動(dòng)物體重（g）。

2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 APS聯(lián)合CTX對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤體積的影響 見(jiàn)表1。

表1 APS聯(lián)合CTX對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤體積的影響 （±s）

表1 APS聯(lián)合CTX對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤體積的影響 （±s）

注：與模型對(duì)照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與CTX組比較，③P＜0.05，④P＜0.01；下同

組 別 劑量（g/kg） 初瘤體積（mm3） 末瘤體積（mm3） 瘤體積差（mm3）模型對(duì)照組CTX組APS高劑量組APS低劑量+CTX組APS中劑量+CTX組APS高劑量+CTX組動(dòng)物數(shù)開(kāi)始14 14 14 14 14 14結(jié)束11 13 12 13 14 14——0.02 0.60 0.15+0.02 0.30+0.02 0.60+0.02 676.55±118.59 706.92±168.83 655.42±93.96 698.38±121.33 700.50±226.39 668.36±130.37 7 492.27±2 413.04 5 624.54±2 028.83 5 377.50±2 139.47 4 474.92±1 652.37 4 436.64±1 834.15 3 493.14±1 073.88 6 815.73±2 358.57 4 917.62±1 920.66①5 307.67±3 066.08 3 776.54±1 604.74②3 736.54±1 836.44②2 824.79±1 045.71②④

表1結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，除APS高劑量組瘤體積差變化不大外，其余用藥組瘤體積差均明顯減小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與CTX組比較，APS高劑量+CTX組的瘤體積差減小更明顯，具有顯著性差異（P＜0.01）。

3.2 APS對(duì)CTX抑瘤的增效作用 見(jiàn)表2。

表2 APS對(duì)CTX抑瘤的增效作用 （±s）

表2 APS對(duì)CTX抑瘤的增效作用 （±s）

組 別 動(dòng)物數(shù) 劑量（g/kg） 平均瘤重（g） 抑瘤率（%）模型對(duì)照組CTX組APS高劑量組APS低劑量＋CTX組APS中劑量＋CTX組APS高劑量＋CTX組開(kāi)始14 14 14 14 14 14結(jié)束11 13 12 13 14 14——0.02 0.60 0.15＋0.02 0.30＋0.02 0.60＋0.02平均體重（g）開(kāi)始28.99 29.85 28.06 27.63 28.30 27.76結(jié)束32.63 32.78 30.25 28.14 29.81 28.20 5.07±2.71 3.37±0.94①4.02±1.41①2.69±1.19①③2.61±0.94②③2.02±0.43②④33.57 20.72 47.07 48.52 60.26

表2結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，各用藥組瘤重均明顯減輕，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；單用藤茶雙氫楊梅樹(shù)皮素高劑量組抑瘤率為20.72%，單用CTX組抑瘤率為33.57%，藤茶雙氫楊梅樹(shù)皮素低、中、高劑量組與CTX聯(lián)用后抑瘤率分別為47.07%、48.52%和60.26%；與單用CTX組比較，聯(lián)合用藥組的平均瘤重顯著減輕，明顯提高了對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用（P＜0.05或P＜0.01）。

3.3 APS對(duì)CTX抑瘤的減毒作用 見(jiàn)表3。

表3 APS對(duì)CTX抑瘤的減毒作用 （±s）

表3 APS對(duì)CTX抑瘤的減毒作用 （±s）

組 別 劑量（g/kg） 脾指數(shù)（mg/g） 胸腺指數(shù)（mg/g） 肝臟指數(shù)（mg/g）模型對(duì)照組CTX組APS高劑量組APS低劑量+CTX組APS中劑量+CTX組APS高劑量+CTX組動(dòng)物數(shù)開(kāi)始14 14 14 14 14 14結(jié)束11 13 12 13 14 14—0.02 0.60 0.15+0.02 0.30+0.02 0.60+0.02 0.70±0.32 0.37±0.13②0.65±0.23④0.47±0.15①0.49±0.17①③0.54±0.17④1.47±0.07 0.64±0.12②1.17±0.21②④1.01±0.13②④1.05±0.10②④1.34±0.08④50.33±4.82 44.14±13.73 59.23±13.26③55.32±10.62 55.54±5.47 63.61±6.50①④

表3結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，CTX組脾指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與CTX組比較，APS中、高劑量與CTX聯(lián)合用藥后可提高小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；APS低劑量與CTX聯(lián)合用藥后可明顯提高小鼠的胸腺指數(shù)（P＜0.01）；APS高劑量與CTX聯(lián)合用藥后還可明顯提高小鼠的肝臟指數(shù)（P＜0.01）。

4 討 論

惡性腫瘤是危及人類生命的主要疾病之一?；熞殉蔀槟[瘤綜合治理的重要手段之一，但化療藥物具有一定的毒副作用，常見(jiàn)的有消化障礙、骨髓障礙、臟器功能衰弱、過(guò)敏等癥狀［22］。中藥因具有較好的療效且副作用少，已受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。大部分中草藥可通過(guò)提高機(jī)體的免疫系統(tǒng)、減輕腫瘤對(duì)機(jī)體的損傷作用，從而達(dá)到增效減毒的作用。

藤茶在我國(guó)瑤族、壯族地區(qū)已有數(shù)百年的應(yīng)用歷史［23］，民間用于治療感冒、腸胃不適、肝病等，大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，藤茶的有效成分在體內(nèi)外對(duì)H22細(xì)胞［13］、S180細(xì)胞［24］、人肝癌［25］等腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡均具有明顯的抑制作用。本文通過(guò)建立H22荷瘤小鼠模型，觀察APS與常用抗癌藥物環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用的效果，并初步分析其可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APS的抑瘤率低于環(huán)磷酰胺，但對(duì)脾、胸腺、肝臟指數(shù)均有增重的作用；APS聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)脾、胸腺、肝臟指數(shù)有增重作用，且抑瘤率高于單用環(huán)磷酰胺，顯示APS聯(lián)合環(huán)磷酰胺具有減毒增效作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果初步顯示，APS聯(lián)合環(huán)磷酰胺防治肝癌具有優(yōu)勢(shì)，可為中藥聯(lián)合化療藥物防治腫瘤提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？紤]到藤茶作用廣泛、機(jī)制復(fù)雜及體內(nèi)細(xì)胞因子的交互作用，其聯(lián)合增效作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究考證。