趙增元，郭偉婷，畢江華，馮春濤，朱宏波，張 普，孫建輝，王敏生，余文莉*，李樹靜*

（1.河北天和肉牛養(yǎng)殖有限公司，石家莊 050200；2.河北省牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，石家莊 050200；3.石家莊市畜牧技術(shù)推廣站，石家莊 050200；4.石家莊市鹿泉區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，石家莊 050200）

1 材料與方法

1.1 冷凍胚胎與試驗耗材

牛一級冷凍胚胎，河北天和肉牛養(yǎng)殖有限公司生產(chǎn)；純種西門塔爾牛一級冷凍胚胎，購自新疆金荷牧源畜牧科技有限公司。

四孔平皿（型號為148861），購自美國Thermo公司；六孔平皿（型號為090109），購自美國SPI公司；35 mm平皿（型號為7302029）、60 mm平皿（型號為4194016），均購自美國B.D.公司；胚胎冷凍細(xì)管（型號為0.25 mL），購自法國卡蘇公司；顯微分割刀（型號為Pullman WA）、取樣吸頭（2μL）、通用吸 頭（200 μL），均 購 自 美 國AB 公 司；0.22μm濾器（型號為FE6 923），購自美國Pall公司；一次性注射器（1，5，20 mL），購自石家莊炫博醫(yī)療器械有限公司。

1.2 主要試劑

胚胎保存液（批號為180307），購自美國ICP公司；胚胎冷凍液（批號為12715001），購自美國MOFA公司。

mCR1aa（前期）液、mCR1aa（后期）液、胚胎分割液均為自配液。mCR1aa（前期）液配方：胚胎培養(yǎng)基礎(chǔ)液mCR1aa ＋6 mg／mL牛血清白蛋白（BSA）＋20μL／mL必需氨基酸（EAA，50×）＋10μL／mL 非 必 需 氨 基 酸（NEAA，100×）＋0.15 mg／mL L-谷氨酰胺；mCR1aa（后期）液配方：胚胎培養(yǎng)基礎(chǔ)液mCR1aa ＋10%胎牛血清（FBS，V／V）＋20μL／mL EAA（50×）＋10μL／mL NEAA（100×）＋0.15 mg／mL L-谷氨酰胺［11］；胚胎分割液配方：0.05 g／L CaCl2·2H2O ＋0.04 g／L MgCl2·6H2O＋0.2 g／L KCl＋0.2 g／L KH2PO4＋8 g／L NaCl＋1.15 g／L Na2HPO4＋0.0015 g／L EDTA·Na2·2H2O。

1.3 儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱（型號為Thermo 3131、Thermo 371），購自美國Thermo公司；實體顯微鏡（型號為SZ61）、倒置顯微鏡（型號為OLYMPUS CK40-F100），購自奧林巴斯北京銷售服務(wù)有限公司；胚胎分割儀（型號為WETZLAR DC-3 Links），購自美國AB公司；恒溫臺（型號為HP-4 530），購自日本富士平工業(yè)株式會社；移液槍（型號為Eppendorf Research plus 200 mL），購自Eppendorf中國有限公司；電冰箱（型號為BCD-458WDVMU1），購自青島海爾股份有限公司；超凈工作臺（型號為ZHJH-C1109B），購自上海智城分析儀器制造有限公司；高精度數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號為HH-4），購自上海力辰邦西儀器科技有限公司；胚胎移植槍（型號為1801-1），購自日本Misawa公司。

1.4 試驗步驟

1.4.1 篩選牛一級冷凍胚胎分割前／后體外培養(yǎng)液 取牛一級冷凍胚胎180枚，解凍后隨機(jī)分為3組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)10枚胚胎。3組分別置于胚胎保存液、mCR1aa（前期）液、mCR1aa（后期）液中培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計各組胚胎發(fā)育率。胚胎解凍方法：胚胎→空氣浴5 s→32℃水浴10 s→揩干細(xì)管→用70%酒精棉球擦拭細(xì)管，晾干→剪去細(xì)管塞→推入胚胎保存液洗3遍→解凍完成。胚胎培養(yǎng)方法：使用35 mm 平皿微滴（7 滴／皿、100μL／滴）蓋以礦物油，置于38.5℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胚胎發(fā)育率的評估方法：用實體顯微鏡觀察胚胎在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后是否出現(xiàn)囊胚腔，以重新形成囊胚腔的胚胎統(tǒng)計胚胎發(fā)育率。

1.4.2 篩選牛一級冷凍胚胎分割前培養(yǎng)時間 取牛一級冷凍胚胎210枚，解凍后隨機(jī)分為7組作為試驗組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)10枚半胚。取牛一級冷凍胚胎60枚作為對照組，重復(fù)6次，每次10枚整胚。采用1.4.1篩選出的培養(yǎng)液對解凍后的牛一級冷凍胚胎在分割前分別進(jìn)行0，15，30，45，60，90，120 min共7組培養(yǎng)，之后進(jìn)行分割，將對照組整胚和分割后的半胚培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計各組胚胎發(fā)育率。胚胎分割方法：解凍后的牛一級冷凍胚胎在胚胎分割液中吹洗3次后，放入裝有分割液滴的60 mm平皿中，將顯微分割刀固定于胚胎分割儀，調(diào)試好角度，以內(nèi)細(xì)胞團(tuán)為中心把胚胎平均分為兩部分，分別放入胚胎保存液中分割完成。胚胎解凍、胚胎培養(yǎng)和胚胎發(fā)育率的評估方法同1.4.1表述。

1.4.3 篩選牛一級冷凍胚胎半胚移植前培養(yǎng)時間 取牛一級冷凍胚胎120枚，解凍后隨機(jī)分為4組，其中2組為試驗組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)10枚半胚；另外2組為對照組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)10枚整胚。采用1.4.1篩選出的培養(yǎng)液和1.4.2篩選出的分割前培養(yǎng)時間對4組進(jìn)行操作，將2個試驗組分為不經(jīng)短暫培養(yǎng)（no short culture，NSC）組和30 min組，2個對照組分為NSC對照組和30 min對照組。之后將各組胚胎分別裝入含有胚胎冷凍液的0.25 mL細(xì)管中，在4℃冰箱放置30 min，之后在室溫（25℃）下推入胚胎保存液中洗3次，再培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計各組胚胎發(fā)育率。胚胎解凍、胚胎培養(yǎng)和胚胎發(fā)育率的評估方法同1.4.1表述，胚胎分割方法同1.4.2表述。

2.正確分析溶質(zhì)的組成。與水反應(yīng)的物質(zhì),其溶質(zhì)發(fā)生變化,如SO3溶于水后變?yōu)镠2SO4且水量減少;含結(jié)晶水的物質(zhì),如CuSO4·5H2O溶于水,水的量會增加;溶質(zhì)發(fā)生變化,如弱酸、弱堿和可水解的鹽,溶質(zhì)的離子組成會發(fā)生變化,如NaHCO3溶液中含碳物質(zhì)有三種:;再如1molNaHSO4溶于水電離出離子的物質(zhì)的量為3mol。

1.4.4 純種西門塔爾牛一級冷凍胚胎半胚移植 取純種西門塔爾牛一級冷凍胚胎100枚，解凍后隨機(jī)分為整胚、雙半胚、單半胚3組進(jìn)行移植。60枚用1.4.1篩選出的培養(yǎng)液和1.4.2篩選出的分割前培養(yǎng)時間及1.4.3篩選出半胚移植前的培養(yǎng)時間進(jìn)行操作，其中40枚進(jìn)行雙半胚移植、20枚進(jìn)行單半胚移植；剩下的40枚進(jìn)行整胚移植。將3組獲得的胚胎保存于胚胎保存液中，15 min之內(nèi)將雙半胚、單半胚、整胚用胚胎移植槍移植到發(fā)情7 d的受體牛有黃體側(cè)子宮角，并用雙半胚同側(cè)移植。統(tǒng)計受體母牛妊娠率、流產(chǎn)率、雙犢率、犢牛成活率。胚胎解凍、胚胎培養(yǎng)方法同1.4.1表述，胚胎分割方法同1.4.2表述。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用 Excel軟件進(jìn)行整理，用SPSS20軟件進(jìn)行方差分析或卡方檢驗以確定差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選牛一級冷凍胚胎分割前／后體外培養(yǎng)液

解凍180枚牛一級冷凍胚胎，分別在胚胎保存液、mCR1aa（前期）液、mCR1aa（后期）液中培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計胚胎發(fā)育率，結(jié)果見表1。

由表1可以看出：胚胎保存液組胚胎發(fā)育率極顯著低于mCR1aa（前期）液組、mCR1aa（后期）液組（P＜0.01）；mCR1aa（后期）液組發(fā)育率高于mCR1aa（前期）液組，但差異不顯著（P＞0.05）。說明mCR1aa（后期）液優(yōu)于胚胎保存液和mCR1aa（前期）液。

表1 牛一級冷凍胚胎分割前／后培養(yǎng)液篩選結(jié)果

2.2 篩選牛一級冷凍胚胎分割前培養(yǎng)時間

取210枚牛一級冷凍胚胎，解凍后分別進(jìn)行0，15，30，45，60，90，120 min培養(yǎng)后再進(jìn)行分割，另解凍60枚牛一級冷凍胚胎作為對照組，將各組半胚和對照組整胚用mCR1aa（后期）液培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計胚胎發(fā)育率，結(jié)果見表2。

表2 牛一級冷凍胚胎分割前培養(yǎng)時間篩選結(jié)果

由表2可以看出：對照組胚胎發(fā)育率與解凍后培養(yǎng)15，90 min組差異極顯著（P＜0.01）；試驗組中解凍后培養(yǎng)45 min組胚胎發(fā)育率最高，與15，90 min組差異顯著（P＜0.05），與對照組差異不顯著（P＞0.05）。說明牛一級冷凍胚胎分割前培養(yǎng)45 min優(yōu)于其他培養(yǎng)時間。

2.3 篩選牛一級冷凍胚胎半胚移植前培養(yǎng)時間

取60枚牛一級冷凍胚胎解凍后培養(yǎng)45 min，進(jìn)行胚胎二分操作，分割后的半胚分為NSC和培養(yǎng)30 min兩組，后將半胚裝入含有胚胎冷凍液的0.25 mL細(xì)管中，在4℃冰箱放置30 min，再將半胚用mCR1aa（后期）液培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計胚胎發(fā)育率。另解凍60枚牛一級冷凍胚胎不分割，分為NSC對照組和30 min對照組。篩選結(jié)果見表3。

表3 半胚移植前培養(yǎng)時間篩選結(jié)果

由表3可以看出，NSC對照組和30 min對照組胚胎發(fā)育率差異不顯著（P＞0.05），二者極顯著高于NSC、30 min組（P＜0.01），NSC組胚胎發(fā)育率極顯著高于30 min組（P＜0.01）。說明半胚移植前NSC組優(yōu)于30 min組。

2.4 純種西門塔爾牛一級冷凍胚胎半胚移植

采用篩選出的分割條件，對60枚純種西門塔爾牛一級冷凍胚胎進(jìn)行二分操作，其中雙半胚移植40頭（每頭受體同側(cè)移植2枚半胚）、單半胚移植40頭（每頭受體移植1枚半胚）、整胚移植受體40頭，統(tǒng)計妊娠率、流產(chǎn)率、雙犢率、犢牛成活率，結(jié)果見表4。

表4 純種西門塔爾牛一級冷凍胚胎半胚移植結(jié)果

由表4可以看出，3組間妊娠率、流產(chǎn)率、犢牛成活率均差異不顯著（P＞0.05），雙半胚移植的雙犢率極顯著高于整胚、單半胚移植（P＜0.01）。

3 討論

3.1 篩選牛一級冷凍胚胎分割前／后體外培養(yǎng)液

本試驗中，將牛一級冷凍胚胎解凍后在3種不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)，結(jié)果mCR1aa（前期）液組、mCR1aa（后期）液組的胚胎發(fā)育率為86.67%、90.00%，極顯著高于胚胎保存液組，mCR1aa（后期）液組胚胎發(fā)育率高于mCR1aa（前期）液組。劉鳳軍等［12］在山羊孤雌胚胎的研究中發(fā)現(xiàn)，mCR1aa培養(yǎng)液中血清添加量為10%時胚胎發(fā)育力最好。本試驗使用的mCR1aa（后期）培養(yǎng)液中FBS添加量為10%，與劉鳳軍等［12］報道的一致。其原因可能是，隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，胚胎發(fā)育傾向于依賴血清［13］，當(dāng)血清中的胚胎營養(yǎng)因素（大分子蛋白、促生長因子等）與胚胎毒性因子在培養(yǎng)液中的濃度比恰當(dāng)時才能得到較好的胚胎發(fā)育效果［12］。

3.2 篩選牛一級冷凍胚胎分割前培養(yǎng)時間

牛一級冷凍胚胎解凍后分割前培養(yǎng)45 min組胚胎發(fā)育率為85.00%，顯著高于15 min組（53.33%）和90 min組（56.67%），與對照組差異不顯著。陳煥華等［9］報道，水牛體外胚胎解凍后培養(yǎng)24 h再分割培養(yǎng)的胚胎發(fā)育率為58.33%。本試驗中，45 min組胚胎發(fā)育率優(yōu)于陳煥華等［9］的試驗結(jié)果?？赡艿脑蚴?，本試驗使用的體內(nèi)冷凍胚胎質(zhì)量、活力高于體外胚胎。胚胎分割前培養(yǎng)24 h如果應(yīng)用于生產(chǎn)，會導(dǎo)致用時過長、污染風(fēng)險增加，難以在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

3.3 篩選牛一級冷凍胚胎半胚移植前培養(yǎng)時間

NSC對照組和30 min對照組的胚胎發(fā)育率為86.67%、76.67%，2組間差異不顯著，說明NSC和短暫培養(yǎng)30 min兩種處理方法對牛一級冷凍胚胎發(fā)育率無顯著影響。但NSC組胚胎發(fā)育率為33.33%，極顯著高于30 min組，表明分割造成的損傷及分割后處理的方式是導(dǎo)致胚胎發(fā)育率差異顯著的主要因素。NSC組縮短了操作時間且胚胎發(fā)育率更高，便于產(chǎn)業(yè)化推廣。

3.4 純種西門塔爾牛一級冷凍胚胎半胚移植

本試驗中，雙半胚組、整胚組的妊娠率為52.50%、47.50%，2組間差異不顯著。裴燕等［14］報道，鮮雙半胚、鮮整胚移植妊娠率為65.45%、63.72%，凍雙半胚、凍整胚移植妊娠率為20.00%、39.29%。本試驗中的純種西門塔爾牛一級冷凍胚胎移植結(jié)果較裴燕等［14］報道的結(jié)果有很大提高。這可能是由于分割前冷凍胚胎短暫培養(yǎng)45 min，使冷凍損傷得到較好的修復(fù)，因此解凍后短暫培養(yǎng)45 min再分割的胚胎移植能夠獲得產(chǎn)業(yè)化可接受的移植妊娠率。本試驗中，單半胚組妊娠率為32.50%，低于雙半胚組與整胚組。清家升等［15］報道，每頭受體牛移植2枚半胚和1枚半胚的胚胎著床率分別為53.8%、48.4%。雙半胚組妊娠率高于單半胚組妊娠率，與本試驗結(jié)果一致。其原因可能是單半胚細(xì)胞數(shù)量少、妊娠識別信號弱，導(dǎo)致妊娠率下降。雙半胚組流產(chǎn)率（14.29%）高于整胚組和單半胚組，原因可能是2枚半胚著床于同側(cè)子宮角產(chǎn)生競爭，導(dǎo)致妊娠終止率上升。本試驗雙半胚組雙犢率為38.89%；馮春濤等［8］報道，鮮雙半胚雙犢率為36.9%。說明采用篩選后的分割方法使冷凍胚胎也可達(dá)到與鮮雙半胚相近的雙犢率。本試驗中雙半胚組、整胚組的犢牛成活率為88.00%、94.44%。裴燕等［14］報道，雙半胚與整胚組犢牛成活率為72% 、90%；而馮春濤等［8］研究發(fā)現(xiàn)，雙半胚與整胚的犢牛成活率為84.3%、93.3%。雙半胚移植的犢牛成活率均低于整胚移植。這可能是因為雙半胚移植產(chǎn)的犢牛體質(zhì)較弱，需要加強(qiáng)雙半胚移植后代犢牛后期護(hù)理，提高犢牛成活率。

4 結(jié)論

純種西門塔爾牛冷凍胚胎解凍后用mCR1aa（后期）液培養(yǎng)45 min再分割，獲得的半胚直接移植，可有效提高冷凍胚胎利用效率和分割后半胚移植妊娠率。