張志剛，王 仲，張亞妮，龍 同，萬中義，王開梅，方 偉*，柯少勇*

（1.國家生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北省農(nóng)業(yè)科學院，武漢 430064；2.武漢華夏理工學院生物與制藥工程學院，武漢 430223）

蚜蟲是世界性的農(nóng)業(yè)害蟲，它寄主范圍廣、繁殖快、危害嚴重，常聚集在植株的芽、花蕾、嫩葉或嫩枝上，以尖利的口器刺吸植物汁液。蚜蟲危害輕者引起植物營養(yǎng)惡化、生長緩慢、生長畸形、落葉、萎蔫，嚴重危害時導致植物枯死，同時還傳播多種病毒病。蚜蟲的防治歷來是全世界農(nóng)林業(yè)蟲害防治的重要內(nèi)容[1]，因此開發(fā)高效、低毒、廣譜的新型化學殺蚜劑，也是當務之急[2-4]。

化學農(nóng)藥作為害蟲綜合治理過程的重要手段，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著不可替代的作用。此外，化學農(nóng)藥還被廣泛用于林業(yè)、水產(chǎn)、畜牧業(yè)、衛(wèi)生害蟲及傳染病的防控等領域。隨著國家環(huán)保力度的加強，在害蟲綜合治理過程中更傾向于采用生物防治方法，但在今后相當長的一個時期內(nèi)化學防治仍是害蟲防控的重要手段[5-7]。農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展、環(huán)境保護、抗性治理和知識產(chǎn)權(quán)保護等均從不同的方面要求不斷加強新農(nóng)藥的創(chuàng)新研究，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高效和環(huán)境友好型“綠色生態(tài)農(nóng)藥”。鑒于此，為了尋求適合用于害蟲綜合治理的綠色生態(tài)型農(nóng)用化學品，筆者通過化學生物信息學等分子合理設計方法，獲得了含雙酰胺單元的雜環(huán)亞胺衍生物[8]，部分化合物具有顯著的殺蚜蟲活性。為了進一步提高該類化合物的生物利用度，降低其實際用量，筆者對高活性化合物HBERC1684進行了相應的劑型探索，并對其進行了系統(tǒng)的活性評價及比較，確定其較佳的應用方法，以期為該類化合物的開發(fā)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

液相色譜分析采用Waters ACQUITY UPLC H-CLASS PDA（Waters）及Waters 2695HPLC分析儀（Waters,Milford,MA,USA）；所用試劑甲醇、醋酸、三氟乙酸、磷酸、鹽酸等均為市售分析純，上海國藥集團；化合物HBERC1684的制備參考文獻[8]進行；供試害蟲為實驗室常規(guī)飼養(yǎng)的東方豆蚜，將蚜蟲置于溫度為25℃、相對濕度為40%～60%的養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)，測試前一天，將蚜蟲轉(zhuǎn)接到1.5 cm高的新豆苗上，每顆豆苗上的接蟲量約30～40頭。

1.2 目標化合物鹽的制備

將5 mmol HBERC1684溶于30 mL無水甲醇中，冰水浴條件下緩慢滴加2 當量的酸（醋酸、三氟乙酸、磷酸、鹽酸），然后低溫攪拌約10～15 min，撤去冰浴，約30 min后，體系析出大量白色固體，繼續(xù)攪拌約2～4 h，減壓抽濾，真空干燥得產(chǎn)物。

1.3 目標化合物可溶粉劑制備

將5 g原藥在70～80℃的條件下溶解于約少量的甲醇溶液中，直至完全溶解為黃色透明溶液。將45 g聚乙二醇6000加入蒸發(fā)皿中，在水浴條件下加熱至完全熔化為無色透明液體。將原藥溶解完全的甲醇溶液趁熱加入聚乙二醇液體中，并迅速攪拌均勻。在水浴上繼續(xù)加熱至混合物體積不再改變?yōu)橹?，立即放入冰過的白瓷盤中均勻平鋪，并迅速放入冰箱冷凍保存24 h。取出后放入30℃恒溫烘箱中干燥，研磨，在60目下過篩得到白色粉末狀物質(zhì)。

1.4 可溶粉劑含量測定

稱取一定量的樣品，用少量甲醇溶解后，定容到10 mL容量瓶。在295 nm波長下測定吸光度，以相同質(zhì)量的空白制劑作為空白對照。另取一定量對照藥品，用甲醇溶解后，定容到10 mL容量瓶，在295 nm波長下測定吸光度。按式（1）計算樣品質(zhì)量濃度。

式中：A樣品、A空白、A標樣、A甲醇分別為樣品、空白對照、標樣及甲醇的吸光度值；C樣品為樣品的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.5 可溶粉劑的性能測試

參考劑型性能測試標準方法對所制備的可溶粉劑進行了相關性能的測試，主要包括細度、全溶解時間及熱貯穩(wěn)定性等。

1.5.1 細度測定

采用干篩法，詳細操作步驟按照GB/T 16150—1995《農(nóng)藥粉劑、可濕性粉的細度測定方法》進行。

1.5.2 全溶解時間測定

稱取5.0 g樣品于1 000 mL燒杯中，放置在25±1℃恒溫槽中，加入25℃蒸餾水500 mL（相當于稀釋100倍），立即打開秒表，同時開啟攪拌器，以60～70 r/min的速度攪拌，分別于2 min、3 min、4 min、……吸取上層液10 mL，至分析溶液中有效成分的含量不再增加，所用時長即為全溶解時間。

1.5.3 熱貯穩(wěn)定性測定

參照GB/T 19136—2003《熱貯穩(wěn)定性測定方法》。將20 g試樣放入燒杯，不加任何壓力，使其鋪成等厚度平滑均勻?qū)?。將圓盤壓在試樣上面，置燒杯于烘箱中，在恒溫箱（54±2℃）中放置14 d。取出燒杯，拿出圓盤，放入干燥器中，使試樣冷卻至室溫。于24 h之內(nèi)檢測有效成分含量。根據(jù)貯存前含量和貯存后含量求出分解率，有效成分分解率按式（2）計算。

1.6 活性評價

參照NY/T 1154.14—2008《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準則殺蟲劑第14部分：浸葉法》[9-10]，對目標化合物HBERC1684及其劑型進行了殺蟲活性的系統(tǒng)評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 HBERC1684鹽的制備及液相色譜分析

為了增加化合物HBERC1684的溶解性，提高其生物利用度，結(jié)合其結(jié)構(gòu)特征，考慮制備其相應的鹽。選擇醋酸、三氟乙酸、磷酸、鹽酸等進行了成鹽反應探索。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，在三氟乙酸和鹽酸等強酸的作用下，化合物很快水解，保留時間分別為1.17、1.18 min；而在醋酸及磷酸條件下，化合物能夠穩(wěn)定存在，保留時間分別為1.82、1.83 min。

2.2 HBERC1684可溶粉劑的制備及含量測定

化合物HBERC1684為脂溶性化合物，可溶于甲醇，微溶于乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等，難溶于水。由于其在水中溶解度差，嚴重影響其在生產(chǎn)實踐中的應用，很容易導致藥效不穩(wěn)定。在化合物的劑型優(yōu)化過程中，采用常規(guī)固體分散劑如環(huán)糊精、聚乙二醇4000及聚乙二醇6000等進行了試驗探索，但結(jié)果表明環(huán)糊精和聚乙二醇4000 對化合物HBERC1684的分散效果很差。因此，采用聚乙二醇6000為分散劑，經(jīng)過多次配方和制備過程優(yōu)化，成功研制化合物HBERC1684的可溶粉劑（10%含量），該制劑在質(zhì)量濃度為1 g/L時，溶液澄清透明，放置長時間無析出，表明該制劑大大提高化合物在水中溶解度，為進一步應用研究打下良好基礎。

圖1 化合物HBERC1684 4 種鹽的超高效液相色譜分析

采用紫外分光光度法對該制劑進行了含量的測定。通過紫外掃描圖譜選取295 nm作為含量測定波長（圖2）。配制一系列不同濃度的HBERC1684溶液，測定紫外吸收度，發(fā)現(xiàn)在1～6 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好的線性關系，其線性回歸線方程為y=0.131 3x＋0.069 7，R2=0.999 5，滿足含量測定要求，結(jié)果見圖3。

圖2 化合物HBERC1684 的紫外光譜分析

圖3 化合物HBERC1684 線性關系圖

平行稱取3份樣品，用所述方法測定紫外吸收度并計算含量，所制備的可溶粉劑的實際含量為8.96%，標準偏差為3.5%，表明所制備的可濕性粉劑的含量穩(wěn)定，均一性較好。另外制劑回收率為89.6%，可能是在制備過程中樣品殘留導致。

2.3 HBERC1684可溶粉劑的性能測試

在上述制備的劑型基礎上，對所制備的可溶粉劑進行了細度、全溶解時間及熱貯穩(wěn)定性等基本性能測試。結(jié)果表明，采用干篩法進行HBERC1684可溶粉劑的細度測定，實測值為100%通過80目；全溶解時間測試表明所制備的粉劑全溶解時間為3 min；熱貯穩(wěn)定性測試表明，所制備的劑型產(chǎn)品在54±2℃溫度下貯存14 d后的分解率為3%～8%，均不超過10%，根據(jù)FAO標準規(guī)定，在54±2℃溫度下貯存14 d后，有效成分的含量下降率小于10%，一般能保證產(chǎn)品生產(chǎn)后兩年期間的熱貯穩(wěn)定性，因此，該制劑符合可溶粉劑熱貯穩(wěn)定性要求。

2.4 殺蟲活性分析

化合物HBERC1684的內(nèi)吸活性較差，且溶解性較差，為了達到提高化合物內(nèi)吸活性及增加其溶解性的目的，將化合物分別制備成相應的磷酸鹽（HBERC1684-H3PO4）及醋酸鹽（HBERC1684-HAc）。母體化合物及其相應鹽的殺蟲活性測試結(jié)果見表1。針對東方豆蚜的測試結(jié)果表明，化合物HBERC1684具有顯著的殺蚜蟲活性，與對照藥物吡蟲啉的活性相當；從表1也可知，HBERC1684的磷酸鹽活性與母體化合物HBERC168相當，而HBERC1684的醋酸鹽的活性優(yōu)于母體化合物，可能由于磷酸鹽分子量相對較大，導致其同等摩爾質(zhì)量的化合物量較大，溶解度相對低于其醋酸鹽，因而活性略低于醋酸鹽。

化合物HBERC1684為脂溶性化合物，由于其在水中溶解度差，嚴重影響其在生產(chǎn)實踐中的應用。經(jīng)過多次劑型優(yōu)化，成功研制化合物HBERC1684的可溶粉劑（含量10%）。為了探討該劑型的進一步應用，我們測試了其相關的殺蟲活性，測試結(jié)果見表2。

從表2可見，10%HBERC1684可溶粉劑呈現(xiàn)出明顯優(yōu)于原藥及對照藥物吡蟲啉的殺蟲活性，該可溶粉劑在0.312 5 μg/mL的較低濃度下，仍具有較好的殺蟲活性（50%～70%）。在10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL的較高測試濃度下，豆芽生長狀態(tài)明顯較好，而在較低濃度下，由于蚜蟲的危害導致豆芽生長較矮。

通過上述活性數(shù)據(jù)分析可知，化合物的劑型對于化合物活性的影響較大，劑型的不斷優(yōu)化改進有望提高藥效。

表1 化合物HBERC1684 及其磷酸鹽、醋酸鹽和吡蟲啉的殺蚜蟲活性

表2 化合物HBERC1684（95%原藥）、HBERC1684（10%可溶粉劑）及吡蟲啉的殺蚜蟲活性

3 小結(jié)及討論

本文以具有自主知識產(chǎn)權(quán)的化合物HBERC1684為基礎，進行了化合物的劑型優(yōu)化及殺蟲活性探討。通過試驗研究，成功制備化合物HBERC1684的10%可溶粉劑，活性測試結(jié)果表明，該劑型能夠明顯提高藥劑的生物活性，從而降低實際用量，并且其殺蟲活性要明顯優(yōu)于對照藥劑吡蟲啉，為該化合物的進一步應用開發(fā)研究打下了良好基礎。

蚜蟲是當前最常見的農(nóng)林業(yè)害蟲之一，每年對多種農(nóng)作物、蔬菜、果樹及園林植物危害嚴重，針對此類害蟲的防治仍然離不開化學防治。而新化合物HBERC1684能夠在較低劑量下殺滅蚜蟲，具有較好的應用前景，可作為有效成分應用于農(nóng)林業(yè)害蟲的綜合防控。