李婉華，李錫晶，張婷，沈洪昇，張桂賢，劉洪斌

1天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070; 2天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所

肝內(nèi)膽汁淤積是指由于多種原因引起膽汁分泌受阻的病理狀態(tài)，持續(xù)的肝內(nèi)膽汁淤積使膽汁流入十二指腸減少，導(dǎo)致腸道膽汁缺乏和血中膽汁成分增多，從而引發(fā)膽汁淤積性肝病及相應(yīng)的全身癥狀[1]。常見(jiàn)的膽汁淤積性肝病包括原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、自身免疫性肝病和藥物性膽汁淤積等。目前臨床上尚無(wú)療效確切且穩(wěn)定的治療藥物[2]。在中醫(yī)學(xué)中，膽汁淤積性肝病屬“黃疸”范疇[3]，治療多從清熱利濕退黃角度出發(fā)。活血清解靈由茵陳、丹參、大黃、白頭翁、敗醬草、甘草六味中藥組成，茵陳清熱利濕，利膽退黃，丹參活血祛瘀；白頭翁與敗醬草清熱解毒，祛瘀排膿，大黃逐瘀通經(jīng)，利濕退黃，甘草味甘性平[4]。膽汁是一種由肝細(xì)胞生成、膽管上皮細(xì)胞吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入十二指腸參與代謝的復(fù)雜水溶液[5]。膽汁酸是膽汁重要的組成成分，其由膽固醇合成，在驅(qū)動(dòng)膽汁流動(dòng)，清除體內(nèi)代謝廢物，促進(jìn)脂質(zhì)的消化吸收和調(diào)節(jié)膽固醇代謝等方面起重要作用[6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸作為一種信號(hào)分子通過(guò)與法尼醇受體(FXR)、G蛋白偶聯(lián)受體(TGR5)的結(jié)合及通過(guò)肝腸循環(huán)廣泛調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、免疫功能和腸道菌群[7～9]。既往少見(jiàn)對(duì)于膽汁淤積時(shí)各膽汁酸成分及膽汁酸代謝的研究。2018年9月～2019年10月，我們通過(guò)測(cè)定膽汁淤積性大鼠膽汁中18種膽汁酸成分含量，探討活血清解靈對(duì)膽汁淤積性肝病膽汁酸代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)Wistar雄性大鼠36只，體質(zhì)量(220±20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)11400700347254，飼養(yǎng)環(huán)境12 h光照與黑暗交替循環(huán)，溫度(22±3)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飼料和水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。藥物與試劑：ANIT購(gòu)自美國(guó)Alfa Aesar公司；復(fù)方甘草酸苷膠囊購(gòu)自瑞陽(yáng)制藥有限公司；活血清解靈配方顆粒由茵陳、丹參、大黃、白頭翁、敗醬草、甘草組成，購(gòu)自北京康仁堂藥業(yè)有限公司；石膽酸(LCA)、去氧膽酸(DCA)、甘氨石膽酸(GLCA)、甘氨熊去氧膽酸(GUDCA)、甘氨豬去氧膽酸(GHDCA)購(gòu)自加拿大Toronto Research Chemicals公司；鵝去氧膽酸(CDCA)、膽酸(CA)、熊去氧膽酸(UDCA)、豬去氧膽酸(HDCA)、?；切苋パ跄懰?TUDCA)、?；秦i去氧膽酸(THDCA)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；?；鞘懰?TLCA)、?；侨パ跄懰?TDCA)、?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)、?；悄懰?TCA)、甘氨去氧膽酸(GDCA)、甘氨鵝去氧膽酸(GCDCA)、甘氨膽酸(GCA)、去氫膽酸(DHCA，內(nèi)標(biāo))、色譜純甲醇和甲酸均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，抗體NTCP和羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，抗體tubulin和羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)proteintech公司。儀器：島津超高效液相色譜儀 LC-30A 與三重四極桿質(zhì)譜儀 LCMS-8040 聯(lián)用系統(tǒng)；色譜柱：InertSustainC18柱(3.0 mm×100 mm, 3.0 μm)；AB135-S型十萬(wàn)分之一電子分析天平(Mettler Toledo公司)；KQ5200B 型超聲波清洗器 (功率200 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀有限公司)，TBA2000-FR全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝公司)。

1.2 動(dòng)物造模及給藥 將48只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白組、模型組、復(fù)方甘草酸苷膠囊組、活血清解靈低、中、高劑量組。ANIT用橄欖油溶解，以ANIT(100 mg/kg)灌胃1次，制備膽汁淤積性肝損傷模型。復(fù)方甘草酸苷膠囊及活血清解靈配方顆粒均用蒸餾水加熱溶解,復(fù)方甘草酸苷膠囊組予復(fù)方甘草酸苷膠囊22.5 mg/kg，活血清解靈低、中、高劑量組分別給予活血清解靈4.1、8.1、16.2 g/kg，在造模后開(kāi)始灌胃給藥，連續(xù)4 d。

1.3 標(biāo)本采集及處理 給藥第5天，3%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，大鼠取仰臥位固定，開(kāi)腹，膽管插管取膽汁，儲(chǔ)存于-80 ℃用于LC-MS/MS檢測(cè)各膽汁酸含量。腹主動(dòng)脈取血，靜置凝固后離心取上清送至天津市南開(kāi)醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)總膽紅素(IBI)和總膽汁酸(TBA)含量，留取大鼠肝組織儲(chǔ)存于-80 ℃用于Western blotting實(shí)驗(yàn)。

1.4 膽汁酸測(cè)定 通過(guò)高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定膽汁酸成分含量。①空白膽汁的制備:將大鼠膽汁(200 μL)用生理鹽水稀釋10倍，然后加入0.3 g活性炭，渦旋1 min，4 ℃過(guò)夜，將混合物離心(12 000 r/min)20 min，收集上清液，重復(fù)2次，將該上清液作為無(wú)膽汁酸空白膽汁[10]。②標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確稱(chēng)量各標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用空白膽汁分別將其配置成1 mg/mL單標(biāo)儲(chǔ)備液，從各單標(biāo)儲(chǔ)備液中移取一定量用空白膽汁配制成混標(biāo)儲(chǔ)備液，DCA、LCA配制濃度為2 μg/mL，TUDCA、GUDCA、THDCA、GHDCA、UDCA、HDCA、TLCA、GLCA、CDCA配制濃度為4 μg/mL，CA、GCDCA、TDCA、GDCA配制濃度為8 μg/mL，TCA、GCA配制濃度為16 μg/mL，TCDCA 配制濃度為24 μg/mL，內(nèi)標(biāo)DHCA配制濃度為400 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)溶液均于4 ℃條件下儲(chǔ)存。③樣品處理:移取膽汁樣品20 μL至2 mL離心管中，用生理鹽水稀釋10倍，加入10 μL內(nèi)標(biāo)，加入600 μL乙腈，渦旋1 min，離心(12 000 r/min)10 min，取上清于氮?dú)饬飨麓蹈?，取流?dòng)相200 μL復(fù)溶，離心(12 000 r/min)10 min，取上清過(guò)濾膜，取70 μL移至進(jìn)樣瓶中[11]。④色譜條件:色譜柱：InertSustainC18柱(3.0 mm×100 mm , 3.0 μm)，流動(dòng)相：0.01%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)梯度洗脫(0～20 min，60～70%B，20～30 min，70～90%B)，流速：0.4 mL/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。⑤質(zhì)譜條件:島津LCMS-8040液質(zhì)聯(lián)用儀，離子源: ESI，負(fù)離子模式，加熱模塊溫度: 400 ℃，DL溫度: 250 ℃，霧化氣流速: 3.0 L/min，干燥氣流速: 15 L/min，離子源電壓: 4.0 kV，掃描模式: 多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)。

1.5 肝組織中NTCP蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取肝組織稱(chēng)重，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，在冰上進(jìn)行超聲破碎，13 000 r/min離心10 min，取上清，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，將蛋白提取液于95 ℃金屬浴中加熱15 min，每個(gè)孔蛋白上樣量為50 μg，蛋白用SDA-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，各條帶分別孵育一抗抗體NTCP(1∶1 000)和α-tubulin(1∶5 000)4 ℃過(guò)夜，洗膜，室溫下分別孵育羊抗兔二抗(1∶8 000)，羊抗鼠二抗(1∶1 000)1 h 30 min，洗膜，加入ECL發(fā)光液于化學(xué)發(fā)光分析儀中曝光。以α-tubulin為標(biāo)準(zhǔn)化參考物，用Image J軟件測(cè)量各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組血清IBI和TBA水平比較 見(jiàn)表1。

表1 各組血清IBI和TBA水平比較

注：與空白組相比，*P<0.01;與模型組相比，#P<0.05,##P<0.01。

2.2 活血清解靈對(duì)膽汁中膽汁酸濃度的影響 見(jiàn)表2。

表2 各組膽汁酸濃度比較

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01;-表示未測(cè)出。

2.3 活血清解靈對(duì)大鼠肝組織NTCP蛋白表達(dá)影響 對(duì)照組、模型組、復(fù)方甘草酸苷膠囊組、活血清解靈低劑量組、活血清解靈中劑量組、活血清解靈高劑量組NTCP相對(duì)表達(dá)量分別為1.34±0.08、0.73±0.17、0.93±0.23、0.88±0.23、1.08±0.09、1.26±0.04，與對(duì)照組比較，模型組NTCP表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，活血清解靈高劑量組NTCP表達(dá)增高(P<0.05)。

3 討論

膽汁淤積性肝病病因復(fù)雜，常見(jiàn)病因包括病毒、細(xì)菌、藥物/毒物、寄生蟲(chóng)和自身免疫等。其臨床癥狀多表現(xiàn)為黃疸、皮膚瘙癢、脂肪瀉、乏力和骨質(zhì)疏松。病情發(fā)展最終常導(dǎo)致高膽紅素血癥，重者可導(dǎo)致肝衰竭[12]?；钛褰忪`通過(guò)緩解膽汁淤積，降低血膽汁酸濃度，從而減輕膽汁淤積引起的臨床癥狀和肝臟損傷。

膽汁酸作為一種兩親性的清潔劑類(lèi)分子，是膽固醇在肝臟代謝的終產(chǎn)物，當(dāng)其在肝臟內(nèi)的濃度積累到一定程度后，會(huì)產(chǎn)生肝細(xì)胞毒性，其毒性大小受到膽汁酸分子疏水性的影響。當(dāng)發(fā)生膽汁淤積時(shí)，膽汁酸不能正常轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入膽汁，而是通過(guò)肝細(xì)胞回流進(jìn)入血液，導(dǎo)致膽汁中的膽汁酸成分減少，而血中的膽汁酸濃度則會(huì)增加10～20倍。本研究選擇了常見(jiàn)的18種膽汁酸進(jìn)行檢測(cè)，其中包括6種與甘氨酸結(jié)合的膽汁酸和6種與?；撬峤Y(jié)合的膽汁酸。在膽汁和和肝臟的膽汁酸池中，與牛磺酸和甘氨酸結(jié)合的膽汁酸占比超過(guò)90%[13]。本實(shí)驗(yàn)中共檢出16種膽汁酸，其中LCA和HDCA在膽汁中含量較低，僅在正常組中測(cè)出。除TCDCA外，其余13種膽汁酸在模型組中均有不同程度降低，在經(jīng)過(guò)活血清解靈治療后均顯示出上升趨勢(shì)，盡管其中部分膽汁酸上升趨勢(shì)不明顯。TCDCA是一種強(qiáng)疏水性膽汁酸，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，TCDCA與其余13種膽汁酸表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，模型組中顯著增高，過(guò)去研究普遍認(rèn)為膽汁酸的毒性作用會(huì)造成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的損傷，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種細(xì)胞毒性作用可能是由某些特定的膽汁酸引起的，TCDCA在膽汁中的累積會(huì)進(jìn)一步加重膽管上皮細(xì)胞的損傷，進(jìn)而引起膽管結(jié)構(gòu)的破壞，而活血清解靈高劑量組的TCDCA表現(xiàn)出顯著下降趨勢(shì)，表明其有效干預(yù)了膽汁酸譜的組成，降低了具有細(xì)胞毒性的膽汁酸濃度，從而有效保護(hù)了肝損傷。

研究證明，部分中藥及中藥成分可通過(guò)調(diào)節(jié)膽汁酸代謝相關(guān)信號(hào)通路影響膽固醇-膽汁酸的代謝[14]。膽汁酸在肝內(nèi)代謝的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括負(fù)責(zé)膽汁酸向肝外轉(zhuǎn)運(yùn)的膽鹽輸出泵(BSEP)和肝腸循環(huán)中負(fù)責(zé)膽汁酸經(jīng)門(mén)靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)入肝的NTCP。本實(shí)驗(yàn)選用的造模藥物ANIT可顯著抑制BSEP的活性[15]，使得膽汁酸流入膽汁障礙。而Western blotting結(jié)果表明，模型組中NTCP含量顯著降低，顯示膽汁酸在肝腸循環(huán)回流入肝時(shí)出現(xiàn)了轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，從而進(jìn)一步加重了膽汁酸在血清中的累積，而經(jīng)活血清解靈治療后，NTCP含量顯著增高，膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙得到了有效緩解。

綜上所述，活血清解靈可通過(guò)促進(jìn)膽汁酸的代謝而有效改善肝內(nèi)膽汁淤積的病理狀態(tài)。