劉賽，李建領(lǐng)，2，楊孟可，喬海莉，郭昆，徐榮，徐常青*，陳君*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110

寧夏枸杞LyciumbarbarumL.為茄科Solanaceae枸杞屬Lycium多年生落葉灌木，是我國西北地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物，其干燥成熟果實枸杞子是我國傳統(tǒng)名貴中藥材[1]。寧夏枸杞在生長過程中極易遭受多種病蟲為害，枸杞木虱BactericeragobicaLoginova是寧夏枸杞產(chǎn)區(qū)的主要害蟲之一，在我國西北枸杞主產(chǎn)區(qū)普遍嚴(yán)重發(fā)生[2]。枸杞木虱每年發(fā)生4～5代，成蟲活躍善跳，1齡若蟲活動，2齡后固定在葉背取食，導(dǎo)致葉片干枯、早落，若蟲分泌物也易招致煤污病的發(fā)生[3]，嚴(yán)重時導(dǎo)致枝條干枯，樹勢衰弱，抽發(fā)新枝困難甚至整株病死，產(chǎn)量絕收[4]。此外，枸杞木虱還是枸杞另一重要害蟲枸杞癭螨的攜播越冬寄主[5-6]，枸杞癭螨能否爆發(fā)與枸杞木虱種群數(shù)量密切相關(guān)[7-8]。枸杞木虱對枸杞生產(chǎn)威脅極大，嚴(yán)重影響了枸杞子的產(chǎn)量和質(zhì)量，已成為制約枸杞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因子。

木虱為刺吸式口器害蟲，主要在葉片、嫩梢和嫩芽上吸食寄主植物汁液，并不會直接破壞或殺死植物細(xì)胞；但由于其繁殖量大，種群數(shù)量多，過度吸食會對寄主植株產(chǎn)生影響[9]。枸杞木虱若蟲期體型微小、體色淡，在葉背隱蔽取食，發(fā)生初期不易察覺，生產(chǎn)中通常不注意防控，使得該蟲極易爆發(fā)成災(zāi)；而且在后期即便將該蟲有效防控，其造成的損害也不可逆，嚴(yán)重影響枸杞樹當(dāng)年及來年發(fā)枝。目前，枸杞木虱對枸杞的影響僅見防治及產(chǎn)量損失等宏觀研究[3，10]，對枸杞根系與生理生化等指標(biāo)的影響少見報道，本研究以寧夏枸杞實生苗為試驗材料，通過人工接種枸杞木虱，對比分析枸杞木虱取食為害過程對寧夏枸杞根系生長、光合作用及生理生化的影響，分析闡明枸杞木虱的為害特點，為枸杞木虱的科學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料

1.1 供試植株與蟲源

枸杞實生苗：由寧夏枸杞(寧杞1號)種子培育，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[(25±2)℃，60%±5% RH，16 h L∶8 h D]，至15～20片葉時備用。

枸杞木虱：采自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所枸杞試驗田，室內(nèi)光照培養(yǎng)箱(溫濕度、光照同上)中枸杞實生苗上繁育保存。

1.2 儀器設(shè)備

光照培養(yǎng)箱(PRX-450 D，寧波賽福實驗儀器有限公司)；十萬分之一天平(XSE 205，梅特勒-托利多國際有限公司)；高速冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；DHG-9143BS-Ⅲ烘箱(無錫市蘇嘉試驗設(shè)備廠)；JXFSTPRP-CL全自動樣品研磨儀(上海實業(yè)發(fā)展有限公司)；紫外可見光分光光度計(UV-2550，日本島津公司)；調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)IMAGING-PAM(德國WALZ公司)；佳能LiDE210掃描儀、WinFOLIA葉面積分析系統(tǒng)(Regent Instruments Inc.)；Digimizer圖像分析系統(tǒng)(MedCalc Software)。

1.3 化學(xué)試劑

總蛋白試劑盒(A045-2)、植物可溶性糖試劑盒(A145)、過氧化物酶(POD)試劑盒(A084-3)、苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)試劑盒(A137)、多酚氧化酶(PPO)試劑盒(A136)、植物總酚試劑盒(A143)、植物類黃酮試劑盒(A142)均由南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 枸杞木虱接種

室內(nèi)培育帶有大量2齡木虱若蟲的葉片，接種于健康枸杞苗，使木虱若蟲主動轉(zhuǎn)移至枸杞葉片。24 h后檢查并保留2齡木虱若蟲50～60頭，去除多余若蟲。對照組為同期長勢一致的健康枸杞苗。

2.2 寧夏枸杞生長指標(biāo)測定

接種木虱后第3、6、9、12天取樣，每次每處理取5株枸杞苗作為5個重復(fù)。取樣時將幼苗整株取出，根部浸于水中，輕抖去除泥土，洗凈后以蒸餾水潤洗，平鋪于試驗臺用濾紙吸干水分。使用掃描儀獲取葉片及根系圖像，聯(lián)合使用WinFOLIA和Digimizer軟件對葉片面積及根系長度進(jìn)行測量分析。掃描結(jié)束后，測定地上部分及根系鮮質(zhì)量，然后將其置于80 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，測定干質(zhì)量。

2.3 葉片光合參數(shù)測定

接種木虱后第3、6、9、12天進(jìn)行葉綠素?zé)晒鉁y定，每次每處理取10株枸杞苗作為10個重復(fù)。測定前將枸杞苗暗處理30 min。接種第12天后，將處理與對照葉片同時置于葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)載物盤，獲得熒光參數(shù)成像。測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)時，活化光打開前首先測定1次初始熒光值(Fo)和最大熒光值(Fm)，然后在自然光照下啟動系列飽和脈沖，施加多次飽和閃光脈沖[6000 μmol·(m2·s-1)-1，脈沖時間為2 s]，每隔20 s測定1次，直至脈沖終止，取最后6次飽和閃光脈沖測量值的平均值，計算PSⅡ?qū)嶋H光合效率Yield，計算方法見參考文獻(xiàn)[11]。

2.4 生理生化測定材料取樣及測定

取樣：接種木虱后第3、6、9、12天分別取樣，每次每處理5個重復(fù)，每個重復(fù)采集6株枸杞苗。取樣前，清除葉片上枸杞木虱若蟲及蜜露，以蒸餾水沖洗去除各處理葉片的葉表灰塵，水分揮干后沿葉柄基部剪下葉位相近葉片，將葉片剪碎混勻，稱量后裝入離心管，迅速投入液氮中速凍30 s，置于-80 ℃冰箱保存。

樣品前處理：每個測定指標(biāo)5個重復(fù)，每個重復(fù)取樣100 mg，使用全自動樣品研磨儀在60 HZ、-20 ℃條件下振蕩研磨90 s。

測定方法：可溶性蛋白測定使用總蛋白試劑盒(A045-2)，反應(yīng)后在595 nm處測定吸光度?？扇苄蕴菧y定使用植物可溶性糖試劑盒(A145)，反應(yīng)后在620 nm處測定吸光度。POD測定使用POD試劑盒(A084-3)，反應(yīng)后在420 nm處測定吸光度。PAL測定使用PAL試劑盒(A137)，反應(yīng)后在290 nm處測定吸光度。PPO測定使用PPO試劑盒(A136)，反應(yīng)后在420 nm處測定吸光度?？偡訙y定使用植物總酚試劑盒(A143)，反應(yīng)后在760 nm處測定吸光度。類黃酮測定使用植物類黃酮試劑盒(A142)，反應(yīng)后在502 nm處測定吸光度。各測定指標(biāo)的具體操作方法參照相應(yīng)試劑盒使用說明。

2.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS(v21，IBM)進(jìn)行顯著性分析。采用t檢驗法(t-test)對不同處理總蛋白，可溶性糖，植物POD、PAL、PPO活性，植物總酚，植物總黃酮，葉綠素?zé)晒鈪?shù)及葉片面積、根系長度，地上部分和地下部分鮮質(zhì)量、干質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。*P<0.05,**P<0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 枸杞木虱對枸杞植株生長的影響

枸杞木虱為害可顯著影響寧夏枸杞植株的生長。接種第3天，枸杞葉片面積和根系長度變化并不顯著，隨著接種天數(shù)的增加，枸杞木虱取食量逐漸增加，枸杞葉片及根系生長與對照相比受到顯著抑制，第12天時，葉片面積和根系長度分別比對照減少了54.7%和47.3%。枸杞木虱為害顯著抑制了枸杞植株地上、地下部分鮮質(zhì)量及干物質(zhì)積累，隨為害時間的延長，植株地上、地下部分生長受到持續(xù)抑制，至第12天時，枸杞地上、地下部分鮮質(zhì)量分別比對照組減失了52.1%和62.0%，干質(zhì)量分別比對照組減失了60.0%和60.6%(見圖1)。

3.2 枸杞木虱對枸杞葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

枸杞木虱為害可導(dǎo)致枸杞葉片光合效率下降(見表1)。Fo、Fm和PSⅡ?qū)嶋H光合效率Yield在接種枸杞木虱第3天與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但隨著枸杞木虱接種天數(shù)的增加，F(xiàn)o、Fm和Yield開始顯著下降，至第12天時，F(xiàn)o、Fm和Yield分別比對照下降了15.7%，37.5%和28.8%。接種枸杞木虱第12天時，同一葉片不同部位之間各熒光參數(shù)有所差異(見圖2)，葉片基部光合能力高于葉尖，表現(xiàn)出熒光異質(zhì)性。枸杞木虱降低了枸杞葉片光合能力，同時加劇了葉片基部與葉尖之間的差異。

注：A. 枸杞木虱為害對枸杞葉片面積和根系長度的影響；B. 枸杞木虱為害對枸杞植株地上、地下部分鮮質(zhì)量的影響；C. 枸杞木虱為害對枸杞植株地上、地下部分干質(zhì)量的影響；*或#P<0.05；**或##P<0.01；ns表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。圖1 枸杞木虱為害對枸杞植株生長的影響

表1 枸杞木虱對枸杞葉片熒光參數(shù)的影響

注：**差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：CK為對照葉片；P為木虱為害的葉片；每個子圖上的數(shù)字為實際測定值，單位為任意單位。圖2 枸杞木虱接種第12天后枸杞葉片熒光參數(shù)成像

3.3 枸杞木虱對枸杞葉片生理生化的影響

枸杞木虱可導(dǎo)致枸杞葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量降低(見表2)。木虱接種第36天與健康葉片相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但隨著枸杞木虱生長發(fā)育及取食量的不斷增加，枸杞葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量均顯著下降，至第12天時，葉片可溶性蛋白和可溶性糖分別下降了15.9%和23.67%。枸杞木虱對枸杞葉片POD、PAL和PPO的影響無規(guī)律性變化。POD活力在枸杞木虱接種第3天時稍有上升，隨后下降，至接種第9天時顯著下降23.8%。枸杞木虱可致PAL活力整體呈下降趨勢，但僅在第6天時才與對照有顯著差異。枸杞木虱接種對PPO活力的影響表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)，第3天和第6天時與對照無顯著差異，至第9天時顯著升高，第12天時又顯著下降。枸杞木虱為害后可導(dǎo)致葉片總酚、類黃酮含量降低，除第9天無顯著差異外，其他取樣時間點均表現(xiàn)出顯著下降趨勢。

4 討論

枸杞木虱為害可顯著影響枸杞植株的正常生長，不但使地上部分生長受阻，而且還顯著抑制根系生長。枸杞木虱取食量大，對植物營養(yǎng)的爭奪明顯，實驗中在接種木虱第12天后枸杞幼苗即開始出現(xiàn)脫水萎蔫現(xiàn)象，生產(chǎn)中寧夏枸杞被木虱為害嚴(yán)重后也會導(dǎo)致葉片萎蔫，甚至枝條干枯，推測枸杞木虱取食量大是影響枸杞抽條發(fā)芽的主要原因。有研究顯示木虱類害蟲可抑制植物根系生長，如Nissinen等[12]發(fā)現(xiàn)胡蘿卜Daucuscarota被胡蘿卜木虱Triozaapicalis為害后，可導(dǎo)致胡蘿卜地下部分明顯縮小，本研究也發(fā)現(xiàn)枸杞木虱顯著影響枸杞根系正常生長，推測這是導(dǎo)致被害枸杞植株恢復(fù)慢，甚至病死的重要原因。

表2 枸杞木虱對寧夏枸杞生理生化的影響

注：*P<0.05；**P<0.01。

枸杞木虱若蟲通常固定在枸杞葉片背面刺吸為害，其對葉片的影響是漸進(jìn)的且肉眼無法分辨，僅當(dāng)枸杞遭受嚴(yán)重?fù)p傷時，枸杞葉片才出現(xiàn)發(fā)黃或干枯等明顯癥狀。葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)可以實時原位探測和研究植物光合生理變化及各種外界因子對其細(xì)微影響，具有快速、靈敏和非破壞性等優(yōu)點[13-14]。接種枸杞木虱第6天，枸杞葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)值開始下降，且隨為害時間的延長，熒光參數(shù)下降越顯著，推測枸杞木虱取食為害枸杞葉片后，PSⅡ活性中心受到傷害，破壞了葉片光合機(jī)能，影響光合作用的正常進(jìn)行，這與張文英等[15]利用LI-6400光合儀測定研究鴨腳樹星室木虱Pseudophacopteronalstonium對糖膠樹Alstoniascholaris致癭后的結(jié)果類似，與陳建明、Watanabe等[16-17]關(guān)于水稻褐飛虱刺吸為害引起水稻葉片葉綠素崩解，光合作用強(qiáng)度下降，蛋白質(zhì)分解，導(dǎo)致植株產(chǎn)生“虱燒”現(xiàn)象類似。

植物POD、PAL和PPO是植物體內(nèi)重要的防御酶，參與活性氧清除[18]，酚類、木質(zhì)素、生物堿[19]以及醌類等相關(guān)抗性物質(zhì)的合成[20]，其中植物總酚和類黃酮對植食性節(jié)肢動物的取食和生長發(fā)育有抑制作用[21-22]，這些防御酶及抗性物質(zhì)對增強(qiáng)植物抗病蟲能力具有重要作用。本研究的結(jié)果顯示，枸杞木虱為害可顯著降低枸杞植株營養(yǎng)，但并未引起枸杞抗性相關(guān)酶(POD、PAL、PPO)活性和次生物質(zhì)總酚(單寧為主)、類黃酮含量顯著升高，甚至出現(xiàn)降低，與柑橘木虱Diaphorinacitri抑制柑橘Citrusreticulata或九里香Murrayapaniculata葉片防御酶(SOD、POD等)活性[23]、桉樹木虱Glycaspisbrimblecombei抑制桉樹Eucalyptuscamaldulensis葉片多酚類物質(zhì)含量[24]的研究結(jié)果類似。同時，枸杞木虱也可能通過大量攝取植物營養(yǎng)，導(dǎo)致植物體內(nèi)合成防御酶原料不足而使其活性受到抑制，酚類物質(zhì)合成減少[24-25]，具體原因有待進(jìn)一步研究。