周 琳，張永春，蔡友銘，楊柳燕

(上海市農(nóng)業(yè)科學院林木果樹研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室，上海 201403)

彩色馬蹄蓮(Zantedeschiahybrida)為天南星科(Araceae)馬蹄蓮屬(Zantedeschia)的多年生球根花卉[1]，因其品種豐富且佛焰苞和葉型多樣，可作為觀賞價值較高的切花或觀葉植物，備受國內(nèi)外消費者青睞[2]。近年來，國內(nèi)外在彩色馬蹄蓮組織培養(yǎng)[3]、種球培育和儲藏技術(shù)[4]、矮化與促花調(diào)控[5]以及抗病育種[6]方面開展了大量工作；然而，相對于其他球根花卉，彩色馬蹄蓮品種的表型差異(如佛焰苞、葉型、葉耳等多樣性)形成機理尚缺乏較為深入的研究。

近年來，測序技術(shù)快速發(fā)展，且測序成本逐年降低，轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)可全面地揭示植物在特定時刻和組織的表達基因及其表達量，能夠在整體水平上研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學過程及生長發(fā)育過程中的分子機理[7]。目前，轉(zhuǎn)錄組測序已廣泛應(yīng)用于植物葉色突變[8]、花色[9]、抗病性[10]等性狀差異機理研究；此外，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘的SSR標記(Simple Sequence Repeats，簡單重復(fù)序列標記)和SNP標記(Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性標記)也應(yīng)用于品種鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性評價等研究[11]。

上海市農(nóng)業(yè)科學院通過雜交育種和分子標記輔助選育，獲得了彩色馬蹄蓮切花新品種‘金絲絨’(滬農(nóng)品認花卉2010第004號)和‘夢幻’(滬農(nóng)品認花卉2010第003號)?！鸾z絨’株高70—80 cm，株幅50—60 cm，佛焰苞金黃色，周徑(16—18 cm)花枝數(shù)為3—5支，葉片為箭形且無葉耳，抗病性較強；‘夢幻’株高60—70 cm，株幅40—45 cm，佛焰苞紫色，同等周徑(16—18 cm)花枝數(shù)為4—6支，葉片為戟形且有葉耳，抗病性強。兩個彩色馬蹄蓮品種在株高、株輻、佛焰苞、葉型、花期以及抗性等方面均存在較大差異，可作為表型差異機理研究的材料。本研究以‘金絲絨’和‘夢幻’為材料，采用高通量測序技術(shù)，初步篩選與彩色馬蹄蓮表型相關(guān)基因，并進行密碼子使用偏好性分析，以期為闡明其表型差異提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇彩色馬蹄蓮(Zantedeschiahybrida)育成品種‘金絲絨’和‘夢幻’直徑為5—6 cm的種球為試驗材料。供試材料選擇標準、赤霉素處理、種植、灌溉和水肥管理等參照楊柳燕等[12]的方法。種植1個月后，選取2個品種球莖、根系和葉片組織，稱重后立即放入液氮中冷凍30 min，隨后放入-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取、文庫構(gòu)建與檢測

RNA提取、濃度和純度檢測參照李青竹等[13]的方法。將2個彩色馬蹄蓮品種高質(zhì)量球莖、根系、葉片的RNA等量混合，交由廣州基迪奧生物科技有限公司完成文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序(Illumina HiSeqTM4000系統(tǒng))。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝、序列注釋和功能分類

轉(zhuǎn)錄組測序得到原始數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)過濾條件參照陳赫等[14]的方法；使用Trinity軟件[15]進行從頭組裝獲得unigene(非重復(fù)序列基因)。將2個彩色馬蹄蓮品種的所有unigene與蛋白序列數(shù)據(jù)庫Nr(Non-Redundant Protein Sequence Database，非冗余蛋白庫)、Swiss-Prot(Swiss-Prot Protein Sequence Database，Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫)、KOG(Clusters of Orthologous Groups for Eukaryotic Complete Genomes，真核生物蛋白相鄰類的聚簇)以及核酸數(shù)據(jù)庫KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書)進行比對，比對方法參照李青竹等[13]；隨后，進行基因功能注釋、預(yù)測其功能分類和參與的生物學途徑。

1.2.3 SSR位點預(yù)測和轉(zhuǎn)錄因子分析

使用MISA軟件(MIcroSAtellite identification tool，version 1.0)進行SSR標記的搜索，具體參數(shù)參照李青竹等[13]的設(shè)置。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors，TF)分析通過將預(yù)測的蛋白序列與相應(yīng)的 TF 數(shù)據(jù)庫(plant TFdb/animal TFdb)進行hmmscan比對獲得。

1.2.4 密碼子使用偏好性分析

參照賴瑞聯(lián)等[16]的方法從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選并提取滿足條件的編碼序列用于后續(xù)分析。隨后，利用CodonW 1.4.4軟件(https：//sourceforge.net/projects/codonw/files/)對彩色馬蹄蓮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)密碼子組成進行分析，包括彩色馬蹄蓮轉(zhuǎn)錄組中總的GC含量、密碼子的第1、2、3位含量(GC1、GC2、GC3)、有效密碼子數(shù)(Effective number of codon，ENC)、同義密碼子第3位GC含量(GC3s)、以及同義密碼子相對使用頻率(Relative synonymous codon usage，RFSC)。最后，依據(jù)RFSC結(jié)果，參照林濤等[17]的方法鑒定彩色馬蹄蓮基因高頻密碼子。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計、組裝

‘金絲絨’和‘夢幻’球莖、根和葉片的RNA各混合樣品，通過Illumina HiSeqTM4000測序平臺獲得原始數(shù)據(jù)(raw reads)后，先進行數(shù)據(jù)過濾，即除去含接頭、含N比例大于10%以及低質(zhì)量的原始讀數(shù)序列，以獲得高質(zhì)量純凈序列(clean reads)，測序數(shù)據(jù)量、GC含量等統(tǒng)計結(jié)果見表1。2個材料的clean data均為7 Gb 以上，堿基質(zhì)量大于Q30的比例分別為95.98%和96.02%，GC含量分別為52.65%和52.44%，表明測序組裝效果較好，滿足開展后續(xù)基因注釋和功能分類等要求。利用Trinity軟件對上述獲得的clean reads進行從頭(de novo)組裝，共獲得76 060條非冗余unigene序列，長度范圍為200—17 366 bp，其中多數(shù)集中于200—500 bp，平均序列長997 bp，N50為1 938 bp。此外，大于3 000 bp的unigene有5 381條，占總數(shù)的7.07%。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

2.2 基因功能注釋結(jié)果

使用BLAST 軟件將unigene與常用的各大數(shù)據(jù)庫進行比對分析，獲得注釋的unigene共有30 321條(39.86%)。如表2所示，4個數(shù)據(jù)庫中以Nr和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫得到的條目較多，分別占全部條目總數(shù)的39.78%和24.61%；而KEGG數(shù)據(jù)庫僅有10 083條(13.26%)unigene得到了注釋，注釋信息最少。

表2 unigene注釋的統(tǒng)計

2.3 unigene功能分類

2.3.1 GO(基因本體，Gene Ontology)分類

在轉(zhuǎn)錄本中，能夠被注釋到GO分類的unigene僅有2 669條，分別參與到3個GO類別(生物學過程、分子功能和細胞組分)的40個亞類(圖1)。生物學過程的17個亞類中，代謝過程和細胞過程涉及的unigene較多，分別有1 544條和1 277條；分子功能中包括11個亞類，其中催化活性相關(guān)基因豐度最高，為1 550條；細胞組分中包括12個亞類，其中細胞和細胞片段包含unigene數(shù)量最多，均為844條，其次為細胞器，有619條。

2.3.2 KOG分類

彩色馬蹄蓮76 060條unigene中僅有17 183條(22.59%)注釋到KOG數(shù)據(jù)庫的25個功能分類(圖2)。注釋數(shù)量排名前5的組依次是：通用功能預(yù)測(7 736條，45.02%)、蛋白質(zhì)翻譯后修飾與運轉(zhuǎn)及分子伴侶(2 943條，17.13%)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制(2 504條，14.57%)、RNA加工和修飾(1 410條，8.21%)、轉(zhuǎn)錄(1 380條，8.03%)；此外，有1 115條(6.49%)注釋到功能未知。

2.3.3 KEGG分類

注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫的10 083條unigene中有5 358條(53.14%)參與了132條代謝通路；所涉及的代謝通路包括：代謝(9 252條，73.18%)、遺傳信息處理(2 233條，17.66%)、細胞過程(497條，3.93%)、環(huán)境信息處理(394條，3.12%)和有機系統(tǒng)(266條，2.10%)。在最大的類別，即代謝途徑中，代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑是unigene最為富集的2個途徑，分別有2 125條和1 108條unigene。

2.4 SSR標記和轉(zhuǎn)錄因子分析

2.4.1 SSR標記分析

從彩色馬蹄蓮所有的unigene中進行SSR位點檢索，最終從9 721條unigene序列中檢索到13 206個SSR位點，其中有2 429條unigene含有2個或2個以上的EST-SSR位點。SSR的5種重復(fù)類型所占比例存在顯著差異，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)所占比例分別為61.31%、31.02%、4.24%、1.79%和1.64%。彩色馬蹄蓮所有SSR 基序中，AG/CT(47.8%)比率最高，其次為AC/GT、AAG/CTT和AGG/CCT，分別占7.8%、6.7%和6.3%，所占比例均顯著低于AG/CT；此外，AAAG/CTTT、AAAT/ATTT和AGAT、ATCT所占比例均低于1%。

2.4.2 轉(zhuǎn)錄因子分析

基于彩色馬蹄蓮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，預(yù)測出54個TF家族，共有1 115個TF的unigene，其中數(shù)量最多的前10個TF類型為bHLH、ERF、MYB、MYB_related、bZIP、NAC、C2HA、WRKY、C3H和Trihelix(圖3)，分別占總預(yù)測量的8.25%、7.00%、5.92%、5.83%、5.47%、5.20%、5.11%、4.84%、4.13%和3.41%。54個TF家族在植物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育(花和花粉發(fā)育、光周期反應(yīng)、碳氮代謝以及次生代謝產(chǎn)物合成)、抗逆性等方面發(fā)揮重要作用。這些TF的發(fā)現(xiàn)將為后續(xù)研究彩色馬蹄蓮生長發(fā)育過程提供新思路。

2.5 轉(zhuǎn)錄組密碼子使用偏好性分析

2.5.1 GC含量及有效密碼子數(shù)分析

從2個彩色馬蹄蓮76 060條unigene中共篩選出33 090條高置信蛋白編碼基因CDS 序列。彩色馬蹄蓮轉(zhuǎn)錄組密碼子使用偏好性分析結(jié)果顯示，unigene 平均總GC含量為50.67%；GC1、GC2和GC3分別為54.29%、43.23%和54.48%，而GC3s則為53.00%。彩色馬蹄蓮GC3s略低于GC3含量，這與模式植物(擬南芥)[18]、木本植物(枳[19]、楊梅[20]和黃皮[21])的GC3s與GC3比較結(jié)果相一致。彩色馬蹄蓮ENC分布范圍為20.61—61.00，雖然其中有3 473條unigene的ENC值小于35，但ENC平均值為57.59，參照密碼子使用偏好性對ENC值的設(shè)定范圍，表明彩色馬蹄蓮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中密碼子不存在明顯的使用偏好性。

2.5.2 彩色馬蹄蓮的RFSC和HF

對篩選獲得的33 090條表達基因的密碼子進行同義密碼子相對使用頻率(RFSC)分析表明(表4)，彩色馬蹄蓮表達基因的密碼子RFSC差異較大。根據(jù)高頻密碼子篩選法[17]，彩色馬蹄蓮轉(zhuǎn)錄組中高頻使用密碼子僅有3個，分別為AGG(編碼精氨酸)、CAG(編碼谷氨酰胺)和AAG(編碼賴氨酸)。

表4 彩色馬蹄蓮表達基因的同義密碼子相對使用頻率(RFSC)和高頻密碼子(HF)

Table 4 The relative frequency of synonymous codon(RFSC)and high-frequency codons(HF) of coding sequences inZantedeschiahybrida

3 結(jié)論與討論

本研究通過彩色馬蹄蓮‘金絲絨’和‘夢幻’2個品種的轉(zhuǎn)錄組測序，獲得到了高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，為彩色馬蹄蓮后續(xù)基因功能研究提供了豐富的序列信息。經(jīng)組裝共得到76 060條unigene，基于四大公共數(shù)據(jù)庫，共注釋到30 321條unigene，仍有45 739條unigene未獲得注釋。這是由于球根花卉整體基因組較大，相對基因組測序進展落后，同時與彩色馬蹄蓮轉(zhuǎn)錄組和基因克隆研究工作相對滯后于其他球根花卉有關(guān)。

彩色馬蹄蓮品種間株高、株輻、佛焰苞顏色、肉穗花序顏色、喉斑、葉型以及葉片斑點等存在較大差異。本研究從2個彩色馬蹄蓮切花品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到大量的unigene，這些unigene參與到馬蹄蓮生長的各個重要代謝途徑。KOG分類表明，有7 736條unigene注釋到通用功能預(yù)測。由代謝通路分析結(jié)果可見，有9 252條unigene參與代謝通路，其中代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑最為富集。這些對比結(jié)果為彩色馬蹄蓮性狀相關(guān)基因克隆、表達分析、功能驗證等提供了理論基礎(chǔ)。

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從彩色馬蹄蓮的9 721條unigene中挖掘出13 206個SSR位點，其中二核苷酸重復(fù)最多，占60%以上，Wei等[22]在彩色馬蹄蓮品種‘Rehmannii’不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘的SSR位點與本研究結(jié)果一致。利用轉(zhuǎn)錄組挖掘SSR標記時，品種間基序類型和比例的結(jié)果存在較大差異，本研究基于‘金絲絨’和‘夢幻’轉(zhuǎn)錄組挖掘的SSR中，AG/CT、AC/GT、AAG/CTT和AGG/CCT出現(xiàn)頻率最高，而Wei等[22]研究‘Rehmannii’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中出現(xiàn)頻率最高的4類基序則為AG/CT、AT/TA、GAA/CTT和AAG/CTT。這可能與彩色馬蹄蓮栽培品種間在株型、葉型、花色等方面差異較大有關(guān)。彩色馬蹄蓮分子標記的開發(fā)先前主要集中于簡單重復(fù)序列間擴增(ISSR)和隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)，并用于品種鑒定和遺傳多樣性評估[23-25]；近年來，Wei等[22]基于單個品種不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘了9 933個SSR標記和7 162個SNP標記，并通過21個彩色馬蹄蓮種質(zhì)從200對SSR引物中篩選出58個穩(wěn)定且具多態(tài)性的引物。本研究中‘金絲絨’和‘夢幻’作為2個性狀差異顯著的彩色馬蹄蓮品種，從其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘的SSR標記，將有助于彩色馬蹄蓮親緣關(guān)系和遺傳多樣性的分析，對于彩色馬蹄蓮分類及指導(dǎo)育種具有重要意義。此外，彩色馬蹄蓮中數(shù)量較多的轉(zhuǎn)錄因子如bHLH、ERF、MYB和bZIP，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育、次生代謝、非生物脅和生物脅迫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用[26-28]，為彩色馬蹄蓮生長發(fā)育研究尤其是表型差異研究提供了重要的線索和依據(jù)。

通過對彩色馬蹄蓮33 090條CDS序列的密碼子使用偏好性分析，發(fā)現(xiàn)彩色馬蹄蓮密碼子不存在明顯的使用偏好性，但在同義密碼子相對使用頻率分析中，發(fā)現(xiàn)彩色馬蹄蓮表達基因中不同密碼子的RFSC差異較大。此外，本研究發(fā)現(xiàn)2個彩色馬蹄蓮品種高頻使用密碼子僅有3個，分別為AGG、CAG和AAG，這與已報道的物種存在較大差異；如草莓[29]、川貝母[30]、石榴[31]和黃皮[21]分別有21個、15個、19個、11個高頻密碼子。其可能原因是物種間、器官間、細胞核基因和細胞器基因間、基因家族成員間均存在密碼子使用偏好性[16]，導(dǎo)致彩色馬蹄蓮密碼子使用偏好性與其他研究結(jié)果差異較大。

綜上，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，獲取了‘金絲絨’和‘夢幻’彩色馬蹄蓮品種的unigene，并利用四大數(shù)據(jù)庫對unigene進行了功能注釋、功能分類、代謝途徑預(yù)測、SSR標記挖掘以及密碼子使用偏好性分析等研究，有助于深入了解彩色馬蹄蓮表型差異機理，并為其分子育種奠定基礎(chǔ)。