劉培剛，林天寶，朱 燕，劉 巖，呂志強(qiáng)，魏 佳

（浙江省農(nóng)科院蠶桑所，浙江 杭州 310021）

作為傳統(tǒng)蠶桑產(chǎn)業(yè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)的桑樹（Morus albaL.），同其他植物一樣，在遭受高溫、低溫、鹽堿、干旱及水澇等惡劣環(huán)境影響的時候自身會產(chǎn)生一定的抗逆反應(yīng)；而抗逆反應(yīng)的強(qiáng)弱關(guān)系到其生存適應(yīng)性、生長發(fā)育及衰老等生理過程[1]?？扇苄缘鞍讌⑴c機(jī)體代謝與滲透調(diào)節(jié)；MDA是機(jī)體抗逆膜脂過氧化產(chǎn)物；而抗氧化酶體系對于機(jī)體遭受脅迫時產(chǎn)生保護(hù)作用，它們均與桑樹等植物的抗逆性反應(yīng)存在著密切關(guān)系，其含量或活力變化是桑樹等植物生長發(fā)育、衰老及抗逆性等生理過程常見的生化檢測指標(biāo)[2，3]，因此，對于如何保證預(yù)待測酶液得到合理地提取及測定顯得至關(guān)重要，影響桑樹等植物的抗逆性、生理及病理等過程機(jī)理分析的準(zhǔn)確性。

在已有文獻(xiàn)報道中，生物生理生化指標(biāo)檢測研究中其含量或酶活力檢測結(jié)果受到溫度、時間及提取緩沖液等多方面因素的影響，其中，提取緩沖液的選擇是一項保證酶活力得到準(zhǔn)確檢測的重要影響因素，在很大程度上影響酶液的提取效果，而磷酸鹽緩沖液、生理鹽水等提取緩沖液是實驗研究中常采用的提取緩沖液種類[4，5]。

本研究就文獻(xiàn)研究中常用的磷酸鹽緩沖液、生理鹽水等提取緩沖液是否會對桑葉中可溶性蛋白含量、MDA含量及SOD、CAT、POD的活力測定存在影響進(jìn)行了對比分析，為更準(zhǔn)確地實施桑葉生理生化指標(biāo)測定工作提供數(shù)據(jù)方面的支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：紅果3號、A18、白桑椹、72c002、桂桑優(yōu)12及雜交桑（農(nóng)14）6個桑樹品種；桑樹樣本栽植于溫州海涂圍墾區(qū)。

分別從6個品種5株桑樹上采集成熟第6片葉若干，采摘后迅速液氮冷凍，然后置于冷凍干燥機(jī)冷凍干燥后（-100℃），磨碎后過100目篩，所得桑葉粉樣本保存?zhèn)溆谩?/p>

可溶性蛋白、SOD、CAT、POD、MDA試劑盒購于南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.2 酶液的提取

稱取上述制備0.2 g桑葉粉樣本，依據(jù)說明書方法所推薦的料液比（1∶9或1∶19）加入相應(yīng)體積的生理鹽水（0.9%）或磷酸鹽緩沖液（pH7.2），研缽置于冰上研磨1 min，然后將勻漿倒入離心管中并置于冰上繼續(xù)提取30 min。提取結(jié)束后，3500 rpm、4℃進(jìn)行離心10 min，離心結(jié)束后取上層酶液。各樣本保存于-80℃冰箱用于檢測。上述6個桑葉樣本各重復(fù)提取3次。

1.3 蛋白檢、MDA、SOD、CAT、POD質(zhì)量或活力測定

各生理生化質(zhì)量或活力檢測，均嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書提供操作步驟實施，每個樣品重復(fù)各測定3次，然后根據(jù)試劑盒說明書所提供的公式進(jìn)行統(tǒng)計與計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所獲得數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，檢測結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，組間比較運(yùn)用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種提取緩沖液對桑葉可溶性蛋白質(zhì)提取的影響

2種提取緩沖液對不同桑樹品種葉片可溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響，結(jié)果見表1。

由表1結(jié)果可以看出：各桑葉樣本可溶性蛋白提取效果，磷酸鹽緩沖液組均優(yōu)于生理鹽水組；就平均提取效果而言，磷酸鹽緩沖液對桑葉的可溶性蛋白提取效果要優(yōu)于生理鹽水，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 2種提取緩沖液對于桑葉MDA含量檢測的影響

2種提取緩沖液對于不同桑樹品種葉片中MDA含量檢測效果的影響，結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果可以看出，生理鹽水作為提取緩沖液，各桑樹品種MDA含量檢測值均高于磷酸鹽緩沖液；就平均提取效果而言，對于桑葉中MDA含量檢測效果，生理鹽水作為提取緩沖液要優(yōu)于磷酸鹽緩沖液，具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 2種提取緩沖液對于桑葉SOD活力檢測的影響

2種提取緩沖液對于不同桑樹品種葉片SOD活力檢測效果的影響，結(jié)果見表3。

由表3結(jié)果可以看出：桑葉SOD活力檢測的影響方面，磷酸鹽緩沖液與生理鹽水受到桑樹品種的影響；就品種平均檢測效果而言，磷酸鹽緩沖液的效果要高于生理鹽水，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 2種提取緩沖液對桑葉可溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響（mg/ml）Table 1 Extraction Effect of Soluble Protein From Mulberry Leaves by Two Extraction Buffers（mg/ml）

表2 2種提取緩沖液對桑葉MDA含量檢測效果的影響（nmol/mgprot）Table 2 Assay of MDA Activity of Mulberry Leaves by Two Extraction Buffers（nmol/mgprot）

表3 2種提取緩沖液對桑葉SOD活力檢測的影響（U/mgprot）Table 3 Assay of SOD Activity of Mulberry Leaves by Two Extraction Buffers（U/mgprot）

表4 2種提取緩沖液對桑葉CAT活力檢測的影響（U/mgprot）Table 4 Assay of CAT Activity of Mulberry Leaves by Two Extraction Buffers（U/mgprot）

表5 2種提取緩沖液對桑葉POD活力檢測效果的影響（U/mgprot）Table 5 Assay of POD Activity of Mulberry Leaves by Two Extraction Buffers（U/mgprot）

2.4 2種提取緩沖液對于桑葉CAT活力檢測的影響

2種提取緩沖液對于不同桑樹品種葉片CAT活力檢測效果的影響，結(jié)果見表4。

由表4結(jié)果可以看出，各桑葉樣本CAT活力檢測效果，磷酸鹽緩沖液提取組效果均低于生理鹽水組；就品種平均提取效果而言，生理鹽水作為提取緩沖液提取效果要優(yōu)于磷酸鹽緩沖液，存在極顯著差異（P＜0.01），因此，這也是試劑盒推薦使用生理鹽水作為提取緩沖液的重要原因。

2.5 2種提取緩沖液對于桑葉POD活力檢測的影響

2種提取緩沖液對于不同桑樹品種葉片中POD活力檢測效果的影響，結(jié)果見表5。

由表5結(jié)果可以看出，2種提取緩沖液對于POD活力檢測效果影響在桑樹品種間高低趨勢不一；就品種平均提取效果而言，2種提取緩沖液之間差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），需要針對桑樹品種進(jìn)行提取緩沖液選擇及條件的摸索。

3 討論

桑樹是世界上一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，為家蠶飼育提供天然飼料的同時，還具有藥食同源的其他重要作用。桑樹在遭受高溫、鹽堿及干旱等自然災(zāi)害的時候，其生長發(fā)育會受到影響進(jìn)而帶來桑葉產(chǎn)量、質(zhì)量等降低，進(jìn)而會影響其家蠶飼育、藥用及食用等途，而這種影響狀況同桑樹品種的抗逆適應(yīng)性強(qiáng)弱存在著密切的關(guān)系?？扇苄缘鞍资巧Ｈ~的重要成分之一，參與桑樹的代謝及滲透調(diào)節(jié)過程；MDA是細(xì)胞膜脂過氧化損傷的反應(yīng)體現(xiàn)；SOD、CAT、POD等抗氧化酶在桑樹等植物遭受脅迫的時候進(jìn)行保護(hù)調(diào)節(jié)，因此，對于這些生理生化指標(biāo)的檢測是研究與分析桑樹等植物生理、病理與抗逆反應(yīng)機(jī)理的重要因子。在進(jìn)行桑葉等植物抗逆性研究的時候，準(zhǔn)確進(jìn)行酶活力檢測是研究準(zhǔn)確性的重要基礎(chǔ)[6，7]。在進(jìn)行樣本抗逆性相關(guān)酶活性測定的時候，需要將樣本的細(xì)胞進(jìn)行破碎與提取，而提取液中所包含的一些成分對于酶活性的檢測將會造成一定的影響[8]。

已有許多文獻(xiàn)報道磷酸鹽緩沖液在可溶性蛋白提取效果方面要優(yōu)于生理鹽水[9，10]，本研究獲得了相同的結(jié)果，結(jié)果顯示磷酸鹽緩沖液對桑葉可溶性蛋白提取效果優(yōu)于生理鹽水，差異極顯著（P＜0.01）；而在CAT活力、MDA含量的檢測方面，生理鹽水作為提取緩沖液的檢測效果要顯著優(yōu)于磷酸鹽緩沖液（P＜0.01或P＜0.05）；而對于桑葉POD活力、SOD活力的檢測效果，2種提取緩沖液提取效果不存在顯著差異（P＞0.05），需要依據(jù)品種進(jìn)行摸索優(yōu)化進(jìn)行選擇。

通過本研究，進(jìn)一步了解了桑葉可溶性蛋白含量、MDA含量及SOD、CAT、POD等酶活力檢測的提取緩沖液選擇的可行性與準(zhǔn)確性；而磷酸鹽緩沖液作為提取緩沖液，待測酶容易受到緩沖液pH值的影響，因此，以后將就不同pH磷酸鹽緩沖液對于桑葉生理生化指標(biāo)檢測的影響進(jìn)行進(jìn)一步的探討，為更好地進(jìn)行桑葉酶活力生理生化檢測提供幫助。