馬艷華，黃 芬，王文尖

紫草素作為我國傳統(tǒng)中藥紫草科植物硬紫草根中的主要活性成分，具有很好的抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫功能的功效，尤其是其抗腫瘤作用引起了廣大科研人員的關(guān)注[1，2]。研究證實，紫草素主要是通過誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制拓撲異構(gòu)酶和蛋白酪氨酸激酶、抗血管生成和影響腫瘤信號傳遞途徑等而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]，并且對乳腺癌、肺癌、鼻咽癌和宮頸癌等[4-7]癌細胞都有很好的抑制生長作用。本實驗采用不同濃度的紫草素處理人肝癌HepG2細胞，分析了紫草素對肝癌細胞增殖、凋亡、自噬等進程的影響，并對其可能的調(diào)控機制進行了探討，以期為紫草素用于肝癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器 人肝癌HepG2細胞購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所細胞庫，本實驗室自行保存、傳代備用。紫草素(中國藥品生物制品鑒定所，純度≥98%)；胎牛血清(FBS)和RPMI培養(yǎng)基(Gibco公司)；兔抗人Bax、抗Bcl-2、抗Caspase-3、抗LC3-I/II、抗p62、抗p-P13K-p85、抗P13K-p85、抗Akt、抗p-Akt、抗p65、抗p-p65和抗β-actin抗體(美國Abcam公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；酶標儀(美國Bio-Tek公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理 取HepG2細胞，培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/mL青霉素的完全RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液、傳代，待細胞進入對數(shù)生長期時，用0.25%胰蛋白酶消化，制成細胞數(shù)為5×104個/mL細胞懸液，分為4組，用事先配置好的1.2 mmol/L的紫草素母液進行稀釋，使每組培養(yǎng)細胞的藥物濃度分別為0(對照)、1、2.5和5 μmol/L，處理48 h，進行后續(xù)相關(guān)檢測。

1.3 各組HepG2細胞增殖檢測 采用MTT法，取上述處理過的細胞懸液，接種于96孔板，在每孔中滴加濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲亞砜200 μL，振蕩混勻10 min，使用酶標儀檢測各組細胞在波長570 nm下的吸光度(OD)值，并根據(jù)公式計算細胞增殖抑制率=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.4 各組HepG2細胞凋亡檢測 使用流式細胞儀檢測，取處理細胞懸液，接種于6孔板，400 μL/孔，每組設(shè)3個復(fù)孔。在實驗結(jié)束時，1000 r/m離心5 min，PBS洗滌2遍，棄上清液，分別加入細胞凋亡檢測試劑盒中的緩沖液，混勻，再加入AnnexinV/FITC 5 μL、PI 10 μL，混合均勻后，室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測，并應(yīng)用Cell Quest軟件分析計算細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5 各組HepG2細胞凋亡、細胞自噬和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)相關(guān)蛋白表達水平檢測 采用Western法檢測，取各組處理后的HepG2細胞，提取總蛋白，采用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度，使其一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)至經(jīng)甲醛預(yù)處理過的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人Bax、抗Bcl-2、抗Caspase-3、抗LC3A/B、抗p62、抗p-P13K-p85、抗P13K-p85、抗Akt、抗p-Akt、抗p65、抗p-p65、抗β-actin(1:500)，4℃孵育過夜，用TBST漂洗40 min，加入HRP標記的二抗(1:500)，孵育1 h，用TBST漂洗40 min，加ECL發(fā)光液使PVD膜顯色，在暗室對X線片曝光，應(yīng)用Imaging System軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 四組HepG2細胞增殖抑制和凋亡情況比較 實驗結(jié)果顯示紫草素具有顯著的抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡作用，且呈劑量依賴性(表1、圖1)。

表1 四組HepG2細胞增殖抑制和凋亡比較

與對照組比，①P<0.05；與小劑量紫草素組比，②P<0.05；與中劑量紫草素組比，③P<0.05

2.2 四組HepG2細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較 經(jīng)1、2.5和5 μmol/L紫草素處理細胞48 h，細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比值和Caspase-3相對表達量顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，表2)。

2.3 四組HepG2細胞自噬相關(guān)蛋白表達水平比較 經(jīng)紫草素處理HepG2細胞48 h，細胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I比值顯著高于對照組，而p62蛋白相對表達水平顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。

2.4 四組HepG2細胞PI3K、Akt和NF-κB蛋白表達水平比較 經(jīng)紫草素處理HepG2細胞48 h，PI3K、Akt和p65蛋白表達水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表4、圖2)。

圖1 四組HepG2細胞凋亡情況 經(jīng)紫草素處理后，細胞凋亡顯著增加，呈劑量依賴性

孔數(shù)Bax/Bcl-2Caspase-3 對照組100.6±0.10.18±0.06 小劑量紫草素101.3±0.2①0.45±0.10① 中劑量紫草素102.7±0.3①②0.78±0.16①② 大劑量紫草素108.2±0.6①②③0.95±0.21①②③

與對照組比，①P<0.05；與小劑量紫草素組比，②P<0.05；與中劑量紫草素組比，③P<0.05

表3 四組HepG2細胞自噬相關(guān)蛋白表達水平比較

與對照組比，①P<0.05；與小劑量紫草素組比，②P<0.05；與中劑量紫草素組比，③P<0.05

表4 四組HepG2細胞PI3K、Akt和NF-κB蛋白表達比較

與對照組比，①P<0.05；與小劑量紫草素組比，②P<0.05；與中劑量紫草素組比，③P<0.05

圖2 四組HepG2細胞PI3K、Akt和NF-κB蛋白表達情況

3 討論

紫草素作為紫草的主要藥效成分，已被證實能夠抑制多種腫瘤細胞的生長，但是否能抑制肝癌細胞生長，目前研究較少。本研究結(jié)果顯示，用不同濃度的紫草素處理人肝癌HepG2細胞48 h后，HepG2細胞增殖均受到顯著的抑制，且紫草素濃度越高抑制效果越顯著，表明紫草素對肝癌細胞也有抑制作用。本研究使用流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，紫草素處理HepG2細胞后細胞凋亡率顯著增高，表明紫草素能夠促進肝癌細胞的凋亡。有研究證實紫草素通過使腫瘤細胞阻滯于G0/G1期從而提高細胞凋亡率[8]，而Caspase和Bcl-2基因家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，尤其是Caspase-3基因，作為細胞凋亡最為重要的死亡執(zhí)行蛋白酶，在細胞凋亡的啟動和調(diào)節(jié)過程中均發(fā)揮重要的作用[9]。Bax作為Bcl-2基因家族的主要促凋亡成員，能夠誘導(dǎo)線粒體通透性發(fā)生改變，從而釋放細胞色素C，促進細胞凋亡[10]，而Bcl-2則主要通過抑制Caspase-3激活，并抑制Bax的細胞毒性，調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)鈣離子濃度，抑制細胞凋亡。因此，Bax/Bcl-2表達比值常用于體現(xiàn)細胞內(nèi)凋亡情況[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫草素處理后，細胞內(nèi)Caspase-3和Bax/Bcl-2比值均顯著升高，且呈濃度依賴性，表明紫草素是通過促進HepG2細胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白的表達，從而促進了細胞凋亡。

細胞自噬作為生物細胞自我降解細胞器再利用的一種調(diào)節(jié)機制，在細胞正常情況下很少發(fā)生，但當細胞處于缺氧、應(yīng)激及相關(guān)刺激環(huán)境下時，該過程就會增強[12]。目前，關(guān)于促進癌細胞自噬來治療癌癥的研究爭議較大，但許多抗癌分子確實能夠激活腫瘤細胞的自噬活動，從而將其清除出機體外[13]。LC3和p62是細胞自噬過程的兩個標志性蛋白。當細胞自噬發(fā)生時，PI3K/Akt信號途徑會激活mTOR，促進LC3胞質(zhì)型(LC3-I)轉(zhuǎn)化為LC自噬體膜型(LC3-II)，同時還會泛素化p62激活細胞的選擇性自噬降解[14，15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫草素處理48 h后，細胞內(nèi)LC3-II/LC3-I比例顯著升高，p62蛋白表達水平顯著降低，并且呈濃度依賴性，表明紫草素能夠通過促進LC3轉(zhuǎn)化和p62蛋白泛素化而促進HepG2細胞自噬。同時，我們還檢測了細胞PI3K、Akt和NF-κB蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫草素處理后，HepG2細胞內(nèi)PI3K、Akt和NF-κB蛋白表達水平均顯著降低。PI3K/Akt信號通路在機體內(nèi)主要是通過抑制cmyc誘導(dǎo)的細胞凋亡來促進腫瘤細胞的異常增殖。因此，該通路主要發(fā)揮抗凋亡作用。同時，該通路還能夠通過磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和mTOR來調(diào)控細胞凋亡和自噬進程[16]。因此，我們推測紫草素可能是通過抑制PI3K、Akt和NF-κB蛋白的磷酸化，促進了細胞凋亡和自噬途徑，從而影響HepG2細胞的活力[17-20]。

綜上所述，目前研究發(fā)現(xiàn)紫草素的抗腫瘤機制主要集中在其促腫瘤細胞凋亡和壞死。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫草素通過調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB信號通路，影響細胞凋亡和自噬關(guān)鍵蛋白的表達，從而影響細胞活力，證實了紫草素還可能通過調(diào)控細胞自噬過程來發(fā)揮抗癌作用。因此，紫草素作為天然的抗腫瘤藥物，具有很好的臨床應(yīng)用前景，但其在機體內(nèi)的直接作用靶點尚未研究清楚，還有待深入研究。