胡挺帥，鄭夢琪，鄭嘉琪，羅心怡，張志友，潘偉槐，郭天榮，莫億偉

(紹興文理學院生命科學學院，浙江 紹興 312000)

近年來，連續(xù)高于35 ℃的高溫天氣已成為中國南方水稻種植的自然災害之一[1]。2013 年7 月下旬至8 月上旬，江淮稻區(qū)出現持續(xù)異常高溫天氣，給水稻產量造成極大損失[2]。前人[3-4]研究發(fā)現，水稻抽穗開花期、花粉母細胞減數分裂期和籽粒充實期對高溫脅迫最為敏感；高溫引起的水分脅迫對籽粒及胚乳的發(fā)育影響較大[5]，且籽粒形態(tài)和產量還受穗期和花期水分虧損程度的影響[6]。稻穗水分和養(yǎng)分主要由劍葉供給[7]，水分供應離不開水通道蛋白活性和基因的表達。水通道蛋白主要有質膜嵌入蛋白(plasma membrane intrinsic protein，PIP)、液泡膜嵌入蛋白(tonoplast intrinsic protein，TIP)、類Nod26 嵌入蛋白(nudolin 26-like intrinsic protein，NIP)和膜嵌入小分子堿性蛋白(small basic intrinsic protein，SIP)[8]。研究表明，在稻穗花期，OsTIPs基因家族表達量最高，其次是OsPIP基因家族[9]；超表達水通道蛋白基因可提高水稻和煙草對水分脅迫的耐性，增強植物體內的水分運輸速率[10-11]。水通道蛋白抑制劑HgCl2處理可導致水分脅迫[12]，但對花期水通道蛋白活性及水分運輸機制尚不清楚。為此，本研究以轉OsPIN1a的基因水稻為材料，探討高溫脅迫及HgCl2處理對水稻花期的生理特性和水通道蛋白基因家族表達的影響，旨在探明花期高溫脅迫和水通道蛋白活性與稻穗水分供應的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻材料中花11為轉OsPIN1a基因水稻[13]，由紹興文理學院生物實驗中心保存。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

2018 年，在紹興文理學院生物實驗基地進行試驗。盆栽種植，常規(guī)水肥管理。從稻株主莖和次二莖處于幼穗分化第7 期時開始，選取穗型大小基本一致的30 個稻穗掛牌標記發(fā)育時期，采用記號筆點穎和掛牌相結合的方法標記開花時間[14]。參考張桂蓮等[15]的方法，在開花前6 d 進行高溫與水通道蛋白抑制劑處理：對照處理(CK)，人工氣候箱設置晝夜溫度為30 ℃(7: 00—17: 00)/28 ℃(17: 00 至翌日7: 00)；高溫處理(TR1)，晝夜溫度為38 ℃(7: 00— 17: 00)/33 ℃(17: 00 至翌日7: 00)；復合處理(TR2)，高溫處理配以 0.1 mmol/L HgCl2處理(每天8: 00，用0.1 mmol/L HgCl2噴施葉片1 次，直到葉片有水滴滴下為止)。處理期間相對濕度控制在80%左右，光照強度為900 μmol/(m2·s)。處理結束后置于自然條件下培養(yǎng)。在花前6 d 至花后6 d 內(稱前6 d、前4 d、前2 d、0 d、后2 d、后4 d 和后6 d，盛花期當天標記為0 d)，每隔2 d 取稻穗或劍葉，用于試驗分析。試驗重復3次。

1.2.2 相對含水量的測定

每次隨機取新鮮稻穗5～6 個，劍葉10～15 片，分別稱量鮮質量(W1)；用清水浸泡12 h 后，用吸水紙吸干表面水分，稱重(W2)；再105 ℃殺青10 min，75 ℃烘干至恒重，稱干質量(W3)。計算各處理下稻穗和劍葉的相對含水量C。C=(W1－W3)/(W2－W3)× 100%[9]。試驗重復3次。

1.2.3 柱頭和花粉粒的線粒體活性染色和淀粉粒結構觀察

用50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH 7.2)配制0.5%詹納斯綠B 染液，剪取開花當天的穎花，去掉穎殼后，用詹納斯綠B 染液對柱頭和花粉粒染色10 min，再用磷酸緩沖液浸泡2 次，清洗表面殘留染料，在光學鏡下觀察有活性線粒體的染色情況。成熟籽粒干燥后，參考馮芳玖等[13]的方法，每種處理選取20個稻穗，統計結實率和千粒質量，用掃描電鏡(JSM-6360LV)觀察不同處理籽粒中部胚乳細胞內的淀粉粒結構。試驗重復3次。

1.2.4 水通道蛋白基因的表達分析

經TR1 或TR2 處理后，取劍葉中部的葉片，用RNA 試劑盒(Takara Bio Inc.，Dalian)提取RNA后，反轉錄獲得cDNA，備用。

利用實時熒光定量PCR 分析液泡膜水通道蛋白基因OsTIP1–1、OsTIP2–1、OsTIP2–2、OsTIP3–1、OsTIP4–1、OsTIP4–2、OsTIP4–3、OsTIP5–1和質泡膜水通道蛋白基因OsPIP1–1、OsPIP1–2、OsPIP1–3、OsPIP2–1、OsPIP2–4、OsPIP2–5、OsPIP2–6、OsPIP2–7在處理后相對表達量的變化。熒光定量PCR 試劑盒為Thermo Scientific DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR Kit (Thermo)，儀器為Stratagene Mx3005P 熒光定量PCR 儀，反應體系及條件參照試劑盒說明書，以水稻Actin基因作為內參基因，相應水通道蛋白基因定量表達PCR 引物見表1。

表1 水通道蛋白基因表達定量PCR檢測引物序列 Table 1 The primers sequences for real time RT-PCR

1.3 數據分析

采用SPSS 15.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 高溫與HgCl2 處理對稻穗和劍葉相對含水量的影響

從圖1-a 可知，花前稻穗相對含水量較高，盛花期稻穗相對含水量較低，TR1 和TR2 處理的相對含水量分別比對照的下降了9.62%和22.25%，差異均達顯著水平(P＜0.05)。開花當天劍葉相對含水量略有下降，其他時間點內均保持較高的相對含水量，TR1 和TR2 處理的劍葉相對含水量均低于對照的(圖1-b)。說明高溫脅迫加快了稻穗和劍葉水分的散失；經TR2 處理后，稻穗和劍葉的相對含水量更低，說明高溫結合水通道蛋白抑制劑處理能降低稻穗和劍葉的相對含水量。

圖1 不同處理的稻穗和劍葉相對含水量 Fig.1 The relative water content of different treatments in panicle and flag leaves of rice

2.2 高溫與HgCl2 處理對水稻結實率和千粒質量的影響

從表2 可知，TR1 和TR2 的結實率均顯著低于CK 的。其中，TR1 的結實率比對照的下降25.48%，TR2 的結實率比對照的下降43.63%。TR1 和TR2的千粒質量也均顯著低于CK 的，分別比對照的下降了6.36%和9.33%。說明高溫與HgCl2脅迫對結實率和千粒質量均有較大的影響。

表2 不同處理的結實率和千粒質量 Table 2 The seed setting percentage and 1 000 grain weight of rice in different treatments

2.3 高溫與HgCl2 處理對柱頭和花粉粒線粒體活性的影響

從圖2 可知，在適宜溫度下，柱頭與花粉粒均被詹納斯綠B 染成深藍綠色(圖2-a、圖2-d)，有活性的線粒體集中在代謝活躍的花粉管和柱頭尖端部分，萌發(fā)的花粉管染色遠比不萌發(fā)的花粉管的染色深。受高溫或高溫與HgCl2復合處理后，花粉粒與柱頭染色明顯變淺，整個柱頭呈淡紫色(圖2-b、圖2-c)，說明其線粒體的活性明顯降低；落在花柱上的花粉粒數量和萌發(fā)花粉粒的數量也明顯減少(圖2-e、圖2-f)，說明高溫或高溫與HgCl2復合處理后，線粒體活性降低，導致柱頭與花粉粒的活性下降。

圖2 不同處理的水稻柱頭與花粉粒 Fig.2 The rice pollen and stigma of different treatments

2.4 高溫與HgCl2 處理對劍葉液泡膜水通道蛋白基因表達的影響

從圖3 可知，花期前后4 d 內，對劍葉OsTIPs家族中的8 個基因表達進行分析，發(fā)現適溫下OsTIP1–1、OsTIP2–2、OsTIP3–1、OsTIP4–1、OsTIP4–3和OsTIP5–1的表達量均呈先上升后下降的趨勢；OsTIP2–1在花前4 d 不表達，在花前2 d 才逐漸表達；OsTIP4–2的表達量則不斷下降。說明OsTIPs不同基因間的表達模式不同。受高溫脅迫后，除OsTIP4–3和OsTIP5–1外，其他基因的表達量從花前2 d 至花后4 d，均顯著低于對照處理的；受高溫與HgCl2復合處理后，OsTIPs的各基因表達量下降得更快，說明高溫和HgCl2復合處理更能抑制OsTIPs的表達。

圖3 不同處理的劍葉液泡膜水通道蛋白基因的相對表達量 Fig.3 The expression of OsTIPs of rice flag leaves with different treatments

2.5 高溫與HgCl2 處理對質膜水通道蛋白基因表達的影響

從圖4 可知，適溫下，OsPIP1–1、OsPIP1–2、OsPIP1–3、OsPIP2–1、OsPIP2–4和OsPIP2–6的表達量均呈現先上升后下降的趨勢，并在開花當天達到最大值。OsPIP2–5在此期間的表達量不斷增加，OsPIP2–7在開花前后的表達量較高，開花當天的表達量則較低。經高溫處理后，從花前2 d 至花后4 d，各相應基因的表達量均下降；受高溫與HgCl2復合處理后，相關基因的表達量下降更為明顯。說明劍葉質膜水通道蛋白基因的表達受高溫和水通道蛋白抑制劑的影響。

圖4 不同處理的劍葉質膜水通道蛋白基因的相對表達量 Fig.4 The expression of OsPIPs of rice flag leaves of different treatments

2.6 高溫與HgCl2 處理對稻米淀粉粒結構的影響

從圖5 可知，電鏡觀察發(fā)現，適溫下，淀粉粒發(fā)育良好，各淀粉粒之間結合緊密，胚乳細胞內淀粉粒多邊形晶體結構明顯(圖5–a)；受高溫脅迫后，淀粉粒間出現明顯的空隙(圖5–b)，說明淀粉粒的發(fā)育受到影響；受高溫與HgCl2復合處理后，淀粉粒變成圓球形，無法形成規(guī)則的晶體結構，各淀粉粒之間不能緊密結合(圖5–c)，導致充實不良，這可能是導致千粒質量降低的原因。

圖5 不同處理的淀粉粒結構 Fig.5 The structure of starch granules of different treatments

3 結論與討論

本研究發(fā)現，開花當天OsTIPs和OsPIPs家族中多個基因的表達量顯著高于花前和花后的，表明開花時這2 個基因家族大量表達，這與DING 等[16]的研究結果基本一致。受高溫和HgCl2復合處理后，劍葉OsTIPs和OsPIPs家族表達水平均顯著低于對照或高溫處理的，稻穗和劍葉的相對含水量也降低，這可能與水通道蛋白基因表達及活性降低有關。如：超表達水稻質膜水通道蛋白OsPIP1–1可顯著提高水稻根系導水能力[10]，超表達TsPIP1–1及TsTIP1–1，可提高轉基因植株的相對含水量[17]；若敲除AtTIP1–1，轉基因植株極易受水分脅迫的傷害[18]；可見，OsTIPs和OsPIPs的高表達與高活性的維持對稻穗和劍葉水分供應有著重要作用。本研究發(fā)現，高溫與HgCl2復合處理，導致柱頭上的花粉粒顯著減少，這與張桂蓮等[15]的研究結果一致。高溫脅迫導致花藥開裂受阻，散落在柱頭上的花粉粒顯著減少，而耐熱的突變體花粉數量和活性則優(yōu)于熱敏感品種[19]。柱頭上花粉粒減少直接影響最終的結實率[20]。

本研究結果表明，高溫或高溫與HgCl2復合處理后，花粉粒與柱頭的線粒體染色較淺或無法染色，說明高溫與HgCl2脅迫后，可能使柱頭和花粉粒細胞內的線粒體氧化磷酸化過程受到破壞[21]，導致柱頭和花粉?；钚越档蚚22]。研究發(fā)現，HgCl2結合到水通道蛋白Cys 位點后，通過抑制水通道蛋白活性，降低水分運輸速率[23]。散落在柱頭上的花粉粒萌發(fā)后形成花粉管的過程是快速極性生長過程，需要充足的能量和水分供應[24-25]，需要高活性的線粒體通過氧化磷酸化提供ATP。當ATP 供應或水分供應不足時，花粉管生長和受精過程受阻。此外，高溫還可能引起光合產物向籽粒運輸受阻，從而使結實率降低，淀粉粒充實不良。這與前人[1,3,26]發(fā)現高溫脅迫導致水稻產量、結實率和千粒質量下降的結果相一致。但高溫引起的水分脅迫如何影響柱頭和花粉?；钚缘纳頇C制還需作進一步研究。