張輝，吳秋歌，張坤，李立敬，朱靜靜，李艷娟，王靜

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，鄭州450000

原發(fā)性肺癌（primary lung cancer，PLC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高，非小細(xì)胞肺癌為其最常見的一種類型[1-2]。早期肺癌無(wú)典型癥狀，大部分患者就診時(shí)已進(jìn)展至中晚期或伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了最佳治療時(shí)機(jī)，預(yù)后差[3]。近年來(lái)，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在腫瘤發(fā)病過(guò)的程中起關(guān)鍵作用[4]。細(xì)胞免疫是機(jī)體拮抗腫瘤的關(guān)鍵免疫機(jī)制；T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，其功能和數(shù)量發(fā)生異常時(shí)可能導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，抗腫瘤能力降低，更易出現(xiàn)侵襲、轉(zhuǎn)移[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是鋅離子依賴性蛋白水解酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的降解過(guò)程[6]。腫瘤細(xì)胞與ECM的相互作用在腫瘤的發(fā)病及進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[7]。MMP2、MMP9過(guò)表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]。關(guān)于PLC發(fā)病過(guò)程中T淋巴細(xì)胞亞群、MMP2、MMP9水平變化與腫瘤惡性生物學(xué)行為的關(guān)系的報(bào)道較少。本研究通過(guò)對(duì)PLC患者的外周血淋巴細(xì)胞亞群及血清MMP2、MMP9水平進(jìn)行檢測(cè)，以期為PLC的診療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月至2019年3月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的PLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為肺癌；②未接受放療、化療、手術(shù)或靶向抗腫瘤治療；③臨床分期和組織學(xué)分型均依據(jù)國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)制定的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（第8版）修訂建議[10]；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并重要臟器功能障礙；③合并全身系統(tǒng)性炎癥性疾??；④合并急性、慢性感染；⑤合并血液系統(tǒng)疾病；⑥合并嚴(yán)重腦血管疾??；⑦合并嚴(yán)重精神類疾?。虎嗪喜⒆陨砻庖咝约膊?。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入89例PLC患者作為PLC組，其中，男58例，女31例；年齡32～79歲，平均（60.95±10.52）歲；病理類型：鱗癌56例，腺癌27例，小細(xì)胞癌6例。選取同期體檢的30例健康者作為對(duì)照組，均經(jīng)體檢證實(shí)心、肝、肺、腎功能正常，其中，男19例，女11例；年齡30～78歲，平均（59.55±11.52）歲。

1.2 檢測(cè)方法

PLC組患者于入院次日、對(duì)照組受試者于體檢當(dāng)日均采集外周空腹靜脈血約5 ml，離心分離后低溫保存待測(cè)。采用購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司的DxFLEX型流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血中T淋巴細(xì)胞亞群水平，血樣標(biāo)本制成單細(xì)胞懸液（1×106/ml），恒溫水浴速溶，離心沉淀，棄去枸櫞酸緩沖液和上清，加入10 μl異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記鼠抗人單克隆抗體或藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）熒光素標(biāo)記免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）抗體，離心混勻，避光反應(yīng)0.5 h，離心后棄上清，加入含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液3 ml，離心混勻，棄上清，再次加入磷酸鹽緩沖液2 ml，混勻后上流式細(xì)胞儀測(cè)定，計(jì)數(shù)細(xì)胞10 000個(gè)，以同型抗體作為陰性對(duì)照。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定血清中MMP9、MMP2水平，ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，均嚴(yán)格按試劑使用說(shuō)明操作，采用購(gòu)自美國(guó)Thermo公司的多功能酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度值，應(yīng)用電腦自動(dòng)計(jì)算血清MMP9、MMP2濃度。所有血液樣本均檢測(cè)1次，各試劑批內(nèi)變異系數(shù)＜5%，批間變異系數(shù)＜13%，符合精密度要求。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組受試者外周血中的T淋巴細(xì)胞亞群CD3-CD19+、CD8+CD28+水平及血清中 MMP9、MMP2水平，分析上述指標(biāo)在不同病理特征PLC患者中的表達(dá)差異；分析PLC患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群水平與血清中MMP9、MMP2水平的相關(guān)性；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析T淋巴細(xì)胞亞群、MMP9、MMP2水平對(duì)PLC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用完全設(shè)計(jì)隨機(jī)方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析法；采用ROC曲線分析T淋巴細(xì)胞亞群、MMP9、MMP2水平對(duì)PLC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者外周血中 T淋巴細(xì)胞亞群及血清中MMP 9、MMP 2水平的比較

PLC組患者外周血中CD3-CD19+、CD8+CD28+水平均明顯低于對(duì)照組受試者，血清中MMP9、MMP2水平均明顯高于對(duì)照組受試者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 兩組受試者外周血中 T淋巴細(xì)胞亞群及血清MMP 9、MMP 2水平的比較（±s）

表1 兩組受試者外周血中 T淋巴細(xì)胞亞群及血清MMP 9、MMP 2水平的比較（±s）

組別CD3-CD19+CD8+CD28+MMP9MMP2（%） （%） （μg/ml） （μg/ml）PLC組（n=89）42.76±5.7912.75±2.65135.52±25.98437.52±61.44對(duì)照組（n=30）50.16±6.5817.63±3.7189.78±14.65324.15±50.63 t值5.8468.2919.1489.110 P值 ＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

2.2 不同病理特征PLC患者外周血中 T淋巴細(xì)胞亞群及血清中MMP 9、MMP 2水平的比較

不同病理類型PLC患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群及血清中MMP9、MMP2水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同N分期PLC患者血清中的MMP9、MMP2水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Ⅲ～Ⅳ期、低分化、N1～3期、M1期的PLC患者外周血中CD3-CD19+水平均明顯低于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、N0期、M0期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.732、5.446、4.174、5.023，P＜0.01）；Ⅲ～Ⅳ期、低分化、N1～3期、M1期的 PLC 患者外周血中CD8+CD28+水平均明顯低于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、N0期、M0期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.759、6.077、4.456、7.408，P＜0.01）。Ⅲ～Ⅳ期、低分化、M1期的PLC患者外周血中MMP9水平均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、M0期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.955、3.891、3.556，P＜0.01）；Ⅲ～Ⅳ期、低分化、M1期的PLC患者外周血中MMP2水平均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、M0期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.245、9.432、10.812，P＜0.01）。（表2、表3）

表2 89例不同病理特征PLC患者的外周血 T淋巴細(xì)胞亞群水平

表389 例不同病理特征PLC患者的血清MMP 9、MMP 2水平

2.3 PLC患者外周血中 T淋巴細(xì)胞亞群與血清中MMP 9、MMP 2水平的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PLC患者外周血中CD3-CD19+、CD8+CD28+水平與血清中 MMP9、MMP2水平均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。（表4）

表4 89例PLC患者外周血 T淋巴細(xì)胞亞群與血清MMP 9、MMP 2水平的相關(guān)性分析

2.4 PLC患者外周血 T淋巴細(xì)胞亞群與MMP 9、MMP 2水平對(duì)PLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，MMP9水平對(duì)PLC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值最高，約登指數(shù)最大時(shí)對(duì)應(yīng)的cut-off值＞143.14，曲線下面積（area under curve，AUC）為 0.93，靈敏度、特異度分別 為86.67%、88.14%；其次為CD3-CD19+，約登指數(shù)最大時(shí)對(duì)應(yīng)的cut-off值＜40.50，AUC為0.91，靈敏度、特異度分別為96.67%、81.36%。（表5）

表5 89例PLC患者外周血 T淋巴細(xì)胞亞群與血清MMP 9、MMP 2水平對(duì)PLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

T淋巴細(xì)胞是參與機(jī)體腫瘤免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞，已被證實(shí)其可調(diào)控機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)[11]。CD3抗原是成熟T淋巴細(xì)胞表面特異性抗原，表達(dá)于人T淋巴細(xì)胞表面，含多種肽鏈，可與T淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原受體形成復(fù)合物，傳遞活化信號(hào)至T淋巴細(xì)胞內(nèi)部[12]。CD19為分布于成熟B淋巴細(xì)胞表面的抗原，其與CD3抗原組成共同代表體內(nèi)T淋巴細(xì)胞總數(shù)目[13]。CD8分子分布于殺傷性T淋巴細(xì)胞與抑制性T淋巴細(xì)胞表面，CD28位于外周成熟細(xì)胞毒性T細(xì)胞表面，CD8+和CD28+共同組合成細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞亞群，調(diào)控腫瘤細(xì)胞免疫，主要通過(guò)與靶細(xì)胞結(jié)合釋放大量細(xì)胞殺傷因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死，并起到殺滅腫瘤細(xì)胞的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞免疫功能低下密切相關(guān)[15-16]。T淋巴細(xì)胞亞群作為介導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可能能夠作為腫瘤患者免疫系統(tǒng)紊亂研究的新靶點(diǎn)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，PLC 患者的CD3-CD19+、CD8+CD28+水平均明顯低于健康者，提示PLC患者存在明顯的細(xì)胞免疫低下的表現(xiàn)，且隨著臨床分期的上升、腫瘤分化程度的降低，CD3-CD19+、CD8+CD28+水平降低得更明顯；同時(shí)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的PLC患者的CD3-CD19+、CD8+CD28+水平明顯低于未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，進(jìn)一步提示PLC具有明顯的免疫抑制的特點(diǎn)，且隨著腫瘤惡性程度的增加，患者的免疫抑制特點(diǎn)更明顯，推測(cè)免疫系統(tǒng)紊亂與PLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步的ROC曲線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD3-CD19+、CD8+CD28+對(duì)PLC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，可為監(jiān)測(cè)PLC病情進(jìn)展提供重要依據(jù)。

浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤典型的生物學(xué)特點(diǎn)，也是腫瘤致死的重要原因[18]。ECM降解是腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[19]。MMP9、MMP2均為明膠酶類分子，由可能存在惡性傾向的腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌，共同參與ECM降解過(guò)程，破壞基底膜完整性，在惡性腫瘤的血管化、腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移灶的形成過(guò)程中起重要作用[20-21]；同時(shí)，MMP9、MMP2可促成腫瘤新生血管形成，導(dǎo)致血管局部基底膜降解，創(chuàng)造促血管生成微環(huán)境，促成腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，PLC患者的血清MMP9、MMP2水平均明顯高于對(duì)照組；Ⅲ～Ⅳ期、低分化、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M1期）的PLC患者的血清MMP9、MMP2水平均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M0期）的患者，這與陳鵬等[23]和Zergoun等[24]的結(jié)論相同，證實(shí)MMP2、MMP9均與PLC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，外周血T淋巴細(xì)胞亞群與血清MMP9、MMP2水平對(duì)PLC是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。另外，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PLC患者的外周血CD3-CD19+、CD8+CD28+與血清MMP9、MMP2水平均呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)外周T淋巴細(xì)胞亞群與MMP可能協(xié)同參與PLC發(fā)病、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的過(guò)程。考慮其原因?yàn)樵诰奘杉?xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)的刺激下，趨化因子、免疫細(xì)胞向肺組織浸潤(rùn)，加重肺部炎性反應(yīng)，而炎癥信號(hào)可激活腫瘤細(xì)胞及外周組織釋放大量的MMP進(jìn)入血液循環(huán)，通過(guò)正向反饋?zhàn)饔眠M(jìn)一步促進(jìn)炎癥、趨化因子和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，促使ECM降解，同時(shí)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)免疫耐受，更有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、增殖和遷移，導(dǎo)致腫瘤惡性表型發(fā)生轉(zhuǎn)化[25]。

綜上所述，外周血T淋巴細(xì)胞亞群、MMP9、MMP2可能協(xié)同參與PLC的發(fā)病及進(jìn)展，其水平與PLC患者的臨床分期、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)PLC是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)。但是，本研究為回顧性分析，存在一定的局限性，且觀察時(shí)間短，樣本量少，尚未分析以上因子對(duì)PLC預(yù)后的影響，且尚未研究PLC患者M(jìn)MP組織抑制因子-1的表達(dá)情況及其與以上因子的關(guān)系，有待擴(kuò)充樣本量、延長(zhǎng)隨訪時(shí)間進(jìn)一步研究。