陳方圓,田 剛,白曉君,李娟利,袁祖貽

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:chenfy-608@163.com)

巨噬細胞是維持機體免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主要細胞,通過增強免疫應答對感染做出反應,參與機體炎癥免疫反應的全過程。靜止狀態(tài)的巨噬細胞稱為M0表型,根據(jù)活化方式及活化后的功能,巨噬細胞能極化成兩種不同的表型:經(jīng)典活化炎癥表型M1型和替代激活抗炎表型M2型[1]。巨噬細胞也是可塑性細胞,具有隨微環(huán)境中刺激因素的變化而從一種表型向另一種表型轉(zhuǎn)換的能力,在特定條件下,已經(jīng)分化的M1和M2表型巨噬細胞之間也可以相互轉(zhuǎn)化[2]。在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中,由于不同細胞因子及信號通路的影響,兩種表型巨噬細胞處于一個動態(tài)平衡,因此,巨噬細胞向何種表型極化決定了炎癥的最終轉(zhuǎn)歸[3],在進展期炎癥性疾病中以M1表型巨噬細胞為主。上述機制對一些炎癥免疫性疾病的治療有一定的指導意義。

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator activated receptor-gamma,PPAR-γ)活化在巨噬細胞極化過程發(fā)揮重要的作用,活化的PPAR-γ能促進巨噬細胞向M2表型極化,而缺乏PPAR-γ巨噬細胞則向M1表型極化[4]。據(jù)報道姜黃素是PPAR-γ的天然活化劑[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可通過活化PPAR-γ誘導M1表型巨噬細胞向M2表型轉(zhuǎn)換[6],同時炎癥反應減輕。本文旨在探討姜黃素是否也能通過活化PPAR-γ直接誘導巨噬細胞向M2表型極化從而發(fā)揮其抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基加入10%胎牛血清(美國,Hyclone公司);姜黃素、噻唑藍(MTT)、GW9662(PPAR-γ阻斷劑)(美國,Sigma公司);白細胞介素-4(IL-4)(美國,Peprotech公司);總RNA提取試劑盒(上海飛捷公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及real time PCR試劑盒(大連,TaKaRa公司);兔抗KLF4(Kruppe樣因子4)抗體(美國,cell signal公司)、兔抗FIZZ1(found in inflammatory zone 1)抗體(美國,Abcam公司)、兔抗PPAR-γ抗體(美國,Santa Cruz公司)、兔抗GAPDH抗體(美國,Proteintech公司)、抗兔二抗(美國,Santa Cruz公司)。

1.2 小鼠腹腔巨噬細胞的分離、培養(yǎng)、誘導及鑒定

6-8周清潔級C57/BL6小鼠頸椎脫臼處死(實驗室保種),75%酒精侵泡5 min,從尾部提起小鼠保持倒立姿勢同時腹腔注入無血清DMEM培養(yǎng)液5 ml,仰臥平放并輕揉小鼠腹部2-3 min,靜置5-7 min,無菌條件下打開小鼠腹腔,觀察腸管變扁且腹腔液為淡黃色時,用注射器抽取腹腔液4-4.5 ml,離心洗滌后顯微鏡下計數(shù),常規(guī)DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清),調(diào)整細胞至所需濃度,置于培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)12 h換液,去除掉少數(shù)未貼壁細胞[7]。IL-4(10 ng/ml)干預巨噬細胞12 h誘導巨噬細胞呈抗炎表型M2巨噬細胞[6]。

經(jīng)前面所述方法分離出來的小鼠腹腔巨噬細胞(M0)經(jīng)過流式細胞儀進行鑒定。小鼠巨噬細胞表面特異標記有F4-80和CD11b[8]。F4-80用FITC標記,CD11b用PE標記。選擇這兩個指標同時對提取的小鼠腹腔巨噬細胞進行鑒定,雙標記陽性則鑒定為小鼠腹腔巨噬細胞。

1.3 實驗分組

①觀察姜黃素對小鼠腹腔巨噬細胞表達M2表型標志分子的影響:不同濃度姜黃素(0,6.25,12.5,25 μmol/L)干預提取的小鼠腹腔巨噬細胞(M0)12 h,這些處理組分別稱為:對照組(M0)、6.25M0、12.5M0、25M0組;②觀察姜黃素對經(jīng)IL-4誘導M2表型小鼠腹腔巨噬細胞表達M2表型標志分子的影響:不同濃度姜黃素(0,6.25,12.5,25 μmol/L)干預經(jīng)IL-4 10 ng/ml誘導的腹腔巨噬細胞(M2)12 h,這些處理組分別稱為:對照組(M0)、M2、6.25M2、12.5M2、25M2組;③探明姜黃素對小鼠腹腔巨噬細胞表達M2表型標志分子影響的機制:20 μmol/L GW9662與25 μmol/L姜黃素共同干預巨噬細胞12 h,這些處理組分別稱為:對照組(M0)、25M0、GW9662+25M0組。

1.4 MTT法檢測腹腔巨噬細胞活力

將提取好的腹腔巨噬細胞按每孔2 000個細胞數(shù)接種于96孔板,按照前述細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)至細胞貼壁,換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,分別給予0,6.25,12.5,25,30,50 μmol/L姜黃素分別干預6,12,24 h。吸去培養(yǎng)液,每孔加入MTT(5 g/L)20 μl,37 ℃孵育4 h,棄去上清,每孔加入二甲基亞砜100 μl,避光置于37 ℃搖床10 min,全自動酶標儀測定490 nm處各孔的吸光值。

1.5 real time-PCR測定M2表型標志分子mRNA表達

按照1.3的實驗分組干預巨噬細胞結束后,根據(jù)試劑盒說明提取總RNA,用紫外分光光度法測定RNA的純度與濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將各組mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照RT-PCR試劑盒步驟進行實驗,PCR擴增條件:95℃ 30 s,95℃ 5 s、60℃ 30 s,共40個循環(huán)?；虮磉_定量采用雙δ方法(2δδCt)。由北京奧科公司合成引物,序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因名稱引物序列 KLF4上游:5′-AACAGCCACCCACACTTG-3′下游:5′-GCCTGGTCAGTTCATCGG-3′FIZZ1上游:5′-GCTACTGGGTGTGCTTGTG-3′下游:5′-CTGGGTTCTCCACCTCTTC-3′MGL1上游:5′-TCTCTGAAAGTGGATGTGGAGG-3′下游:5′-GGAGGTGTAGGTGAAAGTCTCT-3′GAPDH上游:5′-AGCAGTCCCGTACACTGGCAAAC-3′下游5′-TCTCCTGTAAATGTAGTGGTGTCT-3′

1.6 Western blot檢測KLF4、FIZZ1和PPAR-γ蛋白表達

按照1.3的實驗分組干預巨噬細胞結束后,用RIPA裂解液裂解提取細胞總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣品蛋白濃度后加入蛋白上樣緩沖液煮沸備用。10% SDS-PAGE分離蛋白(FIZZ1需用12%凝膠),半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。一抗:KLF4(1 ∶1 000)、FIZZ1(1 ∶500)、PPAR-γ(1 ∶200)、GAPDH(1 ∶5 000),以GAPDH作為內(nèi)參;二抗(1 ∶5 000)?；瘜W發(fā)光法檢測,圖像采集,ImageJ軟件進行圖像分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料用均數(shù)±標準差表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗方法,多組數(shù)據(jù)比較用方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。所有試驗均進行3次。

2 結果

2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的鑒定

用流式細胞儀對提取的小鼠腹腔巨噬細胞進行鑒定。根據(jù)細胞大小選取合適的流式細胞儀記錄門,排除雜質(zhì)及細胞碎片的影響,流式細胞儀記錄提取細胞的散點圖(見圖1A);提取的巨噬細胞表面高表達F4-80和CD11b,提取的純度可達95%以上(見圖1B)。

圖1 流式細胞儀對提取的小鼠腹腔巨噬細胞進行鑒定Figure 1 Identification of murine peritoneal macrophages using flow cytometry

提取的小鼠腹腔巨噬細胞在普通的光學顯微鏡下觀察(×20)發(fā)現(xiàn),剛分離出來時細胞呈圓形,未貼壁,培養(yǎng)10-12 h觀察基本已全部貼壁。細胞形狀大部分多角形,少數(shù)細胞有偽足伸出(見圖2)。

2.2 姜黃素對小鼠腹腔巨噬細胞細胞活力的影響

為了排除姜黃素對小鼠腹腔巨噬細胞細胞活力的影響,用MTT法檢測不同濃度姜黃素(0,6.25,12.5,25,30,50 μmol/L)干預巨噬細胞6,12,24 h的細胞活力,為后續(xù)的研究獲取合適的干預濃度和干預時間。結果提示,0-25 μmol/L姜黃素干預巨噬細胞6 h和12 h對細胞活力無明顯影響,但是12.5,25,30,50 μmol/L姜黃素干預24 h細胞活力明顯被抑制(見圖3)。因此后續(xù)實驗中選取6.25,12.5,25 μmol/L姜黃素作用12 h進行干預。

圖2 分離提取的小鼠腹腔巨噬細胞貼壁后形態(tài) (×20)Figure 2 Appearance of murine peritoneal macrophages after adherent culture (×20)

2.3 姜黃素上調(diào)小鼠腹腔巨噬細胞M2表型標志分子的表達

不同濃度姜黃素干預小鼠腹腔巨噬細胞(M0)12 h,M2表型標志分子KLF4、FIZZ1和MGL1在mRNA水平上調(diào)(見圖4),KLF4和FIZZ1在蛋白水平表達上調(diào)(見圖5),各組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖3 姜黃素對腹腔巨噬細胞活力的影響Figure 3 The effect of curcumin on peritoneal macrophages vitality

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖4 姜黃素上調(diào)小鼠腹腔巨噬細胞M2表型標記分子mRNA表達Figure 4 Curcumin upregulated the mRNA levels of M2 phenotype molecules in murine peritoneal macrophages

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖5 姜黃素上調(diào)小鼠腹腔巨噬細胞M2表型標記分子蛋白表達Figure 5 Curcumin upregulated the protein expression of M2 phenotype molecules in murine peritoneal macrophages

2.4 姜黃素對經(jīng)IL-4誘導的小鼠M2表型腹腔巨噬細胞M2標志分子表達無影響

與對照組(M2)比較,不同濃度姜黃素干預IL-4 10 ng/ml誘導的小鼠腹腔巨噬細胞(M2)12 h,M2表型標志分子KLF4、FIZZ1在mRNA水平表達及KLF4和FIZZ1在蛋白水平表達無明顯改變,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),PPARγ蛋白表達也無明顯改變,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖6)。

圖6 姜黃素對IL-4誘導的M2型巨噬細胞FIZZ1和KLF4 mRNA表達以及FIZZ1和PPAR-γ蛋白表達的影響Figure 6 Effect of curcumin on mRNA levels of KLF4 and FIZZ1 and protein expression of FIZZ1 and PPAR-γ in murine peritoneal macrophages induced by IL-4

2.5 姜黃素促進小鼠腹腔巨噬細胞向M2表型極化的機制

不同濃度姜黃素均能上調(diào)小鼠腹腔巨噬細胞(M0)PPARγ蛋白表達,各組間具有統(tǒng)計學差異(P<0.05,見圖7)。用PPAR-γ阻斷劑20 μmol/L GW9662與25 μmol/L姜黃素共同干預小鼠腹腔巨噬細胞(M0)12 h,M2表型標志分子KLF4和FIZZ1在mRNA和蛋白水平表達下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖8)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖7 姜黃素上調(diào)小鼠腹腔巨噬細胞PPAR-γ蛋白表達Figure 7 Curcumin upregulated the expression of PPAR-γ protein in murine peritoneal macrophages

與0 μmol/L姜黃素比較,*P<0.05;與25 μmol/L姜黃素比較,#P<0.05圖8 GW9662在mRNA和蛋白水平上抑制姜黃素誘導的小鼠腹腔巨噬細胞M2標志分子的表達Figure 8 GW9662 downregulated mRNA and protein levels of M2 phenotype molecules induced by curcumin

3 討論

姜黃素是從天南星科、姜科植物的根莖中提取出的一種具有二酮結構的化學單體成分,是傳統(tǒng)中藥姜黃的主要成分[9]。研究發(fā)現(xiàn),姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血抗動脈粥樣硬化和降血脂的藥理作用[10]。

巨噬細胞作為主要的免疫細胞參與免疫炎癥反應發(fā)生發(fā)展的全程[1]。與其他的免疫細胞一樣,巨噬細胞不是靜止的,而能對各種來自微環(huán)境的復雜刺激作出相應的反應,表現(xiàn)出高度的可塑性和異質(zhì)性[11]。M1表型巨噬細胞可誘導產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)(例如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12等)增加和維持炎癥反應進程,但持續(xù)誘導M1表型極化則能造成組織損傷及抑制傷口愈合。與M1巨噬細胞不同,M2型巨噬細胞能促進組織修復和傷口愈合,M2巨噬細胞其他重要的功能是刺激血管生成、碎片清除和抑制免疫反應[12]。既往研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可通過活化PPAR-γ誘導RAW264.7源性M1巨噬細胞向M2表型極化[6],證明姜黃素的抗炎機制可能是通過是逆轉(zhuǎn)巨噬細胞M1向M2表型轉(zhuǎn)換實現(xiàn)的。本研究結果提示,不同濃度姜黃素均可誘導靜止狀態(tài)小鼠腹腔巨噬細胞(M0)表達M2表型標志分子在RNA和蛋白水平增加,并且能使PPAR-γ蛋白表達增加,當加入PPAR-γ阻斷劑GW9662后,上述作用被抑制,表明姜黃素也可通過活化PPAR-γ直接誘導巨噬細胞向M2表型極化;但同時研究結果提示,姜黃素對于已經(jīng)極化成M2表型的巨噬細胞的表型轉(zhuǎn)換無影響,考慮經(jīng)IL-4誘導極化的M2表型巨噬細胞已經(jīng)為巨噬細胞活化的最佳狀態(tài),PPAR-γ已充分活化,再給予PPAR-γ激動劑姜黃素后也不能誘導更多的PPAR-γ表達。

目前又有許多研究相繼報道了比較新的誘導巨噬細胞向M2表型極化的條件,如低強度運動、脂聯(lián)素、阿奇霉素、替米沙坦、羅格列酮等可以誘導巨噬細胞向M2型方向分化[13-15]。本研究的新意在于提示姜黃素也能直接誘導靜止狀態(tài)巨噬細胞(M0)表達M2表型標志分子增加,促進巨噬細胞向M2表型極化。因為M2表型巨噬細胞具有抗炎、修復、促進傷口愈合的作用,姜黃素促進巨噬細胞向M2表型極化進一步也支持了姜黃素的抗炎、修復、促進膠原合成的作用。

綜上所述,姜黃素可通過活化PPAR-γ誘導M1表型巨噬細胞向M2表型極化,而且也可以通過活化PPAR-γ直接將靜止狀態(tài)小鼠腹腔巨噬細胞(M0)誘導成M2表型。本研究結果為姜黃素的抗炎、修復、免疫調(diào)節(jié)機制的研究在細胞水平上提供了新的理論支持,為相關疾病的新藥治療提供了線索。