謝曉冬 殷敏 李茜 陳楠

摘要闡明納米材料的細胞外排途徑對于其在臨床醫(yī)療方面的應用轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。然而，對于納米材料是否會在細胞遷移的過程中被清除，還缺乏直接的證據(jù)和結(jié)論。本研究以金納米顆粒（AuNPs）作為成像探針，利用暗場顯微鏡實時地觀察和分析了細胞遷移過程中，AuNPs在收縮絲內(nèi)的運動和外排過程。結(jié)果表明，部分被細胞攝取的AuNPs存在于收縮絲內(nèi)，且顆粒的運動速率隨著其與胞體距離的增大而減小，當收縮絲與胞體斷開聯(lián)系后，AuNPs被遺留在胞外。研究結(jié)果表明，外源性的納米材料可以在細胞遷移過程中被外排。此研究結(jié)果有助于設(shè)計更安全高效的納米材料，并應用于診斷和治療。

關(guān)鍵詞金納米顆粒; 暗場成像; 細胞遷移; 外排作用

1引 言

納米材料被廣泛應用于人類疾病（如癌癥和糖尿病）的診斷和治療中[1，2]，但是，納米材料進入人體后，會經(jīng)過肝、腎以及免疫系統(tǒng)等途徑被清除，降低了靶向診療的效率[3，4]。Poon等[5]詳細研究了納米材料的肝膽清除路徑，指出肝臟細胞與材料的相互作用是肝臟清除過程的關(guān)鍵。納米材料可以通過外泌體介導的胞吐作用被細胞外排[6，7]。因此，研究人員嘗試通過表面修飾來調(diào)控納米材料的細胞外排過程，如Oh等[8]在AuNPs表面修飾PEG，減少了巨噬細胞對于金納米顆粒 （Gold nanoparticles， AuNPs）的外排; Qian等[9]在材料表面修飾microRNA，延長了納米載體在腫瘤細胞內(nèi)的駐留。近期的研究發(fā)現(xiàn)，除了經(jīng)典的分泌外排方式，細胞還通過遷移性胞吐（Migracytosis）過程釋放一些內(nèi)源性物質(zhì)。細胞遷移時，會在其后方形成收縮絲（Retraction fiber）結(jié)構(gòu)，收縮絲上存在一些遷移體（Migrasome），這是一類直徑為0.5～3.0 μm的囊泡結(jié)構(gòu)。遷移體在細胞遷移離開后會留在原地，可以被其它細胞所攝取[10，11]。例如，在斑馬魚原腸胚發(fā)育階段，一些調(diào)控信號（如趨化因子）會通過這種方式釋放和傳遞，并在斑馬魚組織器官的形成中起關(guān)鍵作用[12]。這種遷移性胞吐被認為是一種新的細胞外排機制。細胞遷移是一種普遍現(xiàn)象[13]，如癌細胞擴散常給癌癥的治療造成巨大困難[14]。但是，對于納米顆粒是否會在細胞遷移的過程中被外排，尚無明確結(jié)論，這阻礙了納米材料在癌癥診療中的進一步應用。

研究納米材料細胞外排的常見方法主要包括電感耦合等離子質(zhì)譜（Inductively coupled plasma mass spectrometry， ICPMS）、透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope， TEM）、熒光檢測、單顆粒示蹤（Single particle tracking， SPT）等。其中，ICPMS在進行樣品處理和元素定量分析的過程中會破壞細胞結(jié)構(gòu)[15]; TEM需要對細胞樣品進行固定，無法獲取納米顆粒外排過程的動態(tài)信息。熒光檢測適用于某些熒光納米材料（如量子點Quantum dots， QDs），其它材料卻需要額外的熒光標記，這一過程可能對納米材料的性質(zhì)產(chǎn)生影響，并改變其與細胞的相互作用[16]; 而且，一些熒光染料容易發(fā)生光漂白（Photo bleaching），不適合進行長時間觀察。此外，納米材料的尺寸可以影響其外排能力，然而，基于熒光探針的成像和示蹤手段很難有效區(qū)分大小不一的納米顆粒聚集體。針對上述研究方法的局限性，以納米貴金屬為探針的暗場成像技術(shù)提供了一種替代性方法[17～19]。基于局域表面等離子體效應（Localized surface plasmon resonance， LSPR）[20]，40 nm的AuNPs單顆粒呈現(xiàn)明亮的綠色信號，聚集后因為散射光譜的紅移而變?yōu)辄S色[21]，可以有效區(qū)分單顆粒和聚集體。AuNPs的散射光信號不易發(fā)生光漂白，適于長時程觀察，已被應用于活細胞成像研究[22，23]。

本研究采用AuNPs作為暗場成像探針，借助單顆粒示蹤方法研究了細胞遷移過程中AuNPs的外排情況。結(jié)果表明，細胞在遷移過程中形成了收縮絲和遷移體結(jié)構(gòu)，AuNPs以單顆?；蚓奂w的形式存在于收縮絲中，并隨著胞質(zhì)一起朝胞體方向運動。AuNPs的運動與其距胞體的距離相關(guān)，距離越遠，AuNPs的運動速率越低，并在細胞遷移離開后被排出胞外。本研究證明了納米顆?？赏ㄟ^細胞遷移介導的方式被排出胞外，此研究結(jié)果對于設(shè)計安全高效的納米載體具有指導意義。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

緊口細胞組織研磨器（美國Kimble公司）; 制備囊泡的支撐膜和多孔聚碳酸酯膜（孔徑400 nm，美國Avanti公司）; Nano ZS90粒度儀（英國Malvern公司）; Tecnai G2 Sphera場發(fā)射透射電子顯微鏡（200 kV， 美國FEI公司）; TCS SP8激光共聚焦顯微鏡（德國Lecia公司）; IX71倒置暗場顯微鏡（日本Olympus公司）; PIXIS 256光譜儀（ Princeton公司）。

膠體金溶液（40 nm， BBI solutions）、MEM 細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素（Penicillin）、胰酶（Trypsin）、鏈霉素（Streptomycin）和左旋谷氨酰胺（Lglutamine），均購自美國Life Technology公司; HeLa 細胞（上海生命科學研究院）; mEmeraldCD81質(zhì)粒（#55013， Addgene公司）; Lipofectamine 3000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒（Thermo Fisher公司）; 35 mm玻璃底細胞培養(yǎng)皿（Cellvis公司）。60 mm和150 mm細胞培養(yǎng)皿（Corning公司）; 蛋白酶抑制劑（A32955， Thermo Fisher公司）; 實驗所用水為Milli Q超純水（Millipore公司）。巰基修飾和熒光標記的寡核苷酸（Takara公司），核酸序列分別為（S1： 5'SHAAAAAAAAAAGAGCTGCACGCTGCCGTC3'， S2CY3： 5'CY3GACGG CAGCGTGCAGCTC3'）; 0.1 mol/L的PBS緩沖液（pH 7.4， 42 mmol/L KH2PO4， 8 mmol/L Na2HPO4， 136 mmol/L NaCl， 2.6 mmol/L KCl）和0.2 mol/L 的PB緩沖液（pH 7.4， 162 mmol/L Na2HPO4， 38 mmol/L NaH2PO4）; 其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2細胞培養(yǎng)

HeLa 細胞在含有10% 胎牛血清、100 units/mL青霉素、100 units/mL 鏈霉素和 2 × 103 mol/L 谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)基中， 37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

2.3細胞膜材料的提取

細胞膜提取采用低滲裂解和差速離心法[24]。培養(yǎng)HeLa細胞（數(shù)量大于1 × 108），采用含有2 mmol/L EDTA的PBS（pH 7.4）預冷溶液使細胞脫壁，然后以500 × g 轉(zhuǎn)速離心收集細胞。用含有蛋白酶抑制劑的低滲裂解液（2× 102 mol/L TrisHCl， 10 mmol/L KCl， 2 mmol/L MgCl2， pH 7.5）在冰水浴環(huán)境裂解細胞10 min，用緊口細胞組織研磨器研磨細胞裂解液，使細胞充分破碎。3200 ×g離心5 min后收集上清液，再次20000 × g離心20 min后收集上清液，以100000 × g超速離心60 min后收集細胞膜沉淀，最后以含有1? mmol/L EDTA的10 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）溶液重懸。

2.4AuNPs修飾DNA熒光鏈

采用加鹽老化法[22]在AuNPs表面修飾巰基DNA鏈，并與互補的熒光DNA鏈雜交。14.9 nmol/L AuNPs原液與采用超純水新溶解的0.1 mmol/L SHDNA鏈（S1）以1∶1000（n/n）的比例混合，25℃下?lián)u床（350 r/min）孵育8 h。然后，加入0.1 mol/L PB緩沖液（pH 7.4）至終濃度為10 mmol/L，10 min后，分4次加入2 mol/L NaCl溶液，每次間隔30 min，至終濃度為0.1 mol/L。孵育12 h后，再以8000 × g轉(zhuǎn)速離心5 min， 移去上清液，用10 mmol/L PB緩沖液重懸清洗，然后將樣品轉(zhuǎn)移至0.1 mol/L PBS緩沖液（pH 7.4）中，AuNP濃度為1? nmol/L，取新溶解的0.1 mmol/L DNACY3熒光鏈（S2CY3）與DNAAuNPs樣品混合（3000∶1， n/n），并于37℃避光孵育30 min，以完成熒光鏈的雜交。最后，樣品通過離心去除上清液中游離的S2CY3鏈，并重懸于PBS緩沖液中，備用。

2.5材料包膜組裝、純化和表征

采用擠出法[24]制備HeLa細胞膜包裹的AuNPs。將提取的細胞膜材料冰水浴超聲（40 kHz， 100 W， 5 min），取1 mL膜溶液與0.05 mL 1.5 nmol/L AuNPs或DNAAuNPs溶液混合，采用400 nm孔徑的多聚碳酸酯膜將混合液反復擠出5～10次，收集液體， 以6000 × g離心8 min，取沉淀，并用PBS溶液重懸，再以相同條件離心兩次，去除游離的膜材料。將得到的AuNP@CMVs溶液超聲（40 kHz， 100 W， 5 min）。采用粒度儀對純化后的AuNPs@CMV的水合粒徑以及表面Zeta電勢進行測量。采用透射電鏡觀察AuNP@CMVs材料的結(jié)構(gòu)與形貌。

2.6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

HeLa細胞接種到35 mm玻璃底細胞培養(yǎng)皿，過夜培養(yǎng)至80%匯合度時，按照Lipofectamin 3000試劑盒說明進行轉(zhuǎn)染。加入質(zhì)粒DNA脂質(zhì)體復合物，包含DNA 500 ng、P3000試劑1 μL、Lipofectamine試劑0.75 μL。轉(zhuǎn)染后的細胞在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)過夜。

2.7材料孵育細胞

培養(yǎng)在35 mm玻璃底細胞培養(yǎng)皿的HeLa細胞，除去培養(yǎng)基，并用PBS漂洗兩次，每個培養(yǎng)皿中加入500 μL包含50 pmol/L AuNPs的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后， 漂洗去除胞外材料。

2.8細胞成像與光譜采集

對于熒光成像，將攝入材料的mEmeraldCD81質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞固定后置于共聚焦顯微鏡下觀察。CY3標記的AuNPs采用561 nm 氦氖激光器激發(fā)，檢測通道設(shè)置為570～620 nm，使用紅色偽彩，CD81mEmerald采用488 nm激光激發(fā)，檢測通道為500～550 nm，采用綠色偽彩，NA=1.4063X 的油鏡成像。對于暗場成像，將攝入材料的活細胞樣品置于暗場顯微鏡下觀察。采用60倍油鏡 （數(shù)值孔徑0.65），DP74高速真彩CCD進行圖像采集，其中曝光時間為50 ms，成像尺寸為1920×1200，圖像采用ImageJ軟件進行處理和分析。光譜采集的曝光時間為1 s。

3結(jié)果與討論

3.1AuNP@CMVs的制備與表征

細胞對于探針的足量攝取是研究納米材料外排的基礎(chǔ)。納米顆粒的尺寸可以影響其細胞攝取效率， Chithrani等[25]的研究表明， 40～50 nm的AuNPs具有比其它尺寸AuNPs更高的細胞攝取效率。細胞膜包裹是一種常用的、增強同類細胞攝取的方法，如Zhu等[26]采用HeLa癌細胞膜包裹磁性納米顆粒，實現(xiàn)了更好的腫瘤靶向效果。因此，本研究選取40 nm的AuNPs，包裹HeLa細胞膜，制備得到細胞膜包裹的AuNPs復合結(jié)構(gòu)（AuNP@CMVs）。采用透射電鏡對材料形貌進行表征，發(fā)現(xiàn)AuNPs@CMVs顆粒具有典型的核殼結(jié)構(gòu)[27]，且表面覆蓋有約6 nm的半透明層（圖1A）。利用動態(tài)光散射測量AuNP@CMVs的水合粒徑，結(jié)果表明，包膜后的AuNPs具有較好的分散度（圖1B），其粒徑比AuNPs增加了約20 nm（圖1C）; 而其表面電勢下降至Symbolm@@10 mV左右（圖1D）?；诒狙芯拷M前期的工作[22]，利用巰基DNA單鏈（S1鏈）對AuNP表面進行修飾，并與標記有CY3熒光的互補DNA鏈（S2鏈）進行雜交，實現(xiàn)了對AuNP@CMVs探針的熒光標記。根據(jù)動態(tài)光散射測定的結(jié)果，與采用AuNPs制備的DNAAuNP@CMVs粒徑（87.3 nm）相比，采用DNAAuNPs制備的DNAAuNP@CMVs的水合粒徑 （132.1 nm） 有所增大; DNAAuNP@CMVs表面電勢為

為了考察細胞對于AuNP@CMVs探針的攝取情況，HeLa細胞與AuNP@CMVs共孵育4 h后，采用暗場顯微鏡進行觀察，成像結(jié)果如圖1E所示，細胞整體形態(tài)良好，且細胞內(nèi)存在大量AuNPs，說明探針具有良好的生物相容性和被細胞攝取的性質(zhì)。由于局域表面等離子體效應[20]，暗場下單顆粒40 nm AuNPs具有較強的綠色散射光，而其聚集體因等離子體耦合效應[20，21]，散射光譜波峰會發(fā)生紅移。為了區(qū)分AuNPs探針的聚合狀態(tài)，細胞內(nèi)的綠色和亮黃色粒子光斑的光譜被分別采集，如圖1F所示，其散射光譜的波峰分別為541 nm（綠色）和655 nm（黃色），與文獻[22]中報道的AuNPs單顆粒和聚集體的光譜特征一致，證明這些顏色特征明顯的光斑是AuNP@CMVs探針的光學信號。上述對于探針的形貌、結(jié)構(gòu)和光學性質(zhì)的表征結(jié)果說明AuNP@CMVs被成功構(gòu)建，且適用于活細胞成像分析。

3.2AuNPs在收縮絲中的分布

研究表明，AuNPs進入細胞后，在運輸過程中發(fā)生聚集[22]，該現(xiàn)象有助于提高光熱治療的效果[28]。因此，如果進入到癌細胞內(nèi)的AuNPs在癌細胞遷移的過程中被外排，會對其治療效果產(chǎn)生負面影響。雖然目前的研究證明了細胞在遷移過程中會殘留和外排一些內(nèi)源性物質(zhì)[12]，但是，對于AuNPs等外源性納米顆粒是否會在細胞遷移時被排出胞外，還缺乏相應的研究。將HeLa細胞與AuNP@CMVs進行孵育后，利用暗場顯微鏡進行觀察發(fā)現(xiàn)，在HeLa細胞遷移過程中，在其后方產(chǎn)生了絲狀結(jié)構(gòu)（收縮絲）（圖2A和2B），在收縮絲的末端或分叉處可以觀察到球形的遷移體結(jié)構(gòu)（白色箭頭）。值得注意的是，收縮絲上確實存在AuNPs信號，包括綠色的單顆粒AuNPs和橙色的AuNPs聚集體 （圖2C和2D）。此結(jié)果提示AuNPs會在細胞遷移的過程中進入到收縮絲結(jié)構(gòu)內(nèi)。然而，AuNPs與遷移體并未表現(xiàn)出明顯的共定位關(guān)系。

采用熒光顯微鏡觀察了熒光標記的AuNPs在細胞遷移過程中的分布。遷移體結(jié)構(gòu)的形成與四跨膜蛋白超家族（Tetraspanin family）有關(guān)。此類蛋白家族有33個成員，且在各類細胞中均有表達，其中Tetraspanin 4和CD81等蛋白的表達水平與遷移體的數(shù)量顯著相關(guān)[11]。因此，融合有綠色熒光蛋白的CD81被選擇作為標記遷移結(jié)構(gòu)的分子。在HeLa細胞中轉(zhuǎn)染表達了CD81mEmerald質(zhì)粒，熒光共聚焦顯微成像的結(jié)果表明，CD81分散于細胞膜上，清晰地標記了細胞膜和收縮絲等結(jié)構(gòu)（圖2E）。與CY3標記的DNAAuNP@CMVs進行孵育后，發(fā)現(xiàn)CY3熒光修飾的AuNPs信號（紅色偽彩）與收縮絲（綠色偽彩）存在良好的共定位關(guān)系（圖2F）。在圖2F中白色箭頭所指部位，測量了劃線處的AuNPs和收縮絲兩個通道的熒光強度分布，結(jié)果表明AuNPs確實存在于收縮絲內(nèi)部（圖2E），進一步證明了暗場顯微成像的結(jié)果，即在細胞遷移的過程中，細胞內(nèi)的AuNPs會留存于收縮絲等結(jié)構(gòu)中，增加了其被外排的可能性。

3.3AuNPs在收縮絲中的運動

靜態(tài)成像的結(jié)果表明，部分AuNPs定位于收縮絲內(nèi)，但尚不明確AuNPs是否會隨著胞質(zhì)回收又重新回到胞體中，或是通過細胞遷移介導的胞吐作用被外排。因此，利用暗場顯微鏡對AuNPs探針在活細胞遷移過程中的運動進行了實時觀察。如圖3A所示，收縮絲可按照其距離胞體的遠近分為近、中和遠3個區(qū)域（分別用紅色、綠色和藍色線框標注），對3個區(qū)域中收縮絲上所有AuNPs在330 s持續(xù)觀察窗口（每幀時間間隔為1 s）內(nèi)的運動情況分別進行了追蹤。如圖3B中的粒子運動軌跡圖所示，在胞體近區(qū)（Near），AuNPs沿著收縮絲朝向胞體方向運動; 在收縮絲的中部（Middle）和遠端（Far）區(qū)域，部分AuNPs的運動軌跡較短。對于3個區(qū)域中的AuNPs的運動速度進行統(tǒng)計，結(jié)果表明，近、中、遠區(qū)域的AuNPs運動的平均速度分別為0.15、0.07和0.03 μm/s，隨著其與胞體的距離增加而顯著下降（圖3C）。上述結(jié)果表明，胞質(zhì)在收縮絲中的運動，與胞體距離呈反比，即離細胞體越遠，運動能力越弱。

3.4細胞遷移介導的AuNPs外排

對于遷移性外排的研究表明，隨著細胞的進一步遷移，當胞體與收縮絲斷開聯(lián)系后，存在于收縮絲和遷移體中的物質(zhì)被遺留在細胞外[11]。利用暗場顯微成像對細胞遷移后殘留的收縮絲結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明，AuNPs被留在了斷開的收縮絲結(jié)構(gòu)內(nèi)，實現(xiàn)了細胞遷移介導的外排（圖4A和4B）。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體介導的胞吐作用會隨著納米材料尺寸的增加而減弱，如Chithrani等[29]發(fā)現(xiàn)粒徑為14、50和70 nm的AuNPs在1 h的外排百分比分別為35%、10%和5%。為了驗證遷移性外排是否也受到納米顆粒尺寸的調(diào)控，對于殘留在收縮絲結(jié)構(gòu)中的AuNPs單顆粒和聚集體分別進行了統(tǒng)計，結(jié)果表明， 68.4%為聚集體，316%為單顆粒（圖4C）。此比例與本研究組前期工作[22]中報道的細胞內(nèi)AuNPs的聚集比例（Cluster/Single≈7∶3）非常接近，說明細胞遷移介導的AuNPs的外排并未表現(xiàn)出尺寸選擇性。這一結(jié)果表明細胞可通過這種途徑排出不同尺寸的納米材料。上述結(jié)果提供了外源性納米顆粒在細胞遷移過程中發(fā)生外排的可視化證據(jù)，并提示了這一外排途徑與經(jīng)典的外泌體外排途徑具有不同的調(diào)控和選擇方式。

4結(jié) 論

與納米顆粒的細胞攝取機制相比，外排的途徑和機制研究較為有限，在一定程度上阻礙了納米生物試劑的應用拓展。最近的研究揭示了遷移性外排這一新的外排途徑，并證明了此途徑在細胞間通訊和胚胎發(fā)育等生理過程中發(fā)揮重要作用。然而，尚無證據(jù)表明外源性納米顆粒是否存在細胞遷移介導的外排。本研究采用AuNPs探針，結(jié)合暗場成像和單顆粒示蹤等研究手段，探索了細胞遷移過程中外源性納米材料的外排途徑。結(jié)果表明，細胞遷移過程中會形成收縮絲結(jié)構(gòu)，部分AuNPs定位在收縮絲內(nèi)，隨著胞質(zhì)回收向胞體方向運動，且運動速率與其到胞體的距離呈反比; 當細胞與收縮絲斷開后，無法回收的AuNPs被排出細胞。本研究提供了細胞遷移介導的納米材料外排過程的成像證據(jù)，并發(fā)現(xiàn)此途徑與外泌體介導的胞吐作用具有不同的選擇性。本研究結(jié)果對于設(shè)計更加高效的納米藥物和腫瘤診療探針具有重要意義。

19LU Shuang， FANG WeiNa， WANG LiHua， LIU HuaJie. Acta Polymerica Sinica， ?2019，? 50（9）： 964-972

魯 爽， 方維娜， 王麗華， 柳華杰. 高分子學報， ?2019，? 50（9）： 964-972

20ZHANG Teng， ZHONG YiHan， ZHANG ShouTing， DANG XinYu， LU XiaoQuan. Chinese J. Anal. Chem.，2019，? 47（9）： 1373-1381

張 滕， 仲逸涵， 張守婷， 黨昕宇， 盧小泉. 分析化學， ?2019，? 47（9）： 1373-1381

21Liu M， Chao J， Deng S， Wang K， Li K， Fan C. Colloids Surf. B，2014，? 124： 111-117

22Liu M， Li Q， Liang L， Li J， Wang K， Li J， Lv M， Chen N， Song H， Lee J， Shi J， Wang L， Lal R， Fan C. Nat. Commun.，2017，? 8 （1）： 15646

23Shen J， Liang L， Xiao M， Xie X， Wang F， Li Q， Ge Z， Li J， Shi J， Wang L， Li L， Pei H， Fan C. J. Am. Chem. Soc.，2019，? 141（30）： 11938-11946

24Fang R H， Hu C M J， Luk B T， Gao W， Copp J A， Tai Y， O'connor D E， Zhang L. Nano Lett.，2014，? 14（4）： 2181-2188

25Chithrani B D， Ghazani A A， Chan W C W. Nano Lett.，2006，? 6（4）： 662-668

26Zhu J Y， Zheng D W， Zhang M K， Yu W Y， Qiu W X， Hu J J， Feng J， Zhang X Z. Nano Lett.，2016，? 16（9）： 5895-5901

27Fang R H， Kroll A V， Gao W， Zhang L. Adv. Mater.，2018，? 30（23）： 1706759

28Yang Y， Hu Y， Du H， Wang H. Chem. Commun.，2014，? 50（55）： 7287-7290

29Chithrani B D， Chan W C W. Nano Lett.，2007，? 7（6）： 1542-1550