馬雪梅 王晶 馬雷

[摘要] 目的 探討Th22細(xì)胞及效應(yīng)因子IL-22在肺癌患者外周血中的表達(dá)程度，并探討其與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小、病理類型的相關(guān)性。 方法 選取2018年11月～2019年5月在我院住院確診的肺癌患者40例為實(shí)驗(yàn)組;對(duì)照組為隨機(jī)選取來自于同一時(shí)期門診體檢的40例健康人群;用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中Th22細(xì)胞（CD4+IL-22+）的比例，用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)血清中IL-22濃度變化;對(duì)比觀察兩組Th22細(xì)胞及IL-22因子的表達(dá)變化。 結(jié)果 在肺癌患者中，Th22細(xì)胞、IL-22因子的表達(dá)均高于對(duì)照組（P<0.01），從相關(guān)性分析圖看出二者呈正相關(guān)（r=0.631，P<0.01）;且實(shí)驗(yàn)組患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比較，Th22細(xì)胞、IL-22因子數(shù)值增大，差異有顯著性（P<0.05）;實(shí)驗(yàn)組隨著腫瘤直徑逐漸增大，病理類型不同，Th22細(xì)胞、IL-22因子數(shù)值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 肺癌患者外周血中Th22、IL-22表達(dá)頻率明顯升高，與肺癌病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小密切相關(guān)，有望為肺癌的研究增添新的思路。

[關(guān)鍵詞] 肺癌;Th22細(xì)胞;IL-22因子;流式細(xì)胞術(shù)

[中圖分類號(hào)] R734.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）13-0011-04

[Abstract] Objective To explore the expression level of Th22 cells and effector IL-22 in peripheral blood of patients with lung cancer， and to explore its correlation with lymph node metastasis， tumor size and pathological type of lung cancer. Methods Forty patients with lung cancer diagnosed in our hospital from November 2018 to May 2019 were collected as the experimental group. The 40 healthy people who underwent outpatient physical examination at the same period were set as the control group. The proportion of Th22 cells （CD4+ IL-22+） in peripheral blood was detected by flow cytometry. The change of serum IL-22 concentration was detected by enzyme-linked immunosorbent （ELISA） method. The changes of Th22 cells and IL-22 factor expression between two groups were compared and observed. Results In lung cancer patients， the expressions of Th22 cells and IL-22 factors were higher than those in the control group（P<0.01）. The correlation analysis chart showed that the two were positively correlated（r=0.631，P<0.01）. And in the experimental group，the values of Th22 cells and IL-22 factors in the lymph node metastasis group were increased compared with those of the non-lymph node metastasis group（P<0.05）. As the tumor diameter gradually increased in the experimental group， the pathological types were different， and the values of Th22 cells and IL-22 factors increased， and the differences were statistically significant（P<0.01）. Conclusion The frequency of Th22 and IL-22 expression in peripheral blood of lung cancer patients was significantly increased， which is closely related to the pathological type of lung cancer， lymph node metastasis， and tumor size. It is expected to add new ideas for the study of lung cancer.

[Key words] Lung cancer; Th22 cells; IL-22 factor; Flow cytometry

原發(fā)性支氣管肺癌簡稱肺癌，起源于支氣管黏膜上皮及肺泡，是我國及世界范圍內(nèi)發(fā)病及死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類健康[1]，因此探索早期診斷、治療肺癌對(duì)肺癌患者預(yù)后有重要意義。腫瘤疾病的進(jìn)展與炎癥反應(yīng)、免疫功能改變相關(guān)，炎癥反應(yīng)能夠逃避免疫殺傷并且起到促腫瘤的作用[2];近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Th22細(xì)胞是一種新型、獨(dú)立的CD4+輔助性T細(xì)胞亞群，IL-22是其分泌的重要細(xì)胞因子，二者在炎癥性疾病中的表達(dá)增高[3]，在腫瘤疾病中，已有研究表明Th22細(xì)胞及其分泌的IL-22因子在肝癌、胃癌、胰腺癌等均有表達(dá)[4]，但對(duì)于二者與肺癌的關(guān)系鮮有報(bào)道，因此本研究擬探討Th22細(xì)胞與IL-22效應(yīng)因子在肺癌發(fā)病中的表達(dá)情況及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年11月～2019年5月在我院確診的肺癌患者40例作為實(shí)驗(yàn)組，年齡40～83歲，平均（68.2±9.3）歲，男24例，女16例，所有病例均經(jīng)病理組織學(xué)檢測(cè)確診為肺癌;健康對(duì)照組40例，為同期于我院體檢的健康者，其中男28例，女12例，年齡36～80，平均（64.9±11.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡>18歲;（2）已確診并明確病理及組織分型的原發(fā)性肺癌患者;（3）既往未接受過放化療治療，且未應(yīng)用免疫抑制劑治療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有肺結(jié)核、肺部急性感染等其他肺部疾病的肺癌患者;（2）有嚴(yán)重心、肝、腎功能有異常的患者;（3）有其他惡性腫瘤史的癌癥患者;（4）腫塊直徑>7 cm的肺癌患者。實(shí)驗(yàn)組40例患者中，腫瘤直徑d<2 cm的患者5例，2 cm≤腫瘤直徑d<3 cm有10例，3 cm≤腫瘤直徑d<5 cm有17例，5 cm≤腫瘤直徑d<7 cm有8例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，小細(xì)胞癌11例，非小細(xì)胞癌29例。研究資料收集經(jīng)研究對(duì)象知情同意，遵守倫理學(xué)的各項(xiàng)規(guī)定，兩組的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 儀器及試劑

美國BD公司流式細(xì)胞儀、芬蘭（Labsystems Multiskan MS）公司352型酶標(biāo)儀、中國海爾4℃和-20℃冰箱，-80℃超低溫冰箱，北京索萊寶科技有限公司人外周淋巴細(xì)胞分離液、BD PharMingen、anti-CD4-APC試劑、Biolegend、anti-IL-22-PE，及相應(yīng)同型對(duì)照抗體，莫能霉素及破膜劑均來自美國BD公司，ELISA 檢測(cè)試劑盒來自上海信帆生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血液標(biāo)本的采集? 用肝素抗凝采血管采集入組患者的靜脈血4 mL，用非抗凝普通采血管采集靜脈血1 mL，冰盒保存并于1 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)中心待用，待血液凝固后，將1 mL全血2500 rpm 4℃離心10 min，取上清液分裝于EP管中，每管50 μL，保存于-80℃低溫冰箱。

1.3.2 Th22細(xì)胞的檢測(cè)? 將經(jīng)過肝素鈉作抗凝處理的新鮮采集的外周4 mL全血標(biāo)本取出，混勻，加入PBS液8 mL，進(jìn)行稀釋;小心提取外周血單個(gè)核細(xì)胞后，將上述液體孵育4 h后取出孵育板，使用移液器將收集培養(yǎng)箱中細(xì)胞，盡量全部吸出，分別轉(zhuǎn)移到2個(gè)流式管中，標(biāo)記為對(duì)照管和檢測(cè)管，加入PBS吹打混勻，1200 rpm×5 min洗滌1遍后棄上清;分別吸取熒光標(biāo)記的表面抗體，anti-CD4-APC-H7加入檢測(cè)管中，對(duì)照管中加入相應(yīng)同型對(duì)照抗體，充分混勻，靜置30 min;2 mL PBS洗滌一次，200 μL的4%多聚甲醛重懸，室溫靜置20 min后，兩管中分別加入1 mL破膜劑，震蕩混勻，避光孵育后，分別再向兩管中加PBS 5 mL，離心5 min棄上清，RPMI 1640重懸;向檢測(cè)管加入細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子抗體anti-IL-22-PE;并向?qū)φ展苤屑尤胪蛯?duì)照抗體，充分混勻后，4℃條件下避光孵育30 min;PBS 5 mL洗滌后重懸，將重懸后的細(xì)胞液體采用 BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果以CD4+IL-22+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 IL-22的檢測(cè)? 將待測(cè)標(biāo)本及ELISA試劑盒預(yù)先從冰箱拿出，并拆除密封袋，核對(duì)好所需實(shí)驗(yàn)試劑，嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒操作步驟檢測(cè)血清中IL-22表達(dá)水平，測(cè)出OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析;相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Th22細(xì)胞和IL-22因子表達(dá)水平比較

兩組外周血中，Th22細(xì)胞（CD4+ IL-22+T）的表達(dá)水平見表1：實(shí)驗(yàn)組Th22的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.01），實(shí)驗(yàn)組IL-22表達(dá)較對(duì)照組升高，差異均有顯著性（P<0.01）。

2.2 Th22與IL-22與肺癌患者腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

由表2可以看出隨著腫瘤直徑的增大，Th22、IL-22的數(shù)值增加，差異具有顯著性（P<0.01）。肺癌患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組二者的數(shù)值增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 Th22、IL-22在不同肺癌病理類型中的表達(dá)比較非小細(xì)胞癌者與小細(xì)胞癌組者比，Th22細(xì)胞、IL-22因子數(shù)值增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表3。

2.4 肺癌患者Th22與IL-22表達(dá)相關(guān)性分析

由圖1看出，Th22細(xì)胞與IL-22因子表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.631，P<0.01）。

3 討論

依據(jù)GLOBOCAN估算，2012年全球患有癌癥人數(shù)可達(dá)1410萬人，因其死亡人數(shù)達(dá)820萬，其中肺癌是最常見的腫瘤之一，新發(fā)病人數(shù)可達(dá)180萬，占癌癥總診斷率的13%左右[5]，由此可見肺癌所占較高比率，對(duì)于肺癌應(yīng)更早地診療，有助于改善肺癌患者的后期生活質(zhì)量。體液免疫和細(xì)胞免疫組成了機(jī)體的免疫系統(tǒng)，而細(xì)胞免疫在抗腫瘤中發(fā)揮重要作用，在細(xì)胞免疫中起主要作用的效應(yīng)細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞[6]。Duhen T等[7]在2009年發(fā)現(xiàn)Th22細(xì)胞是一種新型Th細(xì)胞，并提出高分泌IL-22細(xì)胞因子，因此對(duì)于二者的研究越來越多，Th22細(xì)胞及效應(yīng)因子IL-22因子存在于很多疾病中，在炎癥性疾病中，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、白塞病中，二者均呈高表達(dá)[8]，另外其還參與了表皮免疫和修復(fù)，有專家指出[9]Th22細(xì)胞在機(jī)體病毒感染、黏膜免疫反應(yīng)過程中起到重要作用，因此Th22細(xì)胞可能通過某種生物學(xué)作用參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤系統(tǒng)疾病中，馬詩家[10]發(fā)現(xiàn)Th22細(xì)胞與IL-22因子在原發(fā)性肝癌患者外周血中高表達(dá)，并指出二者對(duì)腫瘤免疫機(jī)制及病理過程有調(diào)節(jié)作用。Curd LM等[11]實(shí)驗(yàn)提出，IL-22在人胰腺癌HPAFII細(xì)胞中能夠刺激VEGF和免疫抑制細(xì)胞因子的生成、引起STAT-3磷酸化，這表示IL-22在人胰腺癌細(xì)胞中能促進(jìn)腫瘤生長。在乳腺癌的實(shí)驗(yàn)中，已有結(jié)果表明：IL-22通過促進(jìn)MAP3K8導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，且與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、臨床分期、Her-2的表達(dá)、Ki-67有相關(guān)性，Th22細(xì)胞、IL-22因子與乳腺癌發(fā)病密切相關(guān)。胡云雙等[12]研究指出，在細(xì)胞處于癌變環(huán)境時(shí)，Th17與Th22某些因素存在差別時(shí)，炎癥細(xì)胞能夠表達(dá)相關(guān)的變異，進(jìn)而使IL22+Th17細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，在宮頸癌患者組Th17和Th22細(xì)胞表達(dá)升高，且Th22細(xì)胞與CC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在肺癌研究方面，有學(xué)者報(bào)道[13]在大、小細(xì)胞肺癌中，發(fā)現(xiàn)IL-22及其受體IL-22R1的高表達(dá)，通過STAT-3通路加速肺癌細(xì)胞的生長。同時(shí)楊毅等[14]實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Th22、IL-22、1β在非小細(xì)胞肺癌患者外周血中表達(dá)升高，提示二者可能參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生。大量研究提示，Th22細(xì)胞及IL-22因子共同的生物學(xué)作用能夠參與炎癥及免疫抑制的調(diào)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此設(shè)計(jì)本次實(shí)驗(yàn)，探索二者在肺癌外周血的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，肺癌患者外周血中，Th22細(xì)胞與IL-22因子表達(dá)較健康對(duì)照者升高（P<0.01），并且由圖1可以看出，二者呈正相關(guān)，表示Th22可能通過分泌IL-22因子，間接或直接參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，在肺腫瘤大小中，腫瘤直徑越大，Th22的數(shù)值越大（P<0.01），同時(shí)IL-22的數(shù)值越大（P<0.01），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Th22和IL-22數(shù)值和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)值不同，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)值要大于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)值（P<0.05），在病理類型中，小細(xì)胞肺癌的Th22和IL-22數(shù)值和非小細(xì)胞肺癌的數(shù)值不同，且非小細(xì)胞肺癌的數(shù)值要大于小細(xì)胞肺癌的數(shù)值。由此可見Th22、IL-22與肺腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型具有相關(guān)性，在肺腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，Th22可能促進(jìn)人類腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究，隨著科研工作不斷進(jìn)展[15]，抗腫瘤藥物也在不斷更新，治療手段也在不斷進(jìn)步，通過基因檢測(cè)，預(yù)測(cè)腫瘤指標(biāo)，可以針對(duì)靶向藥物，探索治療方案，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)，為肺腫瘤疾病的防治策略提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)雜志社.中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺癌臨床診療指南（2018版）[J].腫瘤研究與臨床，2018，30（12）：793-824.

[2] Oestreich KJ，Weinmann AS.Transcriptional mechanisms that regulate T-helper 1 cell differentiation[J].Curr Opin Immunol，2012，24（2）：191-195.

[3] 任冠穎.乳腺癌外周血Th22、IL-22的表達(dá)及與臨床分期、Ca153的相關(guān)性研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2017.

[4] 馬雪梅，李偉東，楊曉東，等.Th22細(xì)胞在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，39（13）：1563-1565.

[5] Torre LA，Bray F，Siegal RL，et al.Global cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

[6] Gulen MF，Kang Z，Bulek K，et al.The receptor SIGIRR suppresses Th17cell proliferation via inhibition of the interleukin-1 receptor pathway and mtor kinase activation[J].Immunity，2010，32（1）：54-66.

[7] Duhen T，Geiger R，Jarrossay D，et al.Production of interleukin 22 but not? interleukin 17 by a subset of human skin-homing memory T cells[J]. Nat Immunol，2009， 10（8）：857-863.

[8] 徐欣欣，孫其樂，王一汀，等.Th22細(xì)胞及其效應(yīng)因子在自身免疫性皮膚病中的作用研究進(jìn)展[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2018，25（25）：43-46.

[9] Levillayer F，Mas M，Levi-acobas F，et al.Interleukin 22 is a candidate gene for Tmevp3，a locus controlling Theilers vieus-induced neurological diseases[J].Genetics，2007，176（3）：1835-1844.

[10] 馬詩家.原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者TH22細(xì)胞及其細(xì)胞因子表達(dá)的變化及意義[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2014.

[11] Curd LM，F(xiàn)avors SE，Gregg RK. Pro-tumour activity of interleukin-22 in HPAFII human pancreatic cancer cells[J].Clin ExpImmunol，2012，168（2）：192-199.

[12] 胡云雙，周旺展，張穎，等.Th22和Th17細(xì)胞在宮頸癌患者外周血中的表達(dá)[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，49（3）：210-213.

[13] Kobold S，Volk S，Clauditz T，et al.Interleukin-22 is frequently expressed in small-and large-cell lung cancer and promotes growth in chemotherapy-resistant cancer cells[J].J Thorac Oncol，2013，8（8）：1032-1042.

[14] 楊毅，官俏兵，郭麗，等.IL-1β促進(jìn)nave T細(xì)胞向Th22細(xì)胞分化及在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的相關(guān)性研究[J].中國病理生理雜志，2018，34（7）：1301-1305.

[15] 朱珊珊，陳鑫，顏巧妍，等.抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2019，57（9）：164-168.

（收稿日期：2019-11-01）