陳 萍，郭 冬，楊 錦，薛佩蕓

（1. 陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046； 2. 陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

決明子為豆科決明屬植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明Cassia tora L. 的干燥成熟種子，味甘、苦、咸，微寒，歸肝經、大腸經，具有清熱明目、潤腸通便的功效[1]?，F代藥理學研究表明，決明子具有調脂、降血壓、保肝、明目、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等功效，是藥食同源物質[2－4]。其主要化學成分包括蒽醌類（橙黃決明素、蘆薈大黃素、黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等），萘并吡喃酮類（紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素－6－ O－β－D－葡萄糖苷等），脂肪酸類及多糖類等[3－5]。中藥標準湯劑作為一種標準物質和標準體系，其質量評價研究可為衡量配方顆粒質量均一性、評價配方顆粒與臨床湯劑一致性提供參考[6－11]。本研究中通過制備決明子標準湯劑，并建立特征指紋圖譜和多指標成分分析方法評價其質量?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，二極管陣列（DAD）檢測器（美國Agilent 公司）；KQ－500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為50 Hz）；BT25S 型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，精度為十萬分之一）；CP2102 型電子天平（奧豪斯儀器有限公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

橙黃決明素對照品（批號為111900 －201605，含量為98.3% ），蘆薈大黃素對照品（批號為110795 －201710，含量為98.3%），黃決明素對照品（批號為E －2333，含量為98.2%），大黃素對照品（批號為110756 －201512，含量為98.7% ），大黃酚對照品（批號為110796 －201621，含量為99.2%），大黃素甲醚對照品（批號為110758 －201616，含量為99.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈，磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；21批決明子飲片（編號S1－S21，批號見表1）分別產自安徽、河南、廣西、云南等地，經陜西省中醫(yī)藥研究院楊智峰教授鑒定為正品。

表1 市售21 批決明子質量考察結果

2 方法與結果

2.1 市售決明子飲片質量考察

根據2015 年版《中國藥典（一部）》決明子飲片項下規(guī)定，對市售21 批決明子飲片進行質量考察，結果見表1。

2.2 標準湯劑制備

根據國家中醫(yī)藥管理局頒布的《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》原則[12]，按表1 依次稱取15 批合格決明子飲片各150 g，分別加入8 倍量純凈水，浸泡30 min，沸騰后加熱回流30 min，趁熱過濾，藥渣再加8 倍水，加熱回流30 min，趁熱過濾，合并濾液，以水定容至2 500 mL，即得1 ～15 號樣品，備用。

2.3 標準湯劑中橙黃決明素及大黃酚含量測定[13 －14]

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Welchrom C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－0.1% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫，0 ～15 min 時38%A，15 ～30 min 時38%A －90%A，30 ～40 min 時90%A，40 ～45 min 時38%A；流 速：1.0 mL ／ min；檢測波長：284 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。分別取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，橙黃決明素和大黃酚的保留時間分別為18.436 min 和31.877 min，各成分色譜峰與相鄰峰分離度均大于1.5，理論板數均大于7 800，拖尾因子0.95 ～1.05。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.2 溶液制備

取橙黃決明素對照品、大黃酚對照品適量，精密稱定，加無水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液制成含橙黃決明素131.65 μg ／mL、大黃酚246.8 μg／mL 的混合對照品母液。精密吸取母液1.5 mL，置10 mL 容量瓶中，以無水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液稀釋至刻度，即得對照品溶液。分別精密吸取1 ～15 號標準湯劑各20 mL，加鹽酸1.0 mL，置水浴中加熱水解1 h，立即冷卻，用三氯甲烷振搖提取4 次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘渣用無水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液溶解，轉移至25 mL 容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密量取對照品母液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分別加無水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液定容于10 mL 容量瓶。分別吸取10 μL 注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定，重復2 次。以各成分的峰面積平均值（Y）為縱坐標、對應成分的質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標繪制標準曲線。結果見表2。

精密度試驗：分別取2.3.2 項下對照品溶液及供試品溶液（1 號），按擬訂色譜條件分別連續(xù)進樣6 次。結果對照品溶液中橙黃決明素及大黃酚峰面積的RSD 分別為0.09%和0.12%（n ＝6），供試品溶液中橙黃決明素及大黃酚峰面積的 RSD 分別為0.35% 和0.24%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

表2 橙黃決明素及大黃酚線性關系考察結果( n ＝6)

穩(wěn)定性試驗：取2.3.2 項下供試品溶液（1 號），分別于0，2，4，8，12，20，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定。結果橙黃決明素及大黃酚峰面積的RSD 分別為0.88%和0.96%（n ＝7），表明供試品溶液24 h 內穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一標準湯劑（1 號），依法平行制備6 份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果橙黃決明素及大黃酚峰面積的 RSD 分別為2.86% 和2.72%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的決明子標準湯劑（1 號）6 份，各2.0 mL，分別加入橙黃決明素及大黃酚對照品貯備液適量，依法制備供試品溶液，定容至5 mL，按擬訂色譜條件測定，計算回收率。結果見表3。

2.3.4 樣品含量測定

分別精密吸取2.3.2 項下1 ～15 號供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件測定，計算供試品溶液中橙黃決明素和大黃酚的含量。結果見表4。

2.4 決明子標準湯劑出膏率及轉移率測定

出膏率：精密量取1 ～15 號決明子標準湯劑各100mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于烘箱105 ℃干燥至恒 重，計 算 出 膏 率。 y（% ）＝[（m1／100 × V）／ m2] ×100%（y 為出膏率，m1為干浸膏質量，V 為樣品溶液總體積，m2為飲片質量）。結果見表4。15 批標準湯劑出膏率為9.57% ～14.39%，平均（12.32 ±1.35）%。

轉移率：計算橙黃決明素及大黃酚轉移率。指標成

表4 標準湯劑出膏率、指標成分含量及轉移率測定結果（%）

分的轉移率（%）＝(標準湯劑中指標成分的含量／飲片中指標成分的含量) ×100%。結果見表4。15 批標準湯劑橙黃決明素轉移率為82.93% ～89.53% ，平均（84.92±2.57）%；大黃酚轉移率為22.33% ～25.68%，平均（23.82 ±0.97）%。

2.5 HPLC －DVD 特征指紋圖譜

2.5.1 色譜條件

同2.3.1 項下色譜條件。

2.5.2 溶液制備

分別稱取橙黃決明素對照品、蘆薈大黃素對照品、黃決明素對照品、大黃素對照品、大黃酚對照品及大黃素甲醚對照品，精密稱定，加無水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液，制成含橙黃決明素263.3 μg／mL、蘆薈大黃素252.0 μg／mL、黃決明素247.8 μg／mL、大黃素247.6 μg／mL、大黃酚246.8 μg／mL、大黃素甲醚201.8 μg／mL 的混合對照品溶液，即得對照品溶液。按

表3 加樣回收試驗結果（n ＝9）

2.3.2 項下方法制備1 ～15 號供試品溶液。

2.5.3 方法學考察

精密度試驗：取2.5.2 項下供試品溶液（1 號），按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6 次，色譜圖見圖2?？梢?，1 號色譜峰（橙黃決明素）在決明子標準湯劑的制備過程中相對較穩(wěn)定、含量高、分離度好，故被選作參照峰。色譜圖中10 個共有峰的相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RPa）的RSD 小于3% ( n ＝6)，表明儀器精密度良好。詳見表5。

穩(wěn)定性試驗：取2.5.2 項下供試品溶液（1 號），于0，2，4，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，色譜圖中10 個共有峰RRT 和RPa 的RSD 見表5，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一標準湯劑（1 號），依法平行制備6 份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。色譜圖中10 個共有峰RRT 和RPa 的RSD 見表5，表明方法重復性良好。

2.5.4 指紋圖譜測定及特征峰指認

按擬訂色譜條件對15 批決明子標準湯劑樣品的特征圖譜進行測定，以對照品的保留時間和紫外光譜進行特征峰確認，其中決明子的典型色譜圖見圖2。

2.5.5 相似度評價

將15 批決明子標準湯劑圖譜數據導入國家藥典委員會的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）》。參照圖譜設為S0，對照圖譜生成方法設為平均數，時間窗寬度設為0.10，多點校正，自動匹配，生成對照，計算相似度。結果見表6。15 批決明子標準煎液的指紋圖譜見圖3。結果15 批決明子標準湯劑與對照指紋圖譜相似度均大于0.9，表明一致性好。

表5 決明子標準湯劑精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗測定結果（%，n ＝6）

圖2 決明子標準湯劑特征指紋圖譜

3 討論

3.1 質量評價

本研究中主要從飲片質量控制、標準湯劑制備過程、標準湯劑的質量控制3 個方面進行質量評價，其中標準湯劑制備過程嚴格遵守其標準化操作[12]，所得15 批湯劑平均出膏率為（12.32 ±1.35）%，橙黃決明素平均轉移率為（84.92 ±2.57）%，大黃酚平均轉移率為（23.82 ±0.97）%。通過建立標準湯劑的橙黃決明素和大黃酚含量測定方法，同時建立標準湯劑特征指紋圖譜測定方法，從指紋準確定性和指標成分定量方面達到了對決明子標準湯劑整體質量的評價。

表6 15 批決明子標準湯劑指紋圖譜相似度評價結果

圖3 15 批決明子標準湯劑的特征指紋圖譜

3.2 參數范圍確定

以本研究中所建立的15 批決明子標準湯劑各參數均值的75% ～125%計，出膏率為9.24% ～15.4%，橙黃決明素轉移率為63.69% ～106.15%，大黃酚轉移率為17.86% ～29.78。各項實測值均在標準湯劑參數范圍內，表明決明子標準煎液質量均一性好。

3.3 指標成分篩選與評價

出膏率和煎煮時間緊密相關，煎煮90 min 后出膏率含量最高，并趨于穩(wěn)定。本試驗按標準化操作[12]，因此出膏率偏低。按2015 年版《中國藥典（一部）》決明子飲片測定橙黃決明素及大黃酚含量的方法，標準湯劑中橙黃決明素提取率高、轉移率穩(wěn)定，能表征提取物的均一性；大黃酚含量較低，可能是由其熱不穩(wěn)定性和（或）煎煮過程中轉化為其他黃酮類成分造成，具體原因有待進一步研究，故選用橙黃決明素為質量評價的指標成分。

3.4 指紋圖譜分析

開展特征指紋圖譜研究時，考慮到應最大限度地檢出化學成分，試驗選用乙腈－0.1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，0 ～35 min 時18%→19%乙腈，35 ～55 min 時19%→36%乙腈，55 ～80 min 時36%→85%乙腈，80 ～85 min 時85% 乙腈，85 ～86 min 時85% →18%乙腈[15－16]，各化學成分出峰滯后（55 min 后）。經反復試驗，最終選擇本試驗中的洗脫條件，出峰數量多、保留時間合適。決明子標準湯劑檢出10 個特征指紋共有峰，其中4，5，7，8 號共有峰的相對峰面積較大，目前未能指認出，還有待后期進一步研究。