史碩博，孟瓊宇，喬瑋博，趙惠民

（1 北京化工大學北京軟物質(zhì)科學與工程高精尖創(chuàng)新中心，北京100029； 2 北京化工大學秦皇島環(huán)渤海生物產(chǎn)業(yè)研究院，河北 秦皇島066000； 3 美國伊利諾伊大學香檳分?；瘜W與生物分子工程系，伊利諾伊州厄巴納-香檳市IL61801）

人類現(xiàn)代文明的快速發(fā)展主要依靠化石資源（煤、石油、天然氣）的開發(fā)與利用［1］。但是化石資源屬于不可再生資源，消耗速度遠遠超過再生速度，其供給不足會造成能源危機［2］。此外，化石資源的大量使用導致二氧化碳過量排放，使其在大氣中的濃度急劇上升（圖1），在2019 年5 月突破415μL/L［3］。大氣中過高的二氧化碳濃度已經(jīng)引起溫室效應以及水資源壓力等環(huán)境問題，全球溫度持續(xù)上升（圖1），剛剛過去的2020年1月份是自1880年有氣象記錄以來的最熱1月份。如果不采取措施，一旦升溫突破1.5°C 的臨界點，將對環(huán)境帶來不可逆轉(zhuǎn)的影響［4］。根據(jù)2019 年聯(lián)合國環(huán)境署的報告［5］，全球碳排放量在未來10 年須每年下降7.6%才能實現(xiàn)1.5℃溫控目標。發(fā)展和建立以低能耗、低污染、低排放為基礎的低碳經(jīng)濟模式已成為全球共識，各國都把減少碳排放、發(fā)展可再生能源、保護人類共同的地球作為首要任務［4］。

通過構建高效的細胞工廠，生物煉制可將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成為人類所需的各種化學品及燃料，實現(xiàn)了很多以前只能通過化石資源煉制生產(chǎn)化學品及燃料的生物制造，是減少碳排放、緩解溫室效應的有效途徑［6］。生物煉制利用廣泛的、可再生的生物質(zhì)資源作為碳源，根據(jù)所使用的原料以及過程的不同，可將生物煉制分為三代［7-8］。第一代生物煉制的原料主要是油料、淀粉和糖料作物，也是當前生物制造領域的主要原料，但是這些原料供給方式對人類食物供應造成了沖擊。隨著代謝工程以及合成生物學的出現(xiàn)，第二代生物煉制使用纖維素、半纖維素等“非食用”生物質(zhì)作為生物制造的原料。這些原料來源于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、林業(yè)的副產(chǎn)物或廢棄物，不存在與糧食供應的競爭問題。第三代生物煉制進一步拓展原料范圍，可使用微生物細胞工廠來利用大氣中的二氧化碳來進行生物生產(chǎn)。通過固定二氧化碳不僅可以降低碳排放，同時還可實現(xiàn)綠色燃料、材料和化學品的可持續(xù)生產(chǎn)。另外，第三代生物煉制的能量來源主要有光能、化學能和電能等，能量轉(zhuǎn)換方式為“光能-產(chǎn)物”、“化學能-產(chǎn)物”或“光能-電能-產(chǎn)物”，能量轉(zhuǎn)化率分別為1%～3%、7%、9%～10%［8-9］。相比較第一、二代生物煉制“光能-生物質(zhì)-產(chǎn)物”0.2%的轉(zhuǎn)換效率而言，第三代生物煉制在能量利用率方面更具有優(yōu)勢。

二氧化碳是地球上最豐富的碳源，每年人為產(chǎn)生的二氧化碳排放量約為330 億噸［10］。與第一代和第二代生物煉制相比，第三代固碳生物煉制不僅對糧食和水的供應安全威脅要小得多，還可直接實現(xiàn)溫室氣體二氧化碳的消耗［11］。目前已有幾家公司實現(xiàn)了基于二氧化碳的商業(yè)化生物制造。例如，Algenol 和LanzaTech 分別利用微藻和梭菌將二氧化碳轉(zhuǎn)化為生物燃料［12-13］。與此同時，包括中國、美國、歐盟在內(nèi)的諸多政府機構也發(fā)布了相關政策，支持和鼓勵基于二氧化碳的第三代固碳生物煉制［14］。然而第三代固碳生物煉制的發(fā)展仍然遠遠落后于傳統(tǒng)的生物工藝，對該過程中涉及的各個步驟需要進行深入理解和優(yōu)化，包括確定和改進特定的途徑、能量供應方式、宿主和操作模式，進而構建高效的固碳細胞工廠用于生物煉制操作模式［7，15-23］。合成生物學作為一種核心平臺技術，增強了對生物系統(tǒng)的操控和設計能力，取得了令人矚目的研究成果［24-26］，支撐和帶動了生物產(chǎn)業(yè)和生物經(jīng)濟的發(fā)展。利用合成生物學改造和拓展微生物代謝網(wǎng)絡，甚至合成全新的人工生物系統(tǒng)，正在成為第三代固碳生物煉制的核心技術。雖然不同的生物已經(jīng)進化出來多樣的二氧化碳固定途徑，但目前二氧化碳的固定效率還無法滿足工業(yè)生物制造的要求，相關途徑和網(wǎng)絡還需要進一步優(yōu)化，同時固碳反應的能量供應方式以及能量的轉(zhuǎn)換效率仍需進一步提高。本文作者將介紹這些固碳途徑以及利用合成生物學如何構建和優(yōu)化固碳細胞工廠，人工設計固碳能量供應方式，提高微生物固定二氧化碳轉(zhuǎn)化合成相應生物制品的能力，進而建立基于二氧化碳的第三代固碳生物煉制產(chǎn)業(yè)。首先將介紹自然界中固定二氧化碳的天然途徑以及預測的人工合成途徑；基于這些途徑的認識利用合成生物學對相關生命系統(tǒng)進行改造或設計，實現(xiàn)基于二氧化碳的生物制造；最后結(jié)合現(xiàn)階段的機遇和挑戰(zhàn)，對第三代固碳生物煉制的發(fā)展趨勢和潛力進行展望和評述。

圖1 大氣中二氧化碳濃度和溫度變化（1880—2020年）（柱狀圖表示當年的全球平均溫度，曲線表示當年大氣中的二氧化碳濃度。數(shù)據(jù)來源于美國國家海洋和大氣管理局[3]）Fig.1 The global average concentration of carbon dioxide and temperature in the atmosphere(1880—2020)(The histogram shows the global average temperature of the year,and the curve shows the concentration of carbon dioxide in the atmosphere.The data came from the National Oceanic and Atmospheric Administration of USA [3])

1 二氧化碳利用途徑及固碳供能方式

1.1 二氧化碳天然利用途徑

當前已知的固定二氧化碳天然途徑如圖2 所示［16，27］。根據(jù)其特點可分為以下四類：

第一類途徑為通過戊糖磷酸途徑固定二氧化碳 的Calvin-Benson-Bassham 循 環(huán)（CBB 循 環(huán)，CBB cycle，又稱卡爾文循環(huán)或還原性戊糖磷酸循環(huán)）［28］。CBB循環(huán)是廣泛存在于自養(yǎng)生物的固碳途徑，既存在于光能自養(yǎng)生物中，也存在于化能自養(yǎng)生物中，其關鍵酶（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，RuBisCO）催化CBB 循環(huán)中的第一步反應。但是由于RuBisCO 酶是一種惰性酶，存在活性效率極低、專一性差且難以改造等缺點［29］。目前已有很多工作致力于優(yōu)化RuBisCO 酶［21］，包括篩選新酶［30］、蛋白質(zhì)工程［31］和計算機模擬建模［32］等策略。

第二類途徑為利用甲酸酯的還原性乙酰輔酶A通路（Wood-Ljungdahl pathway）。第二類途徑具有更高的能源效率和生物量產(chǎn)率［33］，缺點是反應需要金屬配合物、輔因子和伴侶蛋白的參與。還原性乙酰輔酶A合成通路主要被化能自養(yǎng)微生物在厭氧條件下用以固定二氧化碳，如產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)乙酸菌［27，34］，其中產(chǎn)甲烷菌利用金屬還原劑提供還原力，而產(chǎn)乙酸菌采取NADPH提供還原力。該通路的關鍵酶包括一氧化碳脫氫酶（CO dehydrogenase）、甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase）和亞甲基呋喃脫氫酶（formylmethanofuran dehydrogenase）［35］。

第三類途徑利用乙酰CoA 和琥珀酰CoA 之間的循環(huán)進行固碳，包括還原性三羧酸循環(huán)（reductive TCA cycle） 和二羧酸/4- 羥基丁酸（dicarboxylate/4-hydroxybutyrate）循環(huán)（DC/HB 循環(huán)，DC/HB cycle），主要存在于化能自養(yǎng)生物中。還原性三羧酸循環(huán)通過逆轉(zhuǎn)三羧酸循環(huán)實現(xiàn)二氧化碳的固定，關鍵酶包括檸檬酸合成酶和對氧敏感的2-酮戊二酸合成酶［18-19］。長期以來，檸檬酸合成酶被認為催化不可逆反應，因此該步反應由檸檬酸-CoA 合成酶（citryl-CoA synthetase）和檸檬酰-CoA裂解酶（citryl-CoA lyase）催化的兩步反應來代替［36］。直至2018 年才發(fā)現(xiàn)了具有可逆活性的檸檬酸合成酶［37-38］。DC/HB 循環(huán)通過丙酮酸合成酶（pyruvate synthase）固定二氧化碳，還可利用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase）固定等物質(zhì)的量的碳酸氫根。DC/HB循環(huán)需要各種鐵硫蛋白和硫酯參與才能發(fā)揮活性，其關鍵酶是4-羥基丁酰輔酶A 脫水酶（4-hydroxybutyryl-CoA dehydratase），具有一個氧不穩(wěn)定的鐵硫中心［19］。目前在厭氧菌和兼性需氧菌中都發(fā)現(xiàn)了DC/HB循環(huán)［39-41］。

第四類途徑也是利用乙酰CoA 和琥珀酰CoA之間的循環(huán)進行固碳，但是只能通過吸收碳酸氫根來實現(xiàn)對二氧化碳的間接固定，包括3-羥基丙酸（3-hydroxypropionate， 3-HPA）循環(huán)（3-HPA bicycle） 和 3- 羥基丙酸/4- 羥基丁酸（3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate， HP/HB）循環(huán)（HP/HB cycle）。由于溶解度差異，細胞內(nèi)碳酸氫根的濃度遠高于細胞內(nèi)二氧化碳，所以利用碳酸氫根對二氧化碳的間接固定成為第四類途徑的顯著優(yōu)勢，但是該途徑固碳消耗能量較大［42］。3-羥基丙酸循環(huán)主要存在于綠色非硫細菌（green nonsulphur bacteria）以及其他光能自養(yǎng)生物［35］，關鍵酶包括丙二酰CoA 還原酶（malonyl-CoA reductase）［43］和丙酰CoA 合成酶（propionyl-CoA synthase）［44］。3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)的關鍵酶是4-羥基丁酰輔酶A 脫水酶（4-hydroxybutyryl-CoA dehydratase）［19］，主要存在于有氧泉古菌等化能自養(yǎng)生物［35］。

二氧化碳主要通過兩種機制進入生物圈：一種是通過羧化反應（carboxylation）將二氧化碳附著在生物體內(nèi)已有的底物上；另一種是在進一步同化前通過還原反應（reduction）先將二氧化碳轉(zhuǎn)化成甲酸鹽或一氧化碳。其中，卡爾文循環(huán)、還原性三羧酸循環(huán)、3-羥基丙酸循環(huán)、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)或二羧酸/4-羥基丁酸酯循環(huán)中的關鍵固碳酶均為羧化酶，屬于羧化反應；還原性乙酰輔酶A 通路為還原反應。通過對許多自養(yǎng)微生物進行基因組分析，發(fā)現(xiàn)在諸如Ferroplasma acidiphilum和Pyrobaculum arsenaticum等自養(yǎng)微生物中未找到上述已知的天然固碳途徑相關基因［17］，表明自然界中還存在其他未知的天然二氧化碳固定途徑，值得研究人員對相應菌株進行詳細的生物信息學分析和生化網(wǎng)絡重建。例如，最近在一株亞磷酸鹽氧化細菌中發(fā)現(xiàn)還原性甘氨酸通路（reductive glycine pathway）（圖2），推測是一個潛在的天然固碳途徑［41］，途徑功能已得到部分驗證［45-47］，目前尚未確定其是否以二氧化碳作為唯一碳源。

1.2 二氧化碳人工設計途徑

在人工二氧化碳固定途徑的從頭設計方面，Bar-Even 等［48］使用基于約束的建模方法（constraintbased modeling，CBM）綜合分析了5000種已知代謝酶中可能存在的固碳循環(huán)途徑組合，提出了丙二酰CoA-草酰乙酸-乙醛酸（malonyl-CoA-oxaloacetateglyoxylate，MOG）固碳循環(huán)［圖3（a）和（b）］。與CBB循環(huán)相比，MOG循環(huán)理論上具有更好的熱力學可行性、更高的能量利用效率。

在對天然固碳途徑挖掘和解析的基礎上，近年來研究人員完成了一些人工二氧化碳固定途徑的改造。例如，Bar-Even等對3-羥基丙酸循環(huán)進行了相應改造［圖3（c）］，利用較短的通路替代了之前乙酰CoA 和蘋果酸之間的通路［16］。類似地，Bouzon 等提出了另一種稱為4-羥基-2-氧代丁酸（4-hydroxy-2-oxobutanoic acid， HOB）循環(huán)的固碳途徑［圖3（d）］，該途徑以丙酮酸和HOB 作為中間體，將二氧化碳還原為甲醛［49］。

圖2 天然二氧化碳固定途徑［黑色表示CBB循環(huán)（CBB cycle），是自然界中普遍的固碳途徑；紅色表示還原性甘氨酸通路（reductive glycine pathway），可以利用CO2和甲酸鹽合成甘氨酸，是一個最新發(fā)現(xiàn)的潛在天然固碳途徑；棕色表示還原性乙酰輔酶A通路（Wood-Ljungdahl pathway），可被產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)乙酸菌使用；其他幾條途徑雖然是分別在不同物種中獨立進化得到的，但均使用乙酰CoA/琥珀酰CoA之間的循環(huán)進行固碳，且共享一些反應和中間代謝物，包括：淺藍色表示的還原性三羧酸循環(huán)（reductive TCA cycle）、綠色表示的二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)（DC/HB cycle）、橙色表示的3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)（HP/HB cycle）和紫色表示的3-羥基丙酸循環(huán)（3-HPA bicycle）］Fig.2 Natural carbon dioxide fixation pathways identified[The black color indicates the CBB cycle,which is a universal carbon fixation pathway in nature.The red indicates the reductive Glycine pathway that can utilize CO2 and formate to synthesize glycine,which is a newly discovered potential natural carbon fixation pathway.The brown color indicates the reduced acetyl-CoA pathway(Wood-Ljungdahl pathway),which can be used by methanogens and acetogens.Moreover,the reductive TCA cycle(in light blue),the DC/HB cycle(in green),the HP/HB cycle(in orange)and the 3-HPA bicycle(in purple)all use the cycle between acetyl CoA/succinyl CoA to fix carbon and share some reactions and intermediate metabolites,although evolved independently in different ecological niches]

與此同時，由于體外多酶體系可以在體外完成特定途徑的反應，具有可操作性強、反應速度快、反應路徑明確、背景清晰等優(yōu)點，被用來驗證和鑒定人工設計的二氧化碳固定途徑。例如，Schwander等［50］利用體外多酶體系設計和驗證了一個新的二氧化碳固定途徑［圖3（e）］，稱為巴豆酰CoA/乙基丙二酰CoA/羥基丁酰CoA （crotonylCoA/ethylmalonyl-CoA/hydroxybutyryl-CoA，CETCH）循環(huán)，固碳效率經(jīng)過優(yōu)化可達5 nmol/（min·mg蛋白），較CBB循環(huán)高出十多倍。CETCH 循環(huán)由17個酶組成，這17個酶分別來源于古菌域、真細菌域和真核域，這一通路在自然界中并不存在，完全是人工設計的，充分體現(xiàn)了合成生物學的設計理念和應用潛力。

圖3 人工設計二氧化碳固定途徑Fig.3 Artificially designed carbon dioxide fixation pathways

1.3 固碳供能方式

將二氧化碳固定為化學品或燃料等生物產(chǎn)品本身是一個大量耗能的過程。光能自養(yǎng)生物可以吸收光能并裂解水來產(chǎn)生ATP 和NADPH 作為能量和還原力，通過卡爾文循環(huán)、還原性三羧酸循環(huán)或3-羥基丙酸循環(huán)等固碳途徑將二氧化碳轉(zhuǎn)化為有機物。不同類型的光合作用吸收光的波長不同，如產(chǎn)氧光合作用吸收的是短波長光譜，無氧光合作用吸收的是長波長光譜［51］。通過對光能自養(yǎng)微生物的改造，提高光捕獲效率或減少能量傳遞過程中的消耗，可以提高光合作用效率進而提高產(chǎn)物得率。例如，Kirst等［52］通過減小藻膽體光系統(tǒng)捕光天線尺寸將工程藍藻菌的產(chǎn)量提高了57% 。Zhou 等將一個額外的NADPH 消耗模塊引入到藍藻中，以平衡光合作用產(chǎn)生的ATP 和NADPH，明顯提高了光合效率，使得工程藍藻的生物量提高了39%，最終使異丙醇的產(chǎn)量達到226.9mg/L［53］。此外，Martinez 等在大腸桿菌中構建了變形菌視紫質(zhì)光系統(tǒng)［54］，以及Guo 等構建了可以收集光能產(chǎn)生的電子來進行細胞生長和生產(chǎn)的半導體納米顆粒-釀酒酵母復合體平臺，使得在異養(yǎng)生物中進行光能自養(yǎng)合成成為了可能［55］。

化能自養(yǎng)生物可以氧化環(huán)境中的電子供體獲得能量，包括氨、氫、還原性碳（CO 和甲酸鹽）、硫（S 和H2S）、磷和鐵等?；茏责B(yǎng)的固碳途徑有卡爾文循環(huán)、還原性三羧酸循環(huán)、還原性乙酰輔酶A 通路、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)或二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)等。在一些化能自養(yǎng)微生物中，在氫化酶（SH）的作用下吸收氫產(chǎn)生ATP 和（或）NADH，如真氧產(chǎn)堿桿菌（Ralstonia eutropha）就是一種典型的由氫產(chǎn)生ATP 和NADH 的微生物。Lamont 等［56］將來源于R. eutropha的氫化酶引入大腸桿菌中并檢測到了胞內(nèi)NADH 的升高，為在大腸桿菌中利用氫自養(yǎng)固定二氧化碳提供了可能。此外，微生物也可以利用電能作為固定碳的能源。電能自養(yǎng)生物的固碳途徑有卡爾文循環(huán)或還原性乙酰輔酶A 通路。微生物可以直接消耗電子將二氧化碳轉(zhuǎn)化為有機化合物，或者利用電能生產(chǎn)能量載體，如甲酸鹽、氫、一氧化碳和甲醇等，以支持細胞生長。2012 年，Li 等報道了以甲酸鹽作為生物電化學中間體，在R.eutrophaH16中利用電能作為唯一的能源來源以及二氧化碳為唯一碳源生產(chǎn)高級醇［57］。

2 應用合成生物學改造和設計微生物

2.1 改造可天然利用二氧化碳的微生物

自養(yǎng)微生物可以利用二氧化碳作為主要或唯一的碳源，通過光合作用或化能合成作用獲得能量，包括微藻、藍細菌、古細菌、泉古菌門微生物、變型菌綱微生物等。目前采用一些經(jīng)過合成生物學改造的光能或化能自養(yǎng)微生物，已經(jīng)可以實現(xiàn)從二氧化碳合成生產(chǎn)一些燃料和化學品［20］。表1總結(jié)了最近合成生物學在改造和設計固碳途徑方面的一些重要應用。

2.1.1 微藻

相對于植物，微藻具有更高的光合固碳效率，據(jù)報道，1t微藻能夠固定高達1.83t的二氧化碳［70］。此外，微藻還具有生長速度快、環(huán)境適應性強、油脂含量多等特點，早在20 世紀70 年代就提出利用微藻生產(chǎn)油脂類產(chǎn)品，并得到不斷發(fā)展。例如，微擬球藻（Nannochloropsissp.）等富油微藻被作為油脂原料通過轉(zhuǎn)酯反應生產(chǎn)生物柴油［71］；紫球藻 （Porphyridium cruentum） 和四鞭片藻（Tetraselmis suecica）等微藻作為碳水化合物原料合成乙醇［72-73］； 萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和普通小球藻（Chlorella vulgaris）等放氫微藻將二氧化碳和光能轉(zhuǎn)換成化學生物氫［74-75］；小球藻（Chlorella sorokiniana）等產(chǎn)葉黃素［76］，杜氏鹽藻（Dunaliella salina）產(chǎn)胡蘿卜素［77］等有機色素［78］。近年來合成生物學拓展了微藻合成產(chǎn)品范圍。例如，Radakovits 等對三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）油脂中的脂肪酸組分進行理性設計，提升其轉(zhuǎn)酯后生成的生物柴油的品質(zhì)［79］。Xin等通過人為設計不同二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶編碼基因（DGAT2）的表達水平，提高了微擬球藻的不飽和脂肪酸的含量，使其更適合作為保健品或食品［80］。Pourmir 等將粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）的木糖還原酶導入萊茵衣藻，實現(xiàn)了木糖醇的生產(chǎn)［81］。Lauersen 等組合表達了來源于植物、細菌和酵母的催化酶合成倍半萜化合物［82］。此外，利用合成生物學技術，微藻還用于蛋白類產(chǎn)品生產(chǎn)，如抗體83K7C［83］、瘧疾疫苗［84］等重組蛋白。

近年來，合成生物學對微藻自身代謝進行工程化設計優(yōu)化能源和碳的利用，對固碳效率的研究主要集中在CBB 循環(huán)的RuBisCO 酶。例如，Wei 等發(fā)現(xiàn)一個可調(diào)控RuBisCO 酶的調(diào)控因子nRCA，其在微擬球藻中表達可改善其光合效率，顯著提高了微擬球藻46%的生物量和32%的生長速率［58］。光系統(tǒng)是由葉綠素、類胡蘿卜素、脂和蛋白質(zhì)組成的復合物，目前光系統(tǒng)對光能利用能力的改善主要集中在對捕光天線蛋白的改造。例如，De Mooij 等［59］和Shin 等［60］分別通過減小萊茵衣藻和普通小球藻捕光天線蛋白提高了10%和65%的光能利用率；Wang 等解析了捕光天線蛋白的結(jié)構［85］，為人工模擬、改造光系統(tǒng)提供了新的理論依據(jù)。

表1 合成生物學在改造和設計固碳途徑方面的應用Tab.1 Synthetic biology strategies in designing and engineering CO2-fixation pathways

2.1.2 藍細菌

藍細菌是另一種極具潛力的光能自養(yǎng)底盤微生物，具有快速生長、營養(yǎng)需求低、易于改造等特點［86-87］。基于羧酶體的二氧化碳濃縮機制，藍細菌利用羧酶體可增加RuBisCO 酶周圍的二氧化碳濃度（胞內(nèi)的濃度與胞外比值高達1000倍），進而提高CBB 循環(huán)的固碳效率［86］。藍細菌可以合成許多內(nèi)源或外源代謝產(chǎn)物，包括氨基酸、脂肪酸和酰胺類化合物。例如，Yunus 等在Synechocystissp.PCC 6803 中過表達了脂肪酸光脫羧酶實現(xiàn)了烷烴和烯烴的高效合成［23］。Xiong 等在Synechocystissp.PCC 6803 中引入了來源于Pseudomonas的乙烯合成酶（ethyleneforming enzyme， EFE），固定了10%的二氧化碳用于合成乙烯［88］。Lee等通過引入乙醇合成途徑以及蠟酯合成酶，在Synechococcus elongatusPCC 7942首次實現(xiàn)了異源合成脂肪酸乙酯（fatty acid ethyl esters）［89］。Oliver 等在S. elongatusPCC 7942中建立了從丙酮酸開始的2，3-丁二醇合成新途徑，產(chǎn)量達到了2.38g/L［90］。Lai 等將Clostridium的CoA 途徑引入S. elongatusPCC 7942實現(xiàn)了丁酸的高效合成［91］。上海交通大學許平團隊建立了“藍細菌內(nèi)核”概念，利用S. elongatus以二氧化碳為碳源合成了六種不同的天然產(chǎn)物［92］和一系列C3平臺化學品［93］；該團隊最近還在S.elongatus中引入苯乙醇合成途徑和人工解反饋抑制模塊，實現(xiàn)了苯乙醇的高效合成［94］。

除了直接針對目標產(chǎn)物途徑，許多改造藍細菌以提升其內(nèi)源代謝物產(chǎn)量的方法主要集中于改善對光能的有效利用、增強二氧化碳固定效率以及優(yōu)化其抗逆性。在光能利用方面，Nürnberg 等研究了遠紅外線存在下生長的藍細菌光系統(tǒng)復合物，確定了相應的葉綠素f，為未來藍細菌拓展光能利用范圍奠定了基礎［95］。為提升固碳效率，Liang 等確定了Synechocystissp. PCC 6803 中CBB循環(huán)關鍵酶是RuBisCO 酶、景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶（sedoheptulose 1，7-biphosphatase， SBPase）、果糖二磷酸醛縮酶（fructose-bisphosphate aldolase， FBA）和酮糖移轉(zhuǎn)酶（transketolase，TK）四種酶，增強這些酶的表達可以提升52%的生物量積累［61］；隨后，Liang 等引入乙醇合成途徑，在FBA 過表達的菌株中，乙醇產(chǎn)量提升了69%［96］。此外，Dur?o 等通過蛋白質(zhì)工程改造了RuBisCO 酶，提高了Synechocystissp.PCC 6803 的光合效率［31］；De Porcellinis 等發(fā)現(xiàn)SBPase 可影響固碳效率，并探尋了相關機理［97］。與此同時，針對規(guī)?；囵B(yǎng)或者產(chǎn)物累積造成的不利因素，研究人員主要通過強化內(nèi)源抗逆機制或者引入相關外源抗逆元件實現(xiàn)其抗逆性的優(yōu)化。Su 等在S.elongatusPCC 7942 中過表達了壓力相關基因hspA和osmotin，該操作顯著提高了其對高溫、高光、高鹽等多種環(huán)境壓力的耐受能力，使其可以在戶外海水中直接培養(yǎng)［98］。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和細胞的耐鹽性直接相關［99］，Waditee-Sirisattha 等將Aphanothece halophytica的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶引入到S. elongatusPCC 7942 中，在0.3mol/L NaCl存在下，工程菌株的生物量比野生菌株提高了大約1 倍［100］。未來通過揭示更多的代謝機制和挖掘相應的生物元件，進一步結(jié)合合成生物學，可實現(xiàn)相應元件的特定時空表達，提升抗逆性、優(yōu)化固碳效率。

2.1.3 梭菌

梭菌是一種常用的化能自養(yǎng)微生物，通過還原性乙酰輔酶A通路固碳，已成為第三代固碳生物煉制的良好宿主之一。利用梭菌合成的常見產(chǎn)物有丁醇、丁酸、2-氧代丁酸酯和2，3-丁二醇等［20］。例如，Cheng 等在食氣梭菌（Clostridium carboxidivorans）過表達了adhE2和fnr兩個基因，使丁醇產(chǎn)量提高了約22%［101］；Huang等將一個異源丁酸合成基因簇引入到楊氏梭菌（C. ljungdahlii）基因組中整合表達，可穩(wěn)定高產(chǎn)1.01g/L丁酸［102］。

化能自養(yǎng)生物一般通過環(huán)境中的電子供體（如氨、氫、硫、硫化氫、亞鐵）來提供能量［103］。最近，利用電能協(xié)助梭菌的發(fā)酵生產(chǎn)過程，包括生產(chǎn)乙醇［0.18g/(L·d)］［104］、異丙醇［0.157g/(L·d)］［105］、丁醇/異丁醇［0.013g/(L·d)］［106］、乙酸［18.72g/(L·d)］［107］、丁酸［0.21g/(L·d)］［108］和己酸［0.95g/(L·d)］［109］等產(chǎn)品。但是研究人員也發(fā)現(xiàn)，電解槽中的二氧化碳濃度非常低，為此Haas 等［110］報道了一種氣體擴散電極，可增強與二氧化碳的相互作用，使得梭菌以接近100%的法拉第效率合成丁醇和己醇。

不同產(chǎn)品的合成展現(xiàn)了梭菌作為平臺細胞工廠的巨大潛力，LanzaTech 和INEOS 等幾家公司利用梭菌開發(fā)的部分產(chǎn)品已實現(xiàn)商業(yè)化［15］。例如，LanzaTech 與首鋼集團京唐鋼鐵廠合作，利用梭菌將其鋼廠廢氣應用于商業(yè)化合成乙醇（年產(chǎn)4.6 萬噸）及蛋白飼料（年產(chǎn)5000t）［111］。

2.1.4 古細菌

古細菌通過多種途徑利用化能實現(xiàn)二氧化碳固定，除了3-羥基丙酸循環(huán)之外，本文中提到的其他固碳途徑在古細菌中都有發(fā)現(xiàn)［112］。古細菌通過自養(yǎng)利用二氧化碳和氫氣生成甲烷是一個古老的代謝反應。利用此特性，有報道嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌（Methanothermobacter thermoautotrophicus）利用二氧化碳和氫氣生產(chǎn)甲烷［113-114］。古細菌能夠在高溫高鹽等極端環(huán)境下存活，具有與普通細菌和真核生物不同的代謝多樣性。最近還有一些報道利用嗜熱古細菌（Pyrococcus furiosus）在高溫下合成乳酸［115］、乙醇［116］、丁醇［117］等目標化合物，但是利用的非自養(yǎng)途徑。為了使其完成二氧化碳固定，Keller 等將瑟杜生金屬球菌（Metallosphaera sedula）的HP/HB循環(huán)引入嗜熱古細菌，可在70℃高溫下將二氧化碳轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸［62］。越來越多的古細菌代謝途徑被解析，將為第三代固碳生物煉制細胞工廠提供寶貴的補充。

2.1.5 其他

羅爾斯通菌（Ralstonia eutropha）又名鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator），在化能自養(yǎng)模式下，以二氧化碳作為碳源、以氫氣作為能源生長，無需光照即可通過CBB 循環(huán)進行碳固定［118］。與大多數(shù)RuBisCO 酶不同，羅爾斯通菌的RuBisCO 酶具有較高的二氧化碳固定速率，而且專一性較好［119］。因此，對該酶的深入解析可以幫助我們更好地改造RuBisCO 酶的特性。由于羅爾斯通菌可天然在胞內(nèi)累積大量的聚羥基鏈烷酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA），因此PHA為代表的聚酯類聚合物成為其重要產(chǎn)物［86，120］。除此之外，羅爾斯通菌還被用來合成其他化合物，包括從二氧化碳和氫氣合成甲基酮［121］、異丙醇［122］、游離脂肪酸［123］、烷烴［124］和飼料蛋白［125］等產(chǎn)品，還可利用同位素標記的二氧化碳生產(chǎn)同位素標記的氨基酸［126］。與此同時，為了增強其對產(chǎn)物的抗逆性，Marc 等［127］通過表達GroESL 分子伴侶基因增強了對異丙醇的耐受性，進而提高了異丙醇的最終產(chǎn)量。

此外，還可以利用電能以協(xié)助羅爾斯通菌的發(fā)酵生產(chǎn)過程。例如Li 等［57］利用電化學系統(tǒng)從二氧化碳合成甲酸，然后再利用甲酸替代氫氣輔助二氧化碳在羅爾斯通工程菌中的固定，最后實現(xiàn)利用二氧化碳作為唯一碳源和電能作為唯一能量輸入生產(chǎn)異丁醇和3-甲基-1-丁醇。

2.2 在異養(yǎng)模式細胞中引入利用二氧化碳代謝途徑

大腸桿菌（Escherichia coli）、 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、畢赤酵母（Pichia pastoris）等菌株作為重要的工業(yè)模式微生物，目前在生物煉制領域得到了廣泛應用，用以商業(yè)化生產(chǎn)化學品、天然產(chǎn)物、蛋白質(zhì)等產(chǎn)品［6］。相對于可以天然固定二氧化碳的微生物，這些工業(yè)模式微生物具有許多優(yōu)勢。例如大腸桿菌生長速度比藍細菌快5倍，且具有高效的分子及合成生物學工具、成熟的不同產(chǎn)品合成路線和發(fā)酵工藝等［128］。隨著代謝工程與合成生物學的發(fā)展，研究人員希望把諸如大腸桿菌等模式工業(yè)微生物的碳源從有機碳轉(zhuǎn)化為二氧化碳，從而拓展這些微生物應用于第三代固碳生物煉制。因此，在異養(yǎng)模式工業(yè)微生物中科學家們設計表達了不同的固碳途徑（表1）。例如，Mattozzi 等［63］成功將3-羥基丙酸循環(huán)在大腸桿菌表達，并驗證其部分活性；Guo 等［64］在大腸桿菌表達了還原性三羧酸循環(huán)以增強馬來酸的產(chǎn)量；Yishai等在大腸桿菌表達了還原性乙酰輔酶A 通路實現(xiàn)了從甲酸和二氧化碳合成甘氨酸和絲氨酸［47］；Guadalupe-Medina 等和Li等分別在釀酒酵母中重建CBB 循環(huán)部分途徑，使二氧化碳作為碳源之一生產(chǎn)乙醇［65-66］；Antonovsky等［67］通過理性設計引入大腸桿菌所缺的CBB 循環(huán)兩個相關酶，并進行相應代謝網(wǎng)絡改造和適應性進化，利用二氧化碳合成了大約35%的生物質(zhì)。這些研究表明了將異養(yǎng)生物設計轉(zhuǎn)化為自養(yǎng)生物的可行性，對二氧化碳固定途徑的設計具有指導意義，但是以上設計改造的菌株尚不能將二氧化碳作為唯一碳源。2019年Gleizer等［68］將一個完整的異源CBB 循環(huán)引入大腸桿菌，結(jié)合有機碳限制下的適應性進化，并采用電化學得到的甲酸作為能量和電子供體，首次實現(xiàn)了大腸桿菌以二氧化碳為唯一碳源進行生長。與此同時，Gassler 等［69］通過合成生物學改造畢赤酵母將其過氧化物酶體甲醇同化途徑改造成類似CBB 循環(huán)的固碳途徑，利用甲醇作為能量和電子供體，也實現(xiàn)了將二氧化碳作為唯一碳源的“自養(yǎng)”生長。

3 第三代固碳生物煉制的挑戰(zhàn)及解決方案

第三代固碳生物煉制以二氧化碳作為化工原料擁有兩大優(yōu)勢：一是作為原料，成本低廉且來源豐富；二是對環(huán)境友好，可吸收消耗溫室氣體。相對于從化石資源獲得產(chǎn)品，雖然第三代固碳生物煉制的成本目前還比較高，但是由于其可以消耗二氧化碳，目前政府可為其提供一定的減排補貼，第三代生物煉制部分產(chǎn)品已實現(xiàn)商業(yè)化［15］。諸多可利用二氧化碳的高效細胞工廠的開發(fā)將為我們實現(xiàn)第三代固碳生物煉制、滿足低碳可持續(xù)發(fā)展提供堅實的基礎，還為開發(fā)火星等擁有二氧化碳的類地星球提供可能，從而帶來巨大的經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益。

第三代固碳生物煉制最大的特點是固定二氧化碳為碳源，目前已經(jīng)成功挖掘、解析出上文中所提的四類固碳途徑，并采取合成生物學、蛋白質(zhì)工程等手段改進固碳效率［18-19，21，35］。基于這些認識，合成生物學目前已成功將異養(yǎng)微生物轉(zhuǎn)化為新型自養(yǎng)微生物［68-69］。雖然目前固碳效率還不高，且在生物反應器中需要高濃度的二氧化碳，但是隨著對自然界中天然固碳途徑認識的深入［50］，合成生物學研究領域有望在未來設計出比天然途徑更加高效的人工固碳途徑。

二氧化碳中的碳為+4 價，為了將其轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)或相應產(chǎn)品，必需較高的能量和還原力。在光能自養(yǎng)微生物中，光合作用在能源產(chǎn)生和二氧化碳固定中發(fā)揮了重要作用。但是，它需要大面積的表面進行光照，并且受光能捕獲效率的限制［129］。對于化能自養(yǎng)微生物，其生物合成過程主要結(jié)合電化學系統(tǒng)提供能量［85-91，110］，然而該系統(tǒng)面臨著電極表面受限、氫氣的溶解度低等問題［22］。因此，為生物固碳途徑提供高效經(jīng)濟的能量來源將是未來一個重要研究方向。

總之，為了獲取可利用二氧化碳的高效第三代固碳生物煉制細胞工廠，還有許多工作去做，主要有：①優(yōu)化能量捕獲技術；②優(yōu)化、挖掘、設計有效的二氧化碳固定宿主、途徑和酶；③開發(fā)經(jīng)濟有效的碳轉(zhuǎn)運、碳濃縮機制；④在可利用二氧化碳的天然宿主中開發(fā)更多的代謝工程和合成生物學工具；⑤大規(guī)模淘汰不必要的途徑，擴大產(chǎn)物合成范圍，研究二氧化碳利用最小模塊。

致謝：感謝科技部及國家自然科學基金委組織的相關項目“國家重點研發(fā)計劃”及國家自然科學基金對史碩博教授的支持。