張 勇，宋亞芬，陳 玲，張 兵，張 敏，王靜文，楊承槐，蔣桃珍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

豬流感(Swine influenza, SI)是由豬流感病毒(Swine influenza virus, SIV)引起的豬的一種急性、呼吸系統(tǒng)傳染性疾病。該病一般發(fā)病率較高，死亡率低，呈世界分布，但主要以地方流行為主。豬流感一年四季均可發(fā)生，但以春秋兩季多發(fā)，可在不同日齡、品種和性別的豬群中暴發(fā)[1-3]。感染SIV的豬群，其生產(chǎn)性能及對其他疾病的抵抗能力均會降低，進而可對養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。A型流感病毒的基因組由8個分節(jié)段的RNA組成，當兩個不同來源的流感病毒同時感染同一宿主時，病毒在復制過程中就有可能在細胞內產(chǎn)生基因重配[4]。豬呼吸道上皮細胞表面同時具有人和禽流感病毒兩種類型的受體，人和禽流感病毒都可以感染豬，新型流感病毒往往是在豬體內通過基因重組而產(chǎn)生，因此，豬被認為是禽、人流感病毒的中間宿主和基因“混合器”[5-6]。目前，世界各地流行的SIV主要是H1N1、H1N2和H3N2亞型流感病毒[7-9]。此外，H1N7、H3N1、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2等亞型的流感病毒也可在豬群中偶爾分離得到，但目前沒有證據(jù)顯示這些病毒在豬體內建立穩(wěn)定的譜系[10-12]。本研究對廣州規(guī)?；B(yǎng)豬場疑似流感的病料中分離鑒定的2株SIV全基因組的分子特征進行了系統(tǒng)分析，可為我國豬流感的預防和控制提供一定的支撐性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料、雞胚 2株H3N2亞型豬流感病毒 A/swine/Guangdong/1519/2012(H3N2)(簡稱GD1519)和A/swine/Guangdong/1520/2012(H3N2)(簡稱GD1520)于2012年分離自廣東某豬場具有流感樣癥狀的豬的肺臟，現(xiàn)由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保存。9～10日齡SPF雞胚購自北京勃琳格殷格翰維通生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 pMD19-T克隆載體、E.coliDH5α Competent Cells、ExTaq酶、RNA酶抑制劑，均購自寶生物工程(大連)有限公司；TRIZOL LS Reagent試劑購自Invitrogen公司；MLV反轉錄酶購自Promega公司；DNA純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒，購自天根生化科技有限公司；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 引物合成 用DNA Star 7.1及Oligo 7.0軟件設計擴增病毒8個基因片段的相關引物后，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成(表1)。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取和cDNA的獲得 取250 μL含有病毒的雞胚尿囊液，加入750 μL TRIZOL LS Reagent，按照TRIZOL LS Reagent試劑盒說明書提取病毒總RNA。將獲得的病毒總RNA按MLV反轉錄試劑盒說明書，利用流感病毒反轉錄通用引物Uni-12(5’-AGCAAAAGCAGG-3’)進行反轉錄獲得病毒cDNA。

表1 研究中所用引物Tab 1 Primers were used in this study

1.2.2 病毒基因片段的克隆和鑒定 用設計合成的SIV 8基因片段擴增引物對兩株病毒的cDNA進行PCR擴增、產(chǎn)物純化、連接pMD19-T載體并轉化后經(jīng)菌液PCR鑒定陽性的菌液，用質粒小提試劑盒進行重組質粒的抽提，所得質粒送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行測序鑒定。

1.2.3 遺傳進化分析 為進一步明確分離病毒的遺傳演化特征，利用 DNAStar 7.1中的 SeqMan 程序對8基因片段序列拼接，應用 NCBI中Blast 檢索同源性序列并下載相關序列，利用MEGA 4.0軟件中的Neighbor-joining法(參數(shù)設置為1000 replications)結合下載序列與本研究序列繪制病毒8個基因片段的遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 2株病毒全基因組序列同源性分析 將通過測序拼接所得的2株H3N2亞型豬流感病毒的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS 8個基因片段輸入GenBank進行Blast比對。結果顯示，GD1519毒株的HA基因與A/swine/Henan/1/2010(H3N2)同源性最高，同源率為99.8%；其NA、PB2和NP基因與北美毒株A/swine/Colorado/1/1977(H3N2)同源性最高，同源率分別為99.6%、99.8%和99.7%； 其PB1、PA、M和NS基因與A/swine/Hunan/01/2008(H3N2)同源性最高，同源率分別為100%、100%、99.9%和99.7%。GD1520毒株的HA基因與A/swine/Henan/1/2010(H3N2)同源性最高，同源率為99.8%；其PB2和NS基因均與A/swine/Guangdong/L5/2010(H3N2)同源性最高，同源率分別為99.8%和99.9%； 其NA、PB1和M基因分別與A/swine/Guangdong/Z5/2003(H3N2)、A/swine/Guangdong/165/06(H3N2)和A/swine/Guangdong/164/06(H3N2)同源性最高，同源率分別為99.9%、100%和99.9%；其PA和NP基因均與A/swine/Guangdong/04/2005(H3N2)同源性最高，同源率分別為100%和99.9%(表2)。

2.2 病毒的遺傳進化分析 于NCBI網(wǎng)站下載相關序列，結合中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心分離毒株GD1519和GD1520利用MEGA4.0軟件繪制8個基因片段的遺傳進化樹。結果顯示：H3N2亞型流感病毒各個基因片段均可劃分為Recent human、European swine、Victoria 75-like/Early human、Earliest human、Avian五個分支，其中，Recent human 分支可詳細劃分為Moscow/99-like、Sydney/97-like、New York/99-like三個亞分支。研究結果發(fā)現(xiàn)，GD1519病毒的HA、PB2、PA和NP基因片段均來源于近期人源H3N2亞型流感病毒分支的Moscow/99-like亞分支；其NA和PB1基因片段來源于早期人源H3N2亞型流感病毒分支的Victoria/75-like亞分支；其M和NS基因片段來源于近期人源H3N2亞型流感病毒分支的New York/99-like亞分支。GD1520病毒的HA基因片段來源于近期人源H3N2亞型流感病毒分支的Moscow/99-like亞分支；其NA和PB1基因來源于近期人源H3N2亞型流感病毒分支的New York/99-like亞分支；其PB2、PA、NP、M和NS基因片段均來源于早期人源H3N2亞型流感病毒分支的Victoria/75-like亞分支(圖1)。針對兩株病毒各基因的來源，繪制GD1519毒株和GD1520毒株基因重配類型分析模式圖，直觀表現(xiàn)各個基因片段來源及其重配類型(圖2)。

表2 GD1519和GD1520毒株各基因片段與GenBank中相似性最高的毒株Tab 2 The SIV strains in GenBank with highest nucleotide homology to the GD1519 and GD1520 viruses when analyzing each gene segment

2.3 病毒的分子特征 分析2株H3N2亞型豬流感病毒的HA基因序列發(fā)現(xiàn)，2株病毒的HA基因編碼區(qū)均由1701個核苷酸組成，編碼566個氨基酸。根據(jù)其核苷酸序列推導的氨基酸序列分析顯示，2株病毒HA蛋白裂解位點附近的氨基酸序列均為PEKQT↓G，均不具備連續(xù)的堿性氨基酸，符合低致病性流感病毒的裂解位點處氨基酸序列的分子特征(圖2)。

比較分析2株H3N2亞型豬流感病毒的HA1蛋白與人源、歐亞豬源、禽源H3N2亞型流感病毒代表毒株HA1蛋白的分子差異時發(fā)現(xiàn)，所有病毒在HA1蛋白上均存在4個保守的潛在糖基化位點，分別位于：22-NGT、38-NAT、165-NVT和285-NGS。由于氨基酸突變，與歐亞豬源、禽源H3N2亞型流感病毒代表毒株相比，2株病毒和人源H3N2亞型流感病毒在HA1蛋白上的133位(NGT)和246位(NST)多出2個潛在的糖基化位點。另外，2株病毒和多數(shù)代表毒株在HA1蛋白上的8位、63位、122位和126位也存在潛在的糖基化位點(圖3)。

圖1 GD1519毒株和GD1520毒株 (a) HA、(b) NA、(c) PB2、(d) PB1、(e) PA、(f) NP、(g) M、(h) NS 基因的分子遺傳進化分析Fig 1 Phylogenetic analysis (a) HA, (b) NA, (c) PB2, (d) PB1, (e) PA, (f) NP, (g) M and (h) NS of the GD1519 and GD1520 viruses

圖2 GD1519與GD1520的基因重配模式圖(用彩條代表的兩種新型H3N2病毒的八個基因片段， 從上至下依次是PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS。每種不同的顏色代表不同的來源)Fig 2 Putative genomic compositions of the GD1519 and GD1520 viruses(The eight gene segments of two viruses are represented by horizontal bars. From top to bottom, PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, and NS. Each different color represents a distinct origin)

受體結合位點分析顯示，2株病毒與人源、歐亞豬源、禽源H3N2亞型流感病毒代表毒株在HA1蛋白的98位、134位、136位、153位、183位、195位和224位均為酪氨酸(Y)、甘氨酸(G)、絲氨酸(S)、色氨酸(W)、組氨酸(H)、酪氨酸(Y)和精氨酸(R)(圖3)，與歐亞豬源、禽源H3N2亞型流感病毒代表毒株相比，2株病毒與人源H3N2亞型流感病毒代表毒株在135位(G→T)、155位(Y/T→H)、190位(E→D)發(fā)生3處明顯的突變。與其他代表毒株相比，2株病毒與近期人源H3N2亞型流感病毒分支的Moscow/99-like亞分支中的代表毒株在194位發(fā)生了V(纈氨酸)到L(亮氨酸)的突變。分析發(fā)現(xiàn)，不同分支代表毒株的137位受體結合位點處的氨基酸差異較大，本研究的2株病毒與近期人源H3N2亞型流感病毒分支的Sydney/99-like亞分支中的A/swine/Hong Kong/2429/98 A/swine/Hong Kong/2429/98在137位均為苯丙氨酸。HA1蛋白226～228位氨基酸是影響病毒結合宿主的關鍵位點，分析發(fā)現(xiàn)，最早期、早期人源H3N2亞型流感病毒以及歐亞源H3N2亞型流感病毒在這些關鍵位點的氨基酸為L-S-S，禽源H3N2亞型流感病毒在這些關鍵位點的氨基酸為Q-S-G或Q-P-G，近期人源H3N2亞型流感病毒在這些關鍵位點的氨基酸為I-S-S或V-S-S。盡管GD1519和GD1520病毒的HA基因在遺傳進化分析時，其來源于近期人源H3N2亞型流感病毒，但由于2株病毒在226位發(fā)生亮氨酸(L)到蘇氨酸(T)的突變，2株病毒在這些關鍵位點的氨基酸為T-S-S。

兩株病毒的NA基因的編碼區(qū)均由1410個核苷酸組成，共編碼469個氨基酸。糖基化位點分析表明，GD1519病毒共有8個潛在的糖基化位點，分別位于61-NIT、70-NTT、86-NWS、146-NDT、200-NAT、234-NGT、313-NSS、402-NRS。與早期人流感病毒代表毒株A/Victoria/3/1975(H3N2)相比，由于GD1519病毒在313位發(fā)生了天冬氨酸(D)到天冬酰胺(N)的氨基酸突變，多出了一個潛在糖基化位點。GD1520病毒與近期人流感病毒代表毒株A/New York/183/1999(H3N2)相比，均有9個潛在的糖基化位點，分別位于61-NIT、70-NTT、86-NWS、93-NIT、146-NDT、200-NAT、234-NGT、329-NDS、402-NRS。神經(jīng)氨酸酶上可能的耐藥性位點E119、R152、H274、R292和N294位的氨基酸均未發(fā)生變異。

內部基因分析表明，兩株病毒在PB2蛋白的627位均發(fā)生了谷氨酸到賴氨酸(E→K)的突變，701位氨基酸未發(fā)生變化，仍為天冬氨酸(D)；GD1519病毒在26位和31位分別發(fā)生了亮氨酸到苯丙氨酸(L→F)和絲氨酸到天冬酰胺(S→N)的氨基酸突變；27位、30位和34位氨基酸未發(fā)生變化。GD1520病毒在26位、27位、30位、31位和34位氨基酸均未發(fā)生變化。兩株病毒的NS1蛋白均在42位發(fā)生了脯氨酸到絲氨酸(P→S)的氨基酸突變，94位氨基酸未發(fā)生變化。

GD1519毒株和GD1520毒株的NA基因的編碼區(qū)均由1410個核苷酸組成，共編碼469個氨基酸。糖基化位點分析表明，GD1519病毒共有8個潛在的糖基化位點，分別位于61-NIT、70-NTT、86-NWS、146-NDT、200-NAT、234-NGT、313-NSS、402-NRS。與早期人流感病毒代表毒株A/Victoria/3/1975(H3N2)相比， GD1519病毒在313位發(fā)生了天冬氨酸(D)到天冬酰胺(N)的氨基酸突變，多出了一個潛在糖基化位點。GD1520與近期人流感病毒代表毒株A/New York/183/1999(H3N2)一樣，均有9個潛在的糖基化位點，分別位于61-NIT、70-NTT、86-NWS、93-NIT、146-NDT、200-NAT、234-NGT、329-NDS、402-NRS。其它內部基因分析表明，兩株病毒在PB2蛋白的627位均發(fā)生了谷氨酸到賴氨酸(E→K)的突變；GD1519病毒在26位和31位分別發(fā)生了亮氨酸到苯丙氨酸(L→F)和絲氨酸到天冬酰胺(S→N)的氨基酸突變。

紅色方框標記：糖基化位點；綠色方框標記：裂解位點；綠色五角星標記：受體結合位點；a、b、c代表：抗原位點Red boxes: potential glycosylation site; green box: cleavage site; green pentagram: receptor binding site; a, b, and c represent: antigen site圖3 HA1蛋白氨基酸序列比對Fig 3 Molecular analysis of HA1 amino acid sequences of the GD1519 virus, GD1520 virus, and reference viruses

3 討論與結論

豬流感病毒自1930年首次從豬體內分離[10]，不斷發(fā)生進化，不僅對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失，也對公共衛(wèi)生安全造成了一定的威脅。豬作為甲型流感病毒生態(tài)學的重要宿主, 由于豬呼吸道受體的特異性，豬對人和禽流感病毒都易感，自然條件下，禽和人流感病毒可直接感染豬[11]，也有研究結果發(fā)現(xiàn)，SIV也可以感染禽和人[12]。本研究分離的兩株病毒在遺傳進化分析結果顯示GD1519和GD1520的基因片段分別來源近期人源H3N2亞型Moscow/99-like亞分支、早期人源H3N2亞型Victoria/75-like亞分支、近期人源H3N2亞型New York/99-like亞分支。該結果暗示2株SIVs是由不同來源不同時期的類人源H3N2亞型流感病毒間基因重排而產(chǎn)生新型類人源H3N2亞型豬流感病毒。該研究結果進一步證實了豬是可以作為人流感病毒的貯存宿主，在流感病毒的進化和種間傳播中具有重要的作用。

流感病毒的受體特異性與HA蛋白受體結合位點處的氨基酸密切相關[13]，對人H3N2流感病毒而言，HA L266位和S228位氨基酸的改變會影響病毒與SA-α2,6-Gal的受體結合特性。分析兩株病毒的受體結合位點發(fā)現(xiàn)，本研究分離的兩株病毒的與宿主特異性有關的226～228位對應的氨基酸均為TSS，具備人流感病毒的分子特征，暗示這兩株病毒偏愛結合SA-α2,6-Gal受體，具備感染人的能力。

HA蛋白上潛在糖基化位點的增加，會改變病毒的抗原性或增強病毒的流行性，進而使其逃避宿主免疫[14]。研究發(fā)現(xiàn)HA蛋白上潛在糖基化位點較多的毒株往往能夠在流行中形成穩(wěn)定的譜系。不僅如此，糖基化位點的數(shù)量和位置可能會影響蛋白質的折疊、組裝、聚集和轉移[15]。進而能影響病毒的受體結合活性和抗原性。經(jīng)氨基酸序列分析，2株病毒和人源H3N2亞型流感病毒在HA1蛋白上的133位(NGT)和246位(NST)多出2個潛在的糖基化位點。

PB2蛋白上的627位氨基酸與宿主特異性和病毒復制能力密切相關[16]，本研究兩株病毒的627位氨基酸位點為人源K，推測這兩株病毒具有感染哺乳動物的能力。流感病毒M2蛋白上的26位、27位、30位、31位和34位氨基酸與病毒的耐藥性有關[17]，本研究的GD1519病毒在26位和31位發(fā)生了氨基酸突變，暗示該病毒可能對金剛烷胺產(chǎn)生了耐藥性。研究證明NS1蛋白的42位和92位氨基酸與流感病毒的抗干擾素能力有關[18]。本研究的兩株病毒在NS1蛋白的42位均發(fā)生了抗干擾素的氨基酸突變。

本研究中兩株病毒的部分基因片段與河南、廣東、湖南等毒株的對應片段高度同源，說明病毒可能是在生豬跨省流動過程中重組產(chǎn)生，這提示應當加強對SIV的主動監(jiān)測，尤其是易感動物跨區(qū)域流動時的監(jiān)測。對本研究中的兩株SIVs的分子特征和遺傳進化特性進行系統(tǒng)分析,結果顯示其可能具有感染人的能力。因此，從公共衛(wèi)生安全角度考慮，也應建立對SIV的流行監(jiān)測工作機制，密切關注我國豬群中SIV的流行動態(tài)，及時掌握其分子遺傳進化規(guī)律，這對確保人類健康和降低養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟損失都具有重要意義。