劉婉頤, 鄧國(guó)忠*, 崔寶東, 鐘永科

(1. 遵義醫(yī)科大學(xué) a. 藥學(xué)院； b. 貴州省生物催化與手性合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 遵義 563000)

手性胺類化合物是多種藥物活性分子的重要結(jié)構(gòu)單元，在生物醫(yī)藥和農(nóng)用化學(xué)品中扮演著重要的作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，許多手性藥物分子都含有手性胺的分子骨架，如卡巴拉汀(1a)、達(dá)泊西汀(2a)、加雷沙星(3a)等(Chart 1)[1]。此外，手性胺還可以作為重要的手性配體[2]。在傳統(tǒng)的合成方法中，手性胺的合成主要依賴于烯胺還原、酰胺還原、亞胺還原及不對(duì)稱轉(zhuǎn)移氫化等[3]，常用的催化劑以有機(jī)小分子催化劑和金屬催化劑為主，小分子催化劑如手性磷酸、手性雙烯-硼烷，金屬催化劑鈀、鈦、銠、鈷等[4]。

Scheme 1

近年來(lái)，生物催化因具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高和環(huán)境友好等特點(diǎn)，不斷應(yīng)用于手性胺類藥物分子及其中間體的合成應(yīng)用之中[5-6]。自然界提供了物種豐富的生物酶庫(kù)，為手性藥物分子的合成應(yīng)用和工業(yè)生產(chǎn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著DNA測(cè)序、DNA重組和酶蛋白的定向進(jìn)化等生物技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的生物催化劑在化學(xué)反應(yīng)中有了更優(yōu)異的表現(xiàn)[7]，而生物催化合成手性胺的方法也不斷涌現(xiàn)。本文綜述了近年來(lái)不同生物酶在手性胺酶法合成中的應(yīng)用。

Scheme 2

Chart 1

脂肪酶(Lipase)來(lái)源于羧基酯水解酶家族，能夠催化酯鍵和酰胺鍵的斷裂或形成。脂肪酶具有多種催化活性，不僅可以催化拆分外消旋醇類、酸類、胺類和酯類，而且可以催化酯水解、胺解、酯交換等反應(yīng)[10]。脂肪酶催化手性胺的合成策略一般是以外消旋的胺(4a)合成外消旋的酰胺或酯，再進(jìn)行動(dòng)力學(xué)拆分得到手性胺(4b, Scheme 1)[5]。

1996年，Kohls[11]課題組首次報(bào)道了以脂肪酶作為生物催化劑對(duì)手性胺進(jìn)行動(dòng)力學(xué)拆分。90年代初期，脂肪酶在工業(yè)上開(kāi)始得到廣泛的應(yīng)用，拜耳公司利用lipase B對(duì)α-甲基芐胺進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)拆分。2010年，SUN[13]課題組利用脂肪酶Novozyme 435對(duì)2-庚胺(5a)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)拆分，得到了99%的ee值和收率48.9%的(S)-5b(Scheme 2)。

2011年，Munoz[14]課題組利用脂肪酶為催化劑合成高對(duì)映選擇性的苯乙胺。2013年De Miranda[15]課題組報(bào)道了使用丙烯酸樹(shù)脂固定的Novozyme 435脂肪酶作為生物催化劑，對(duì)1-苯乙胺(6a)進(jìn)行酯化拆分，得到(S)-構(gòu)型的苯乙胺(6b， Scheme 3)，催化底物濃度高達(dá)900 mM，其固定化酶可以進(jìn)行9次有效循環(huán)仍保持較高催化活性；發(fā)現(xiàn)在不同酰基供體下，該反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為31%～57%不等。溫和條件下，當(dāng)以2-甲氧基乙酸甲酯或乙酸乙酯作為?；w時(shí)，該反應(yīng)體現(xiàn)出優(yōu)異的對(duì)映選擇性，E值可達(dá)200以上，但隨著反應(yīng)溫度的升高E值呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

Scheme 3

Scheme 4

轉(zhuǎn)氨酶(Transaminases， TAs)是一類5′-磷酸吡哆醛(PLP)依賴性轉(zhuǎn)移酶，能夠可逆催化酮基與氨基間的立體選擇性轉(zhuǎn)移，其普遍存在于植物、微生物以及動(dòng)物的心肌、腦、肝、腎等組織中[5]。轉(zhuǎn)氨酶根據(jù)氨基轉(zhuǎn)移位置的不同，大致可分為α-轉(zhuǎn)氨酶和ω-轉(zhuǎn)氨酶兩大類，當(dāng)催化的反應(yīng)底物或產(chǎn)物中含有α-氨基酸時(shí)稱之為α-轉(zhuǎn)氨酶，含有ω氨基酸則為ω-轉(zhuǎn)氨酶[16]。α-轉(zhuǎn)氨酶的產(chǎn)物較為單一，通常僅為α-氨基酸，而ω-轉(zhuǎn)氨酶因其可以催化酮、醛等不對(duì)稱氨基轉(zhuǎn)移從而在醫(yī)藥合成中得到更加廣泛的應(yīng)用[17]。轉(zhuǎn)氨酶在催化反應(yīng)過(guò)程中不需要昂貴的輔因子參與反應(yīng)，可將酮或醛(7a)與氨基供體反應(yīng)生成手性胺類化合物(7b,Scheme 4),但其催化活性易受到底物抑制和產(chǎn)物抑制，并且底物范圍相對(duì)較窄[9]。可逆反應(yīng)的存在是將酮類底物轉(zhuǎn)化為手性胺的主要障礙，而去除副產(chǎn)物丙酮酸可改善這種不利的熱力學(xué)不平衡[18]。轉(zhuǎn)氨酶用于手性胺合成的方法大致分為三類：(1)外消旋體的動(dòng)力學(xué)拆分；(2)前手性酮的不對(duì)稱轉(zhuǎn)化；(3)外消旋底物的轉(zhuǎn)化[19](圖1)。在90年代初期，STIRLING DAVID等[20]就報(bào)道了(R)-構(gòu)型和(S)-構(gòu)型的轉(zhuǎn)氨酶，能夠?qū)⑼惖孜锇被癁槭中员郊装?，收率均?0%以上。

Scheme 5

圖 1 轉(zhuǎn)氨酶合成手性胺的策略

2010年，Savile等[21]以轉(zhuǎn)氨酶為生物催化劑，取代銠催化烯胺進(jìn)行不對(duì)稱加氫合成手性胺，用于工業(yè)化生產(chǎn)抗糖尿病藥物西他列汀(8c)，這是生物催化在工業(yè)生產(chǎn)上的重大突破，也標(biāo)志著生物催化在合成手性胺類藥物活性分子中的合成應(yīng)用(Scheme 5)。

2015年，Chen課題組克隆表達(dá)了一種來(lái)自熱脫硝桿菌的(S)-構(gòu)型選擇性的ω-轉(zhuǎn)氨酶TPTAgth，在pH 9.0和65 ℃下仍可以保持高活性，表現(xiàn)出良好的耐熱性和強(qiáng)堿環(huán)境耐受性，且該酶對(duì)酮糖具有良好的催化活性。

2016年，PAVLIDIS等在取代基空間位阻較大的結(jié)構(gòu)方面得到了較大進(jìn)展，能夠?qū)Ⅲw積較大的酮轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的手性胺(9a～14a)，其收率最高可達(dá)82%，ee值可達(dá)99%以上，表現(xiàn)出優(yōu)秀的對(duì)映選擇性(Chart 2)。

Chart 2

2016年，Wu課題組[24]發(fā)現(xiàn)了4個(gè)來(lái)自假單胞菌的(R)-構(gòu)型選擇性ω-TAs，其中PpspuC通過(guò)動(dòng)力學(xué)拆分外消旋2-苯甘氨醇(15a)得到ee值高于99%的(S)-2-苯甘氨醇(15b)(Scheme 6)。2019年該課題組克隆表達(dá)了來(lái)自節(jié)桿菌屬的(R)-構(gòu)型選擇性ω-TAs(MVTA)，可以對(duì)大體積的β-氨基醇進(jìn)行動(dòng)力學(xué)拆分，其產(chǎn)物的ee值大于99%[25]。

Scheme 6

Scheme 7

在之前的報(bào)道中，絕大部分轉(zhuǎn)氨酶屬于(S)-構(gòu)型選擇，報(bào)道的(R)-構(gòu)型選擇的轉(zhuǎn)氨酶較少，只有一種來(lái)自節(jié)桿菌屬的轉(zhuǎn)氨酶被設(shè)計(jì)來(lái)轉(zhuǎn)化大基團(tuán)的酮。2016年,Guan課題組[28]報(bào)道了對(duì)來(lái)自節(jié)桿菌屬的(R)-轉(zhuǎn)氨酶的晶體結(jié)構(gòu)分析，為此類轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)修飾改造、定向進(jìn)化提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，并為新型手性胺類化合物合成途徑的設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。

Chart 3

Scheme 8

單胺氧化酶(Monoamine oxidases， MAOs)屬于黃素腺嘌呤核苷酸(FAD)依賴的胺氧化還原酶類，催化由氧驅(qū)動(dòng)的胺向相應(yīng)的亞胺轉(zhuǎn)化，并生成副產(chǎn)物過(guò)氧化氫。由于單胺氧化酶的高立體選擇性識(shí)別，通常只選擇將單一構(gòu)型的對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而將消旋的手性胺去消旋化而獲得單一構(gòu)型的產(chǎn)物。1995年，來(lái)自Asoergillusniger的單胺氧化酶首次被發(fā)現(xiàn)并命名為MAO-N[30]。2002年，Alexeeva課題組[31]報(bào)道了利用MAO-N為生物催化劑，通過(guò)MAO-N催化的氧化拆分反應(yīng)制備手性胺的新策略。

2013年，Ghislieri課題組[32]利用MAO-N為生物催化劑，對(duì)四氫-β-咔啉(16a)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了去消旋化反應(yīng)，并得到ee值為99%和93%的單一構(gòu)型產(chǎn)物(16b, Scheme 7)。該課題組進(jìn)一步對(duì)MAO-N進(jìn)行定向進(jìn)化，擴(kuò)大了含有芳基取代的手性胺底物譜(17a～29a, Chart 3)[7]。2018年，該課題組對(duì)單胺氧化酶可催化的底物范圍進(jìn)行了總結(jié)，其中突變體D5、 D9、 D11具有較高的活性，其底物范圍覆蓋了α-取代的甲基苯胺、聯(lián)苯胺和1,2,3,4-四氫喹啉等不同結(jié)構(gòu)的伯胺、仲胺、叔胺化合物。

2016年，本課題組發(fā)現(xiàn)蒙氏假單胞菌ZMU-T01的整細(xì)胞對(duì)四氫喹啉(30a)類化合物具有氧化拆分活性，以此菌株整細(xì)胞作為生物催化劑能對(duì)2-取代-1,2,3,4-四氫喹啉(31a)進(jìn)行氧化拆分，并以最高99%的ee值和50%的收率獲得(R)-構(gòu)型產(chǎn)物。該菌株整細(xì)胞對(duì)2-取代-1,2,3,4-四氫喹啉類底物普適性較好，但對(duì)于苯環(huán)含有取代基的底物適應(yīng)性表現(xiàn)不佳[34]。2018年，本課題組從蒙氏假單胞菌ZMU-T01中克隆表達(dá)了一株新的單胺氧化酶MAO5，構(gòu)建相應(yīng)基因工程菌，通過(guò)整細(xì)胞生物催化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)苯環(huán)取代的2-甲基-1,2,3,4-四氫喹啉(32a)類化合物的高對(duì)映選擇性氧化拆分，對(duì)多種底物表現(xiàn)出優(yōu)異的立體選擇性，ee值可達(dá)99%及以上(Scheme 8)[35]。

2016年，Li課題組利用來(lái)自短桿菌IH-35A的環(huán)己胺氧化酶(Cyclohexylamine oxidase， CHAO)為生物催化劑，對(duì)外消旋胺進(jìn)行動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分去消旋。野生型的CHAO對(duì)腫胺和叔胺均表現(xiàn)為低活性或無(wú)活性，但通過(guò)對(duì)CHAO進(jìn)行定向進(jìn)化，使其對(duì)2-取代-1,2,3,4-四氫喹啉類化合物可進(jìn)行有效的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分，并得到了高達(dá)99%的ee值和76%的收率。他們對(duì)CHAO進(jìn)一步研究并對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，通過(guò)定向進(jìn)化，拓展該酶的底物結(jié)合口袋，成功篩選到突變體，可以有效催化2-位取代基為大基團(tuán)的底物，并具有較高的對(duì)映選擇性[37]。2018年，朱敦明課題組與Reetz教授課題組合作共同對(duì)MAO-N進(jìn)行改造，使其對(duì)1,2,3,4-四氫-1-取代異喹啉、2-苯基吡咯啉等(33a～37a)底物都有較好的底物適應(yīng)性，并且表現(xiàn)出較好的對(duì)映選擇性和催化活性[38]。

亞胺還原酶(Imine reductase， IRED)是一種依賴NAD(P)H的氧化還原酶，可以催化前手性亞胺不對(duì)稱還原為相應(yīng)的胺，具有高度立體選擇性[39]。除單胺氧化酶可用于廣泛結(jié)構(gòu)的手性胺的合成外，其余大多數(shù)生物催化劑只能產(chǎn)生一級(jí)胺，不能直接生成二級(jí)胺或三級(jí)胺，轉(zhuǎn)氨酶和氨脫氫酶都僅限于將氨基轉(zhuǎn)移至羰基上，對(duì)于手性仲胺和叔胺的合成是難以實(shí)現(xiàn)的。而亞胺還原酶可以通過(guò)不對(duì)稱氫化還原為這些手性胺化合物提供新的合成方法。亞胺還原酶雖然能催化反應(yīng)生成手性胺，但其對(duì)映選擇性較低，并需要大量的生物催化劑加入[42-43]。2010年，Mitsukura等[44]報(bào)道了來(lái)自鏈霉菌屬的亞胺還原酶GF3587能夠?qū)?-甲基吡咯啉(38a)還原為相應(yīng)的(R)-2-甲基吡咯烷(38b)。 2011年，該課題組將另一種亞胺還原酶GF3546進(jìn)行純化表征和表達(dá)，能夠催化生成(S)-2-甲基吡咯烷(38c， Scheme 9)，其催化活性為野生型的兩倍[45]。

Scheme 9

2013年，Leipold課題組[46]將亞胺還原酶GF3546過(guò)表達(dá)于大腸桿菌宿主中，其催化底物普適性得到提升，可以對(duì)映選擇性還原一系列不同的亞胺，包括2-取代環(huán)亞胺，二氫異喹啉等。2015年，該課題組將GF3587過(guò)度表達(dá)于大腸桿菌中，其催化活性得到了較大提升[40]。同年，聯(lián)合亞胺還原酶((R)-IRED)和單胺氧化酶(MAO-N)對(duì)外消旋雜環(huán)胺(39a)進(jìn)行動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分，得到ee值>99%手性的雜環(huán)胺(39c， Scheme 10)[47]。 MAO和IRED共同作用時(shí)可用于手性胺的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分，而這種雙酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)體系避免了MAO在催化胺類化合物動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分過(guò)程中化學(xué)還原劑的使用，如氨硼烷。

Scheme 10

Scheme 11

2018年，Velikogne課題組[39]將亞胺還原酶與醇脫氫酶進(jìn)行共表達(dá)后得的菌株，通過(guò)醇脫氫酶在NADP+作為輔因子下可氧化脫氫2-丙醇生成丙酮，并得到亞胺還原酶完成亞胺還原反應(yīng)所需的NADPH，從而達(dá)到輔因子循環(huán)。在不添加其他輔因子的條件下，底物濃度可提升至100 mM，為克級(jí)制備光學(xué)純手性胺提供了一種綠色、高效且經(jīng)濟(jì)的方法。

Scheme 12

Scheme 13

Scheme 14

Scheme 15

胺脫氫酶(Amine dehydrogenase， AmDH)是一種能夠催化酮的不對(duì)稱還原胺化反應(yīng)的生物酶，且副產(chǎn)物僅有水。早在1968年Eady等[48]就對(duì)甲胺脫氫酶進(jìn)行了純化表征，但其不能依賴NAD+或NADP+為電子受體，并且僅能氧化脂肪族的單胺、二胺、組胺，不能氧化仲胺、叔胺和季胺鹽。2000年，Itoh等[49]對(duì)來(lái)自鏈霉菌中的胺脫氫酶進(jìn)行分離純化表征，并構(gòu)建了它的催化底物范圍，不僅能催化胺的可逆氧化脫胺反應(yīng)，還能催化氨基醇和氨基酸的可逆脫胺反應(yīng)，但催化效率和對(duì)映選擇性都不高；但此次構(gòu)建的氨脫氫酶基因工程菌可以依賴NAD+或NADP+進(jìn)行電子傳遞，而之前所報(bào)道的此類酶均需要人工電子受體。2012年，Abrahamson[50]課題組對(duì)來(lái)自芽孢桿菌的亮氨酸脫氫酶進(jìn)行定向進(jìn)化，開(kāi)發(fā)了一種新的氨脫氫酶，具有較高的催化活性，能催化4-甲基-2-氧代戊酸(41a)和甲基異丁基酮(42a)生成相應(yīng)的手性胺(41b,42b, Scheme 11)，ee值達(dá)到99%。

2015年，Ye課題組[51]發(fā)現(xiàn)了來(lái)自紅球菌屬的苯丙胺酸脫氫酶通過(guò)定向進(jìn)化得到的三突變體K66Q/S149G/N262C(TM_PheDH)是具有高度對(duì)映選擇性的生物催化劑，能選擇性地還原苯基丙酮(42a)和4-苯基-2-丁酮(43a)，得到ee值高達(dá)98%的(R)-安非他明(42b)和(R)-1-甲基-3-苯基丙胺(43b, Scheme 12)。

Scheme 16

2016年，Abrahamson課題組[50]開(kāi)發(fā)了3個(gè)胺脫氫酶與甲酸脫氫酶協(xié)同作用，可對(duì)各類芳香族和脂肪族的酮類及醛類進(jìn)行還原胺化，其催化的底物濃度高達(dá)50 mM，同時(shí)達(dá)到99%的ee值，利用此雙酶體系進(jìn)行還原胺化，僅生成無(wú)機(jī)碳酸鹽為唯一副產(chǎn)物。并在他的研究中證明了單一氨脫氫酶不能接受不同類型的底物，如Ch1-AmDH對(duì)脂肪族酮和苯乙酮(44a)有較高的活性，Rs-PhAmDH對(duì)苯丙酮衍生物(45a)及空間位阻較大的酮有較高的活性(Scheme 13)。

2017年，Ye課題組[51]利用苯丙氨酸脫氫酶對(duì)苯氧基-2-丁酮(46a)進(jìn)行還原胺化得到(R)-1-苯氧基-2-丙胺(46b, Scheme14)，其底物濃度可以達(dá)400 mM，產(chǎn)物ee值>99%，轉(zhuǎn)化率為96%。

細(xì)胞色素P450單加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases)是自然界用途最廣泛的生物催化劑，具有催化反應(yīng)類型多樣性和底物多樣性[52]。可以催化多種底物的區(qū)域選擇性和立體選擇性氧化反應(yīng)，并參與多種天然產(chǎn)物的生物合成[53]。

早在1985年就曾有利用P450酶催化氮原子的功能化轉(zhuǎn)移報(bào)道，這是P450在胺類化合物合成中較早的應(yīng)用[54]。2013年，Mcintosh課題組[53]報(bào)道了用于C—H胺化的高活性酶催化劑，對(duì)P450BM3的T268A和C400S殘基突變后獲得P450BM3變種酶P411，其對(duì)C—H胺化的催化活性得到了巨大提升，能催化2,4,6-三乙基苯磺酰疊氮(47a, Scheme 15)生成環(huán)狀手性胺(47b)(Scheme 15)，ee值為87%，分離收率69%。

2016年，Prier課題組[55]繼續(xù)以P411突變體為生物催化劑，利用σ重排進(jìn)行烯丙基胺的不對(duì)稱酶法合成。2019年，該課題組繼續(xù)以P411為模板進(jìn)行突變，構(gòu)建了一個(gè)可以用于一級(jí)(48a)，二級(jí)(49a)和三級(jí)(50a, Scheme 16)C—H不對(duì)稱胺化的酶庫(kù)，并在吸電子基和給電子基以及空間位阻的影響下都具有良好的底物普適性[56]。

手性胺作為藥物合成中的重要骨架分子，在新藥研發(fā)和天然藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)中都具有重要的意義。近些年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得生物酶定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)等技術(shù)愈發(fā)成熟?？梢愿鶕?jù)不同的化學(xué)反應(yīng)設(shè)計(jì)所需的生物酶，尤其在區(qū)域選擇性、對(duì)映選擇性控制以及不活潑位點(diǎn)的活化方面取得顯著提升?，F(xiàn)階段所發(fā)現(xiàn)的脂肪酶、轉(zhuǎn)氨酶、單胺氧化酶、亞胺還原酶、胺脫氫酶以及P450酶已經(jīng)能在不同類型的手性胺合成中具有一定的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。但目前仍然存在新酶發(fā)現(xiàn)不足，底物普適性不高、熱穩(wěn)定及有機(jī)溶劑耐受性有限等問(wèn)題，這些問(wèn)題也是指導(dǎo)手性胺類藥物分子重要中間體生物催化合成發(fā)展的重要方向。