張燦燦,譚志軍

（1.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300192；2.天津市第一中心醫(yī)院普外科，天津300192）

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，患病率和死亡率均位于世界前列，由于胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高，5年生存率較低，預(yù)后較差，而我國(guó)在全球范圍內(nèi)又屬于胃癌高發(fā)國(guó)家，嚴(yán)重影響患者健康，是腫瘤預(yù)防和治療的重點(diǎn)［1-2］。形成素樣蛋白2（Formin-like 2，F(xiàn)MNL2）是形成素樣蛋白（Formins）家族成員之一，定位于人類染色體2q23.3，調(diào)控細(xì)胞分裂、極性、黏附和形態(tài)發(fā)生［3］。FMNL2 在肌動(dòng)蛋白絲成核或伸長(zhǎng)過程中起著關(guān)鍵作用，影響細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)FMNL2與癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［4-5］。最近幾年FMNL2 作為腫瘤研究的熱點(diǎn)，主要集中在結(jié)直腸癌［6］、黑色素瘤［7］、乳腺癌［8］等。例如，F(xiàn)MNL2 在結(jié)腸癌中高表達(dá)，增強(qiáng)結(jié)腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并且FMNL2 表達(dá)異常的患者5年生存率較低［5-6］。但是目前FMNL2 在胃癌中的作用尚不清楚，同時(shí)胃癌晚期患者易發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)及化療效果不佳，研究FMNL2 在胃癌中的作用機(jī)制，在胃癌的治療上將具有重要的指導(dǎo)意義。本研究主要采用免疫組化和實(shí)時(shí)定量PCR 的方法檢測(cè)FMNL2 在胃癌組織中的表達(dá)情況，并分析FMNL2 的表達(dá)量與其臨床病理因素和生存預(yù)后之間的關(guān)系，探討FMNL2 在腫瘤形成及轉(zhuǎn)移過程中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集我院普外科2017年11月至2018年11月的30例患者胃癌組織標(biāo)本（取自手術(shù)切除經(jīng)病理檢查確認(rèn)為胃癌標(biāo)本的組織）及對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)癌組織（取自距離原發(fā)病灶邊緣5 cm 以外且病理報(bào)告無癌殘留區(qū)的組織）；男性21例，女性9例，平均年齡（63.8±11.2）歲，術(shù)前均未接受放化療。將收集的組織標(biāo)本分別存儲(chǔ)于液氮罐和4%組織固定液中以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 FMNL2 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（貨號(hào)：ab72105）。免疫組化試劑盒（貨號(hào)：ZLI9018）、DAB 顯色液（貨號(hào)：SP9001）等購(gòu)自北京中杉金橋公司。動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司（貨號(hào)：DP431），引物由上海生工公司合成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司（貨號(hào)：A5001）。SYBRGREEN購(gòu)自瑞士Roche公司（貨號(hào)：4913914001）。

1.3 免疫組化 按照免疫組化步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出FMNL2 一抗的最佳稀釋濃度為1：200，以PBS 作為陰性對(duì)照。免疫組化評(píng)分(IHC 評(píng)分)通過其染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率進(jìn)行評(píng)分，染色強(qiáng)度分為4類：0（陰性）、1（弱染色）、2（中等染色）、3（強(qiáng)染色）；陽性率（即陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞百分比）分為5類：0（＜1%）、1（1%～25%）、2（25%～50%）、3（50%～75%）、4（＞75%）。IHC 評(píng)分為各個(gè)染色強(qiáng)度與其對(duì)應(yīng)的陽性細(xì)胞率乘積之和，雙盲法閱片，本研究中IHC 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：胃癌中FMNL2 低表達(dá)IHC評(píng)分為≤7，高表達(dá)IHC 評(píng)分為≥8。

1.4 組織總RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄 取約20 mg 組織，加入300 μL 裂解液勻漿，完成后加入590 μL 無酶水和10 μL 蛋白酶K，混勻后56 ℃金屬浴20 min，低溫離心機(jī)以12000×g 離心5 min，取上清420 μL和等量無水乙醇輕柔混勻置于吸附柱中離心1 min，加入350 μL 去蛋白液離心1 min，加入80 μL DNase I 工作液，室溫靜置15 min，重復(fù)一次去蛋白液，加入500 μL 漂洗液室溫靜置2 min 離心1 min，重復(fù)一次后加入DEPC 水溶解離心即可得RNA 液。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作制備cDNA：取1 μg RNA 和1 μL Oligo（dT）后，補(bǔ)DEPC 水至10.5 μL，70 ℃反應(yīng)5 min 后迅速置于冰上，加入4 μL 5×Reaction Buffer、3 μL MgCl2、1 μL PCR Nucleotide Mix、1 μL Reverse Transcriptase 和0.5 μL RNnasin?Ribonuclease Inhibitor，程序設(shè)為：25 ℃5 min、42 ℃60 min、70℃15min，反應(yīng)完成后所得反應(yīng)液為cDNA。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR 法測(cè)定胃癌組織中FMNL2 的表達(dá)情況 FMNL2 的上游引物為5′-CCCGCTCTGGAAGACATT-3′，下游引物為5′-CTGCCAACAG TAAGACAAG-3′；GAPDH 的上游引物為5′-TGCAC CACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物為5′-GGCATG GACTGTGGTCATGAG-3′。建立20μL 反應(yīng)體系［Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL］，設(shè)置反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃10 min；95℃10 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。通過循環(huán)數(shù)法2-△△ct計(jì)算位于組織中各指標(biāo)的表達(dá)情況。

1.6 通過Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(kù)分析FMNL2基因mRNA水平與胃癌患者生存預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)包含5 種癌癥（乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和肝癌）的mRNA 表達(dá)譜芯片公共數(shù)據(jù)庫(kù)，從中能夠獲得基因表達(dá)與疾病預(yù)后的信息。通過此數(shù)據(jù)庫(kù)輸入胃癌與目的基因FMNL2 來挖掘數(shù)據(jù)，即可得到該基因表達(dá)的K-M 曲線圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過軟件SPSS19.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示，兩兩比較采用組間t 檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P ＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中FMNL2 的表達(dá)情況 免疫組化染色結(jié)果如圖1 所示，胃癌組織中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量深棕色顆粒，而在遠(yuǎn)癌組織中未觀察到FMNL2 陽性細(xì)胞，說明FMNL2 在胃癌組織中的表達(dá)與其對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)癌組織相比明顯升高。

圖1 IHC 檢測(cè)胃癌組織中FMNL1 的表達(dá)情況(免疫組化)Fig 1 Expression of FMNL1 in gastric cancer tissues detected by IHC(IHC)

通過實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)30 對(duì)胃癌組織及與其相對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)癌組織中FMNL2 基因的mRNA 表達(dá)情況。結(jié)果如圖2 所示，在胃癌組織中，F(xiàn)MNL2 基因的表達(dá)水平顯著高于其對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 FMNL2 的表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系 按照IHC 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，將30例胃癌組織分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。兩組胃癌組織中FMNL2 表達(dá)與臨床病理因素分析如表1 所示，F(xiàn)MNL2 表達(dá)與患者年齡、性別及癌癥的浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)特征沒有顯著相關(guān)性（均P＞0.05）。然而，F(xiàn)MNL2 表達(dá)水平與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期之間具有相關(guān)性（均P＜0.05）。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)胃癌組織中FMNL2 的表達(dá)Fig2 Expression of FMNL2 in gastric cancer tissues detected by real-time PCR

2.3 胃癌患者FMNL2 基因mRNA 水平與生存預(yù)后之間的關(guān)系 通過Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了胃癌組織中FMNL2 基因的表達(dá)水平和胃癌患者生存預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果如圖3 所示，胃癌組織中FMNL2 基因高表達(dá)（high）患者組的生存期較短，生存預(yù)后較差，其中位生存期為29 個(gè)月，然而FMNL2基因低表達(dá)（low）患者組的中位生存期為89 個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

3 討論

Formins 家族是一類參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞分裂、細(xì)胞極性和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的肌動(dòng)蛋白修飾蛋白，其中FMNL2 在遷移細(xì)胞的前緣產(chǎn)生突出的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)，即板層和絲狀足［9-10］。FMNL2 可促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［5］，這與細(xì)胞黏連的喪失和遷移能力的增強(qiáng)有關(guān)［11］。在健康組織中，F(xiàn)MNL2 廣泛表達(dá)，最高表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)［10，12］；FMNL2 在幾種癌癥中表達(dá)上調(diào)，尤其是在轉(zhuǎn)移性腫瘤中［6，13］。不受控制的增殖以及侵襲性和轉(zhuǎn)移性是惡性腫瘤的一個(gè)特征。因此，對(duì)腫瘤組織中FMNL2 的研究是必要的。

遷移和侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要起始步驟。而FMNL2 與腫瘤的遷移和侵襲密切相關(guān)，例如，F(xiàn)MNL2在結(jié)腸癌中的表達(dá)與腫瘤侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［14］。Zhu 等［6］研究表明，F(xiàn)MNL2 在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平較高，同時(shí)FMNL2 的高表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)與結(jié)腸癌的侵襲和遷移相關(guān)［14］，這為FMNL2 在癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用提供了直接證據(jù)。相反，在FMNL2 水平較低的肝癌中，F(xiàn)MNL2 過表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲［15］。這說明FMNL2 在不同腫瘤類型中起著不同的作用。在胃癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)：抑制FMNL2 基因的表達(dá)可影響胃癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，這表明FMNL2可能參與胃癌的生長(zhǎng)［16］。本研究探討了FMNL2 在胃癌組織中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FMNL2 在胃癌組織中高表達(dá)，并且高表達(dá)組的胃癌惡性程度較高，促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，表明FMNL2 可能與胃癌發(fā)展進(jìn)程以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此結(jié)果與Zhong 等發(fā)現(xiàn)的FMNL2 參與胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的結(jié)論一致。然而FMNL2 在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

在多種人類癌癥中均發(fā)現(xiàn)FMNL2 的異常表達(dá)，并且與腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)，例如在結(jié)直腸癌中，F(xiàn)MNL2 高表達(dá)可能與淋巴轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)，而在肝癌中，F(xiàn)MNL2 表達(dá)降低被認(rèn)為是預(yù)后較差的一個(gè)標(biāo)志［15，17］。通過Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫(kù)分析FMNL2在胃癌中對(duì)生存預(yù)后的作用，發(fā)現(xiàn)胃癌患者FMNL2高表達(dá)組的生存期少于低表達(dá)組的生存期，中位生存期僅29 個(gè)月。本研究結(jié)果推測(cè)，在胃癌組織中FMNL2 表達(dá)量越高，胃癌的惡性程度越高，患者的預(yù)后也越差。

綜上所述，通過本實(shí)驗(yàn)證明FMNL2 在胃癌組織中高表達(dá)，并且FMNL2 很可能是了解胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)分子，為胃癌的治療提供了新的思路和途徑。