徐亞軍,趙龍飛,2,*,邢鴻福,羅云霄,魏正欣

1 商丘師范學(xué)院生物與食品學(xué)院, 商丘 476000 2 河南省特色微生物資源開發(fā)與應(yīng)用工程研究中心, 商丘 476000

小麥?zhǔn)俏覈}堿地主要農(nóng)作物之一,在幼苗時期易受到鹽堿毒害,減弱其抵抗逆境的能力[1],導(dǎo)致產(chǎn)量下降。近年來,越來越重視對小麥抗鹽機(jī)理的研究。劉曉華等[2]采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將TaCHP基因插入小麥品種“濟(jì)南17”和“濟(jì)麥22”基因中,以NaCl模擬鹽脅迫環(huán)境培植小麥,轉(zhuǎn)基因小麥與對照組相比其體內(nèi)Pro含量上升、MDA含量降低,TaCHP基因能提高小麥抗鹽性。李金亭等[3]采用外源H2O2處理“鄭麥- 004”鹽脅迫下幼苗,提高了小麥耐鹽性；郭偉和王慶祥[4]利用腐植酸浸種提高了小麥幼苗抗鹽堿能力。Safdarian等[5]在鹽脅迫環(huán)境下接種小麥硝基愈瘡木膠節(jié)桿菌(Arthrobacternitroguajacolicus)比較轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果表明有152個基因上調(diào),在接種小麥根部苯丙烷、黃酮類、萜類、卟啉、葉綠素代謝、芪類化合物、雙苯庚烷代謝途徑呈現(xiàn)差異性表達(dá),并檢測到編碼次生代謝物基因,參與細(xì)胞木質(zhì)素和抗氧化物的生物合成,促進(jìn)生長并提高了小麥耐鹽性。前人通過物理方法、化學(xué)方法、耕作控制、遺傳育種等措施和途徑[6]在一定程度上提高小麥耐鹽能力,但這些方法仍存在很多不足,如成本高、不安全、周期長等。目前,運(yùn)用生物方法[7]探索小麥耐鹽機(jī)制及提高小麥抗鹽能力已成為研究的熱點(diǎn)。

植物內(nèi)生菌指一定階段或全部階段定殖于健康植物組織及器官內(nèi),對植物不產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性危害并與植物形成互惠互利關(guān)系的一類微生物類群[8],可增強(qiáng)植物抗病、抗鹽堿、抗重金屬等抗逆能力[9-10]。Zhao等[11]研究表明大豆根瘤內(nèi)生菌對大豆疫霉菌具有拮抗作用和促進(jìn)宿主生長的作用,Fan等[12]表明對分離自豆科植物苜蓿根瘤的內(nèi)生細(xì)菌SinorhizobiummelilotiCCNWSX0020,采用重金屬吸附和富集法、電鏡掃描和能譜分析法、傅里葉變換紅外光譜分析法等表明,內(nèi)生菌可通過與植物聯(lián)合作用、轉(zhuǎn)化重金屬形態(tài)、協(xié)同與共生作用等來減小重金屬對植物毒害及促進(jìn)植物對重金屬分解。此外,許多有益內(nèi)生細(xì)菌能提高宿主植物在高鹽環(huán)境下的存活率[13],Sapre等[7]分離自小麥根際的耐鹽促生長菌株IG3,接種燕麥在100 mmol/L的NaCl鹽濃度脅迫下可提高其耐鹽性,鹽脅迫下接種組和未接種組相比,莖長、根長、莖干物質(zhì)、根干物質(zhì)及相對含水量都明顯提高,而脯氨酸、電解質(zhì)滲出率、丙二醛、抗氧化酶活性均出現(xiàn)降低,明顯提升燕麥在鹽脅迫下的耐鹽性和促進(jìn)植株生長。而大豆根瘤內(nèi)生細(xì)菌在豆科植物根系具有促進(jìn)植物生長[14- 15]、提高植物抗逆性、增強(qiáng)植物抗病能力等[16]功能。趙龍飛等[17]對大豆根瘤內(nèi)生細(xì)菌溶磷性研究發(fā)現(xiàn)溶磷菌能促進(jìn)大豆生長；劉杰等[18]報道了豆科植物根瘤內(nèi)生細(xì)菌的研究現(xiàn)狀及功能。在長期系統(tǒng)進(jìn)化過程中,內(nèi)生細(xì)菌與植物形成一種特殊的互惠互利關(guān)系[19],其在促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和研發(fā)生物農(nóng)藥方面具有較大潛力,是修復(fù)鹽脅迫作用的重要微生物資源[20]。目前,根瘤內(nèi)生細(xì)菌不僅能與豆科植物形成共生固氮體系,在適宜條件下還可與玉米、水稻、小麥等非豆科草本植物形成聯(lián)合內(nèi)生作用,增強(qiáng)作物自身抗逆性,促進(jìn)作物健康生長,減輕環(huán)境污染,降低種植成本,同時也可緩解土壤鹽漬化程度[21]。本課題組前期大豆根瘤內(nèi)生細(xì)菌人工氣候室接種小麥幼苗試驗(yàn)結(jié)果[22]表明,可改善鹽脅迫環(huán)境下小麥幼苗生長及促進(jìn)小麥植株生長。但是目前國內(nèi)有關(guān)內(nèi)生細(xì)菌對鹽脅迫下小麥幼苗生長影響研究仍較為少見。基于此,本試驗(yàn)擬選用周麥18為試驗(yàn)材料,大豆根瘤內(nèi)生細(xì)菌為研究菌株,檢測小麥體內(nèi)Pro和MDA含量變化,探討接種大豆根瘤內(nèi)生細(xì)菌對不同鹽濃度脅迫下小麥幼苗生長的影響,以期為提高小麥耐鹽性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥品種：周麥18(周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院殷貴鴻博士饋贈)；根瘤內(nèi)生細(xì)菌252和254分離自課題組(U1204301)在2012年7—8月采集自河南省周口市西華縣址坊鎮(zhèn)吳店村大豆根瘤樣品,對獲得的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化、篩選、鏡檢,斜面短期保藏于4℃冰箱。

1.2 內(nèi)生菌的活化和菌懸液制備

將菌株252和254接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基[23]斜面上,置于30℃恒溫培養(yǎng)3d。將內(nèi)生菌接種在LB液體培養(yǎng)基,置于130 r/min 30℃震蕩培養(yǎng)3 d,10000 r/min離心10 min,收集菌體并使用無菌水稀釋制成菌懸液,調(diào)整OD600值≈1,4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用CTAB法提取內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA,以此為模板進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增[24],所用引物、擴(kuò)增體系、反應(yīng)條件見文獻(xiàn)[17],擴(kuò)增產(chǎn)物送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序,根據(jù)測序結(jié)果,獲得序列提交GenBank。使用ClustalX 1.81軟件進(jìn)行序列比對,采用Bioedit 4.8.4軟件進(jìn)行手工糾正,使用TRENCONW軟件以Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,用Bootstrap重復(fù)1000次進(jìn)行可信度評估,用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列相似性分析。

1.4 小麥種子處理和接種培養(yǎng)

試驗(yàn)于2013年7月—2015年8月在實(shí)驗(yàn)室及人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。挑選籽粒飽滿、完整有胚、無霉變的種子,用無水乙醇浸泡15—20 s,置入3%—5%NaClO溶液消毒3—5 min,再用無菌水沖洗5—8次。用無菌水、252和254菌懸液分別浸泡小麥種子,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待小麥種子露白后播于裝有滅菌蛭石的花盆中,每盆60粒,置于人工氣候箱中(白天28℃14 h,晚上22℃10 h)培養(yǎng)。試驗(yàn)共設(shè)置6個處理,3個重復(fù),依據(jù)前期試驗(yàn)[22],鹽脅迫濃度設(shè)置為0、50、100、150、200、250 mmol/L。第1天,CK中加30 mL無菌水,鹽脅迫組、菌懸液組各加30 mL鹽溶液；第2天,CK、鹽脅迫組各加30 mL無菌水,菌懸液組接30 mL菌懸液；第3天,CK、鹽脅迫組、菌懸液組分別加30 mL無菌水,以此3d為一個循環(huán)。

1.5 小麥脯氨酸含量測定

采用磺基水楊酸比色法[25]。待小麥幼苗長至第7、14、21天分別剪取小麥葉片,加入3%磺基水楊酸提取,水浴10 min,以3000 r/min離心10 min。每個試管中加入上清,對照用蒸餾水代替,再向試管中加入3%磺基水楊酸、冰醋酸和2.5%酸性茚三酮,水浴顯色1 h,加入甲苯漩渦震蕩,提取上清液中Pro,靜置分層取甲苯相,測定OD520值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算Pro含量。

1.6 丙二醛含量測定

采用硫代巴比妥酸比色法[25]。待小麥幼苗長至第7、14、21天分別采樣,稱取小麥葉片,加入石英砂和10%三氯乙酸磨成勻漿狀,加入三氯乙酸充分研磨,4000 r/min離心10 min,上清液為樣品提取液。取出提取液放于試管中,對照用蒸餾水代替,加入0.6% TBA溶液混合均勻,水浴15 min,冷卻后分別測定532 nm和450 nm波長下OD值,計算出MDA含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19. 0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用雙因素隨機(jī)方差分析(two-way ANOVA)和最小顯著差數(shù)法(LSD)分析不同鹽濃度下接種內(nèi)生細(xì)菌對Pro、MDA含量的影響,顯著性水平設(shè)定為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育地位

2株菌16S rDNA 序列片段大小均為1500 bp,獲得序列號分別為KJ499776和KJ499777。在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索相似性高的模式株和參比菌株,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)和進(jìn)行序列相似性分析。系統(tǒng)發(fā)育樹整體分為兩個主分支和一個邊緣支(EscherichiacoliU5/41T)。主分支分別為Bacillus和Agrobacterium,菌株252和模式菌株形成了分支I,其中菌株252與BacillusvallismortisDSM11031T(AB021198)位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支,兩者具有最大相似率,達(dá)99.6%。菌株254和模式菌株形成了分支II,其中菌株254和模式菌株AgrobacteriumtumefaciensIAM 12048T(AB247615)位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支II,兩者具有最大相似率,為99.7%。因此,菌株252最相似菌株為死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis),菌株254最相似菌株為根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。

圖1 基于內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.1 Phylogenetic tree generated by the neighbor-joining method based on their 16S rDNA sequences of endophytic bacteria括號中的數(shù)值表示在GenBank中的序列號,自舉值(1000次重復(fù))大于50%的在分支上顯示,被測試菌株用黑體標(biāo)出,標(biāo)尺表示0.05%的核苷酸替換

2.2 內(nèi)生細(xì)菌252、254對小麥幼苗脯氨酸含量的影響

由圖2可知,小麥生長7 d時,鹽脅迫環(huán)境下,除鹽濃度150 mmol/L和250 mmol/L時鹽脅迫處理組Pro含量分別略低于對照組2.42%和4.14%以外,總體均高于對照組。在鹽濃度200 mmol/L時,小麥幼苗體內(nèi)Pro含量達(dá)到最高值,為44.04 μg/g,顯著高于對照組33.67%。由此顯示,鹽脅迫處理下,NaCl對小麥幼苗具有一定抑制能力。經(jīng)內(nèi)生細(xì)菌252接菌處理后,該組Pro含量除在200 mmol/L鹽濃度外均高于對照組,其中在鹽濃度為100 mmol/L時,252接菌處理組Pro含量達(dá)到最高值,為40.37 μg/g,顯著高于對照組22.53%,高于鹽脅迫組19.14%。鹽濃度為150 mmol/L時,252接菌處理組與鹽脅迫組相比,Pro含量有最大程度升高,為39.12 μg/g,高于對照組18.73%,高于鹽脅迫組21.68%。當(dāng)鹽濃度升至200 mmol/L時,252接菌處理組Pro含量為39.57 μg/g,高于對照組20.12%,但低于鹽脅迫組10.14%,此濃度下鹽脅迫組Pro含量僅次于最高值；在鹽濃度250 mmol/L時Pro含量最低,為33.71 μg/g,比對照組高2.33%,比鹽脅迫組高6.75%?？傮w趨勢表明,除鹽濃度200 mmol/L 時Pro含量低于鹽脅迫組外,252接菌處理組同一鹽濃度下Pro含量均高于對照組,其他情況下均明顯高于鹽脅迫組,說明大豆根瘤內(nèi)生細(xì)菌252對鹽脅迫小麥在一定程度上(鹽濃度50、100、150、250 mmol/L)具有修復(fù)作用。

圖2 接種內(nèi)生細(xì)菌252、254小麥生長7d時植株脯氨酸含量Fig.2 Proline content of wheat seedings inoculated with endophytic bacterium 252,254 in the 7th day圖中星號**表示顯著差異,*表示存在差異

鹽脅迫處理下,當(dāng)鹽濃度為200 mmol/L時,Pro含量為44.04 μg/g,顯著高于其他鹽脅迫組。在250 mmol/L時,鹽脅迫組Pro含量最低,為31.58 μg/g,較200 mmol/L鹽濃度下有大幅度下降。經(jīng)內(nèi)生細(xì)菌254處理后,在鹽濃度50 mmol/L時,接菌254處理組對鹽脅迫小麥修復(fù)作用最明顯,Pro含量達(dá)到最高值,為38.72 μg/g,高于對照組17.53%,高于鹽脅迫組16.32%。隨著鹽濃度升高,接種菌株254處理組與對照組相比,修復(fù)程度呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)鹽濃度升至250 mmol/L時,接菌處理組Pro含量最低,為34.25 μg/g,僅高于對照組3.9713%,高于鹽脅迫組8.47%。當(dāng)鹽脅迫組在200 mmol/L鹽濃度時Pro含量達(dá)到最高值情況下,接種菌株254處理組Pro含量明顯低于鹽脅迫組21.06%,說明此濃度下內(nèi)生細(xì)菌254對鹽脅迫小麥不具有修復(fù)作用。結(jié)果表明,在小麥幼苗生長第7天,內(nèi)生細(xì)菌在一定鹽濃度下(鹽濃度50、100、150、250 mmol/L)對鹽脅迫小麥具有明顯修復(fù)作用。

由圖3可知,生長14 d時,對照組Pro含量為70.86 μg/g,較7 d 時Pro含量(39.72 μg/g)有明顯升高。鹽脅迫組Pro含量除鹽濃度為150 mmol/L時外總體均低于對照組,與7 d時情況相反。鹽濃度為150 mmol/L時,鹽脅迫組Pro含量升至最高,為119.50 μg/g,高于對照組83.63%。經(jīng)接種內(nèi)生菌252處理后,Pro含量均高于對照組,除鹽濃度在150 mmol/L下Pro含量稍低于鹽脅迫組6.55%外,其余鹽濃度下接菌252處理組與鹽脅迫組相比較,Pro含量均顯著升高(P<0.05)。在鹽濃度100 mmol/L時,接菌252處理組Pro含量最低,為99.73 μg/g,高于對照組90.23%,高于鹽脅迫組73.46%。當(dāng)鹽濃度達(dá)到200 mmol/L時,252接菌處理組Pro含量高達(dá)140.54 μg/g,高于對照組98.33%,高于鹽脅迫組133.48%。隨著培養(yǎng)時間延長,對照組、鹽脅迫組、252接菌處理組Pro含量均呈現(xiàn)上升趨勢,且接菌252處理組在鹽濃度200 mmol/L時明顯高于鹽脅迫組。結(jié)果表明,內(nèi)生細(xì)菌252在一定鹽濃度下(鹽濃度50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、250 mmol/L)對鹽脅迫小麥具有顯著修復(fù)作用。

圖3 接種內(nèi)生細(xì)菌252、254小麥生長14d時植株脯氨酸含量Fig.3 Proline content of wheat seedings inoculated with endophytic bacterium 252,254 in the 14th day

小麥幼苗生長14 d時,在鹽濃度50、200、250 mmol/L下,接種菌株254處理組Pro含量均高于鹽脅迫組,其中在250 mmol/L時Pro含量最高,為125.61 μg/g,比對照組高77.26%,比鹽脅迫組高91.48%,修復(fù)作用最為顯著。在鹽濃度為50 mml/L和200 mmol/L時,接種254處理組Pro含量分別高于鹽脅迫組27.43%和29.53%。鹽濃度為100 mmol/L和150 mmol/L時,接種254處理組Pro含量均低于鹽脅迫組。結(jié)果說明內(nèi)生細(xì)菌254只有在特定鹽濃度范圍內(nèi)(鹽濃度50、200、250 mmol/L)對鹽脅迫小麥才具有修復(fù)作用,且在高鹽濃度為250 mmol/L時修復(fù)作用最明顯。

由圖4可知,培養(yǎng)21 d時,對照組Pro含量降至40.57 μg/g,鹽脅迫組Pro含量均高于對照組,隨著培養(yǎng)時間增長,鹽脅迫組和接菌252處理組Pro含量均呈先升后降趨勢,且鹽脅迫組隨鹽濃度升高,Pro含量呈逐漸升高趨勢。鹽濃度為50 mmol/L時,鹽脅迫組Pro含量最低,為43.27 μg/g,高于對照組6.66%。當(dāng)鹽濃度升至250 mmol/L時,鹽脅迫組Pro含量達(dá)到最高值,為113.09 μg/g,高于對照組178.76%。經(jīng)內(nèi)生細(xì)菌252處理后,小麥Pro含量隨鹽濃度升高呈現(xiàn)先升后降趨勢,其中,在200 mmol/L時,接種252處理組Pro含量最高,為99.73 μg/g,比對照組高145.81%,比鹽脅迫組高83.92%。當(dāng)鹽濃度升高至250 mmol/L時,鹽脅迫組Pro含量最高,而252接菌處理組Pro含量降為54.65 μg/g,高于對照組34.70%,低于鹽脅迫組51.68%。結(jié)果表明內(nèi)生菌252能在一定鹽濃度范圍下(鹽濃度100、150、200 mmol/L)對鹽脅迫小麥有不同程度修復(fù)作用。

圖4 接種內(nèi)生細(xì)菌252、254小麥生長21d時植株脯氨酸含量Fig.4 Proline content of wheat seedings inoculated with endophytic bacterium 252, 254 in the 21th day

小麥幼苗培養(yǎng)至21 d時,鹽脅迫組Pro含量隨鹽濃度升高呈上升趨勢,鹽濃度250 mmol/L下,Pro含量較200 mmol/L上升,最高值為113.10 μg/g,高于對照組178.76%。而接菌254處理組在250 mmol/L時Pro含量降至最低,為42.42 μg/g,明顯低于鹽脅迫組64.29%,僅高于對照組4.56%。由此說明在高鹽濃度250 mmol/L下,當(dāng)鹽脅迫組Pro含量達(dá)到最高值時,內(nèi)生菌254修復(fù)作用有限,對鹽脅迫小麥?zhǔn)バ迯?fù)能力。在低鹽環(huán)境50 mmol/L下,接菌254處理組Pro含量最高,為77.26 μg/g,高于對照組90.43%,高于鹽脅迫組78.54%,此濃度下,內(nèi)生菌254對鹽脅迫組小麥修復(fù)作用達(dá)到最佳。隨鹽濃度升高,接種254處理組對鹽脅迫小麥修復(fù)作用總體上呈下降趨勢。結(jié)果表明,內(nèi)生細(xì)菌254在低鹽環(huán)境下(鹽濃度50、100、200 mmol/L)對小麥具有顯著修復(fù)作用,在高鹽環(huán)境下(鹽濃度250 mmol/L),對鹽脅迫小麥生長呈現(xiàn)明顯抑制作用。

2.3 內(nèi)生細(xì)菌252、254對小麥幼苗體內(nèi)丙二醛含量的影響

由圖5可知,培養(yǎng)第7天時,對照組MDA含量為1.12 μmol/L,鹽脅迫組MDA含量均低于對照組,隨鹽濃度升高,MDA含量總體上呈下降趨勢。在鹽濃度為50 mmol/L時,鹽脅迫組MDA含量最高,為0.48 μmol/L,低于對照組56.97%。當(dāng)鹽濃度為250 mmol/L時,鹽脅迫組MDA含量降至最低,為0.39 μmol/L,低于對照組65.20%。由此表明,在鹽脅迫下小麥對于鹽分具有一定程度抵抗能力。經(jīng)內(nèi)生細(xì)菌252處理后,除鹽濃度100 μmol/L和150 μmol/L時,接菌252處理組MDA含量分別略高于鹽脅迫組11.25%和1.90%外,總體上接菌處理組均低于鹽脅迫組MDA水平。在鹽濃度為250 mmol/L時,接菌252處理組較其他鹽濃度下MDA含量達(dá)到最低,為0.27 μmol/L,低于對照組76.01%,低于鹽脅迫組31.05%,修復(fù)作用最為顯著。結(jié)果表明內(nèi)生細(xì)菌252對鹽脅迫下小麥在一定鹽濃度下(鹽濃度50、200、250 mmol/L)具有修復(fù)作用。

圖5 接種內(nèi)生細(xì)菌252、254小麥生長7d時植株丙二醛含量Fig.5 MDA content of wheat seedings inoculated with endophytic bacterium 252, 254 in the 7th day

小麥長至7d,鹽脅迫組MDA含量均低于對照組,接菌254處理組均低于鹽脅迫組。在鹽濃度100 mmol/L時,接菌254處理組MDA含量最高,為0.35 μmol/L,低于對照組68.99%,低于鹽脅迫組18.87%。在鹽濃度為200 mmol/L時,接菌處理組MDA含量最低,為0.27 μmol/L,低于對照組75.66%,低于鹽脅迫組34.35%。隨鹽濃度升高,接菌處理組MDA含量總體保持穩(wěn)定。說明內(nèi)生細(xì)菌254在一定程度上對鹽脅迫小麥具有明顯穩(wěn)定修復(fù)能力。

由圖6可知,生長14 d時,對照組小麥幼苗體內(nèi)MDA含量為0.18 μmol/L,較第7天 MDA含量有較大程度降低。鹽脅迫組MDA含量總體上均高于對照組,在鹽濃度50 mmol/L時,鹽脅迫組MDA含量最高,為1.09 μmol/L,高于對照組513.15%。接種內(nèi)生細(xì)菌252后,在鹽濃度50 mmol/L時,接菌252處理組MDA含量達(dá)到最低,為0.19 μmol/L,明顯低于鹽脅迫組82.52%。鹽濃度為150 mmol/L和200 mmol/L時,接菌252處理組MDA含量分別低于鹽脅迫組8.65%和2.01%。鹽濃度100 mmol/L和250 mmol/L下,接菌處理組MDA含量分別高于鹽脅迫組78.63%和35.75%。說明內(nèi)生細(xì)菌252對鹽脅迫小麥在100 mmol/L和250 mmol/L時具有顯著抑制作用,在鹽濃度50、150、200 mmol/L時具有修復(fù)作用。

圖6 接種內(nèi)生細(xì)菌252、254小麥生長14d時植株丙二醛含量Fig.6 MDA content of wheat seedings inoculated with endophytic bacterium 252, 254 in the 14th day

小麥培養(yǎng)14 d時,接菌254處理組MDA含量均高于對照組。在鹽濃度為50 mmol/L時,接菌254處理組MDA含量最低,為0.19 μmol/L,低于對照組9.02%,低于鹽脅迫組82.22%,修復(fù)作用最明顯。在鹽濃度150 mmol/L時,接菌254處理組MDA含量低于鹽脅迫組25.24%。說明在鹽濃度50 mmol/L和150 mmol/L時,內(nèi)生菌具有明顯修復(fù)作用。在鹽濃度為100 mmol/L、200 mmol/L、250 mmol/L時,接菌254處理組MDA含量均高于鹽脅迫組,其中在鹽濃度200 mmol/L時,接菌處理組MDA含量最高,為0.28 μmol/L,高于對照組56.94%,高于鹽脅迫組30.63%,說明大豆內(nèi)生細(xì)菌在200 mmol/L鹽濃度下對小麥生長具有明顯抑制作用。

由圖7可知,生長21 d時,對照組MDA含量為0.52 μmol/L。隨培養(yǎng)時間延長,對照組MDA總體趨勢為先降后升,與Pro含量變化趨勢相反。隨鹽濃度升高,鹽脅迫組MDA含量均低于對照組,接種菌株252處理組均低于鹽脅迫組。在鹽濃度為50 mmol/L時,接菌252處理組MDA含量最高,為0.25 μmol/L,低于對照組23.57%,低于鹽脅迫組32.25%。在鹽濃度為200 mmol/L時,252接菌處理組MDA含量最低,為0.09 μmol/L,低于對照組82.93%,低于鹽脅迫組81.50%,修復(fù)作用最明顯。結(jié)果表明,內(nèi)生菌252在21d鹽脅迫環(huán)境下培養(yǎng)均具有明顯修復(fù)作用。

圖7 接種內(nèi)生細(xì)菌252、254小麥生長21d時植株丙二醛含量Fig.7 MDA content of wheat seedings inoculated with endophytic bacterium 252, 254 in the 21th day

經(jīng)內(nèi)生細(xì)菌254處理后,接菌處理組MDA含量均低于鹽脅迫組,在鹽濃度為50 mmol/L時,接菌254處理組MDA含量最低為0.08 μmol/L,低于對照組84.46%,低于鹽脅迫組77.47%。在鹽濃度為200 mmol/L時,接菌254處理組MDA含量增至最高,達(dá)0.26 μmol/L,低于對照組50.98%,低于鹽脅迫組46.90%。結(jié)果表明,在小麥培養(yǎng)21 d時,接菌254處理組對鹽脅迫小麥均具有明顯修復(fù)作用,其中在50 mmol/L鹽濃度時修復(fù)作用最顯著。

3 討論

3.1 接種內(nèi)生細(xì)菌對小麥幼苗脯氨酸含量的影響

Pro是一種植物體內(nèi)蛋白質(zhì)組成成分之一,在植物體內(nèi)分布廣泛并以游離狀態(tài)存在。Pro水合能力很強(qiáng),在鹽脅迫等逆境條件下可提高植株耐性和植物細(xì)胞液濃度,能保持滲透平衡,防止細(xì)胞因過度缺水而變形[1,26]；另外,可清除植物體內(nèi)活性氧,在一定程度上保持膜穩(wěn)定性[27]。研究[28-29]表明,Pro含量高低可作為衡量植物抵抗逆境能力強(qiáng)弱的指標(biāo)。因此,小麥體內(nèi)Pro含量高低作為衡量在鹽脅迫環(huán)境下小麥的抗逆性強(qiáng)弱。本試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著小麥培養(yǎng)時間延長,鹽脅迫組小麥體內(nèi)Pro含量呈先升高后下降的趨勢。在前期和中期,小麥在鹽處理環(huán)境下生長,體內(nèi)Pro含量逐漸積累,調(diào)節(jié)小麥細(xì)胞質(zhì)滲透壓,穩(wěn)定了生物大分子的結(jié)構(gòu),從而提高了小麥抗逆性,保證代謝正常進(jìn)行。在后期,小麥逐漸對鹽環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性,體內(nèi)Pro含量較中期有一定程度下降。隨著鹽濃度升高,小麥體內(nèi)Pro含量先升高后下降趨勢,但不同時期有不同適應(yīng)性,說明小麥在不同生長期對鹽脅迫的抵抗能力不同,每個時期小麥對鹽的抵抗能力都有一個閾值,超過小麥體內(nèi)負(fù)荷,小麥的抵抗能力減弱,說明調(diào)節(jié)能力有限。接種內(nèi)生細(xì)菌252和254后,提高了小麥體內(nèi)Pro含量,清除細(xì)胞內(nèi)活性氧,維持細(xì)胞形態(tài),提高小麥抵抗鹽脅迫能力,有利于提高小麥存活率,促進(jìn)了小麥生長。尤其在第14天,內(nèi)生菌252和254分別在鹽濃度為200 mmol/L和250 mmol/L時修復(fù)效果最顯著,分別高于鹽脅迫組133.48%和91.48%。Lastochkina等[30]研究表明,內(nèi)生細(xì)菌Bacillussubtilis10- 4可產(chǎn)生IAA和鐵載體,在2% NaCl鹽脅迫下小麥幼苗Pro含量增加,鹽脅迫下接種內(nèi)生細(xì)菌B.subtilis10- 4,降低誘導(dǎo)產(chǎn)生Pro的積累,該結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。由此表明內(nèi)生菌252和254對鹽脅迫小麥具有明顯修復(fù)作用。

本研究用NaCl模擬鹽脅迫環(huán)境,小麥幼苗Pro含量顯著升高,尤其在生長第21天,鹽脅迫組Pro含量均明顯高于對照組,在鹽濃度250 mmol/L時,鹽脅迫組Pro含量高達(dá)113.10 μg/g,高于對照組178.76%。此結(jié)果與谷艷芳等[1]研究結(jié)論相一致,鹽脅迫導(dǎo)致周麥18 Pro含量升高。呂秀云等[31]通過對藜研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫條件下Pro作為藜苗后期主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),其含量顯著增加,有力支持了本試驗(yàn)結(jié)果。接種內(nèi)生細(xì)菌252和254后,小麥幼苗Pro含量與鹽脅迫組相比有明顯升高,這說明內(nèi)生細(xì)菌處理能夠減緩鹽脅迫對小麥幼苗帶來的傷害,達(dá)到提高小麥抵抗鹽脅迫的能力及促生長作用。對內(nèi)生菌系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果分析表明,菌株252最相似菌株為死谷芽胞桿菌。分離自苦丁茶的內(nèi)生細(xì)菌死谷芽胞桿菌ZZ185,其發(fā)酵液中含有桿菌霉素D(bacillomycin D),對小麥具有抗真菌活性[32]。菌株254最相似菌株為根癌土壤桿菌,攜帶重組質(zhì)粒的根癌土壤桿菌EHA105轉(zhuǎn)入宿主植物[33],在200 mmol/L鹽脅迫下,Pro含量明顯高于非轉(zhuǎn)基因煙草植株,提高了宿主植物耐鹽性。趙龍飛等[34]從大豆根瘤中篩選產(chǎn)生ACC脫氨酶活性的內(nèi)生細(xì)菌,其中菌株DD165、DD132可耐受9% NaCl鹽濃度,接種試驗(yàn)表明內(nèi)生細(xì)菌DD132對小麥幼苗生長具有明顯促生長作用。劉華偉等[35]利用田菁莖瘤固氮根瘤菌“ORS571”與巴西固氮螺菌 “Yu62”浸種侵染小麥,研究聚乙二醇處理滲透脅迫下接菌小麥種子發(fā)芽狀況,結(jié)果表明接種混合固氮菌后在滲透脅迫下小麥種子發(fā)芽率明顯提高,小麥幼苗Pro含量明顯升高,表明接種固氮細(xì)菌可提高小麥幼苗抗?jié)B透脅迫能力。這些研究與本試驗(yàn)結(jié)論基本一致,鹽脅迫使小麥幼苗Pro含量升高,經(jīng)內(nèi)生細(xì)菌252和254處理后,有效緩解鹽脅迫對幼苗造成的傷害,其Pro含量進(jìn)一步積累,對小麥幼苗具有顯著修復(fù)作用。此外,前人[36]用氫氧化細(xì)菌WMQ7浸種鹽脅迫小麥、大多數(shù)內(nèi)生細(xì)菌可產(chǎn)生Pro重要滲透物質(zhì)來提高植物耐鹽性[37],均有力支撐了本試驗(yàn)結(jié)果。在小麥生長前中期,小麥膜質(zhì)過氧化程度不高,生物膜結(jié)構(gòu)還未受到損傷,可能對小麥正常代謝尚未造成嚴(yán)重影響,隨培養(yǎng)時間延長,到生長后期,麥苗逐漸出現(xiàn)枯萎,MDA含量升高,啟動了膜脂過氧化,導(dǎo)致膜損傷和破壞[38]。說明內(nèi)生細(xì)菌252和254能緩解小麥過氧化程度,對鹽脅迫下小麥生長具有顯著修復(fù)能力,且隨培養(yǎng)時間延長,修復(fù)能力越顯著。具體機(jī)制還在進(jìn)一步研究之中。

3.2 接種內(nèi)生細(xì)菌對小麥幼苗丙二醛含量的影響

在小麥幼苗耐鹽性研究中,逆境條件下MDA是膜脂過氧化的終產(chǎn)物[37],能在一定程度上反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性,與植物抗性有重要關(guān)聯(lián)[39]。小麥生長7 d,內(nèi)生菌252處理的小麥在鹽脅迫濃度為50 mmol/L、200 mmol/L、250 mmol/L時體內(nèi)MDA含量均低于鹽脅迫組,接種菌株254處理組在鹽濃度為50—250 mmol/L范圍內(nèi)均表現(xiàn)修復(fù)作用。小麥生長21d,菌株252和254處理組的MDA含量均低于鹽脅迫組,特別是在鹽濃度200 mmol/L時,內(nèi)生細(xì)菌252修復(fù)作用最明顯,MDA含量低于鹽脅迫組81.50%；內(nèi)生細(xì)菌254在鹽濃度為50 mmol/L時修復(fù)作用最顯著,其MDA含量低于鹽脅迫組77.47%。傅蕾等[40]研究表明,在不同鹽濃度脅迫下,內(nèi)生細(xì)菌PP04能夠有效增加雜交狼尾草體內(nèi)SOD、POD、CAT和APX活性,減少膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累,緩解鹽環(huán)境對雜交狼尾草造成的氧化脅迫,增強(qiáng)其耐鹽能力。Lastochkina等[30]研究表明,內(nèi)生細(xì)菌Bacillussubtilis10- 4能夠產(chǎn)生IAA和鐵載體,在2% NaCl鹽脅迫下對小麥生長有保護(hù)作用,鹽脅迫下小麥幼苗MDA含量增加,鹽脅迫下接種內(nèi)生細(xì)菌B.subtilis10- 4降低因脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的MDA,對小麥幼苗生長具有修復(fù)作用。這些結(jié)果與本結(jié)論基本一致。Mayak等[41]研究推測其機(jī)制是在一定鹽脅迫下,接種內(nèi)生細(xì)菌可促進(jìn)植物對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收,改變植物體內(nèi)離子平衡,增加植物對水分的吸收和利用能力,從而增強(qiáng)幼苗生長各項(xiàng)指標(biāo)導(dǎo)致內(nèi)生菌緩解鹽脅迫能力受限。而本研究僅從內(nèi)生細(xì)菌252和254對鹽脅迫小麥在鹽濃度為50—250 mmol/L范圍內(nèi)通過測定Pro和MDA含量進(jìn)行了探索,至于鹽脅迫下內(nèi)生菌對小麥耐鹽性的其他生理指標(biāo)影響有待于進(jìn)一步研究。

作物鹽害導(dǎo)致農(nóng)田土壤生物多樣性和土壤肥效降低,嚴(yán)重影響作物的生長和代謝,具有抗鹽潛能的生防微生物菌種有利于這一問題的解決[42]。與植物相關(guān)的多樣化菌群,在植物生長和健康方面發(fā)揮著重要作用,進(jìn)化基因促使其適應(yīng)宿主植物,來自擬南芥、楊樹、玉米作物根部細(xì)菌的基因組測序表明,與非植物根部相關(guān)細(xì)菌相比,其基因組編碼較多的碳水化合物進(jìn)行代謝,有利于在宿主植物內(nèi)的定殖進(jìn)化,也有助于植物相關(guān)微生物間的競爭[43]。幼苗時期是小麥生長的關(guān)鍵時期,如果該時期遭遇鹽環(huán)境侵害,造成小麥體內(nèi)水分缺失,嚴(yán)重危害小麥生長發(fā)育。本研究利用內(nèi)生細(xì)菌接種鹽脅迫下小麥幼苗,在一定程度上緩解鹽脅迫對小麥的危害。Yoolong等[44]研究結(jié)果支持了本結(jié)果,ACC脫氨酶產(chǎn)生菌株StreptomycesvenezuelaeATCC 10712在鹽脅迫條件下接種泰國香稻,通過增加Pro,減少乙烯、活性氧族和鈉離子含量,增加了水稻的耐鹽性。韓坤等[45]研究表明外源根瘤菌的固氮作用能夠改善小麥生長,有力支持了根瘤內(nèi)生菌調(diào)節(jié)其他植物生長并提高產(chǎn)量的可能性。此外,前人還對花生[46]、苜蓿[47]、黃瓜[48]、玉米[49]、番茄[50]等研究,內(nèi)生細(xì)菌作為植物生長修復(fù)劑不僅能修復(fù)鹽害,還能提高作物抗病和分解重金屬能力,為實(shí)現(xiàn)鹽脅迫下修復(fù)幼苗植株生長研究打下基礎(chǔ)。