唐嘯，羅瑩，徐曉艷

1.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院影像科，湖北武漢 430064；2.武漢科技大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，湖北武漢 430071；*通訊作者 徐曉艷 xuxiaoy35@163.com

隨著人們生活水平的提高和老年人口的增加，急性期缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）已成為威脅人類生命健康的主要疾病。AIS的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，病因包括血管損傷、抗凝蛋白含量與活性改變、纖維蛋白溶解系統(tǒng)活性減低、凝血因子升高、血液成分改變、血小板活化等，并以血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷為主[1-3]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloprotease，MMP）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解與破壞，致使血管損傷[4-5]。MMP-9是MMP家族的成員，與缺血性腦損傷關(guān)系密切。粥樣硬化斑塊中MMPs表達(dá)增多，纖維成分大量降解，易誘發(fā)AIS的發(fā)生[6-7]。特別對(duì)于腦卒中患者，MMP-9表達(dá)高于其他MMPs類型。目前臨床多采用頸部血管B超、多層螺旋CT對(duì)AIS患者進(jìn)行分型，但均存在一定的缺陷[8-9]。MRI和近紅外熒光成像（near-infrared fluorescence imaging，NIRF）利用分子影像探針，可在活體無(wú)創(chuàng)地評(píng)價(jià)缺血性卒中的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊特征[10]；特別是NIRF使非侵入性觀察活體內(nèi)基因蛋白表達(dá)和各種細(xì)胞活動(dòng)成為可能，檢測(cè)靈敏性高；且NIRF采用的探針均針對(duì)具體分子靶設(shè)計(jì)，具有較強(qiáng)的特異性[11-12]。目前MRI/NIRF雙功能顯像廣泛應(yīng)用于體外細(xì)胞研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段[13]；但對(duì)于AIS的應(yīng)用鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)動(dòng)物模型研究 AIS后MMP-9活性的MRI/NIRF雙功能顯像特征及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 DAPI為上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；非特異性IgG抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothioeyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記抗MMP-9抗體、兔抗小鼠MMP-9多克隆抗體由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供；NIR 797異硫氰酸酯、大鼠抗小鼠β-actin 單抗（1∶2000）均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。所有小鼠均喂養(yǎng)于溫度、濕度、光照控制的SPF級(jí)動(dòng)物中心。ApoE 基因敲除小鼠（ApoE-/-小鼠）購(gòu)于醫(yī)科院基礎(chǔ)所動(dòng)物中心，雄性，14周齡。本實(shí)驗(yàn)得到實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AIS 動(dòng)物模型的建立與分組 15只ApoE-/-小鼠按高脂飲食（0.5%膽酸鈉、10%脂肪、2%膽固醇）喂養(yǎng)20周，建立缺血性卒中動(dòng)物模型。隨機(jī)選取5只ApoE-/-小鼠按體重經(jīng)尾靜脈注入抗MMP-9抗體NIR 797 1 mg/kg（實(shí)驗(yàn)組）；隨機(jī)選取5只ApoE-/-小鼠注射非特異性IgG-NIR 797 1 mg/kg（對(duì)照組）；5只ApoE-/-小鼠注射磷酸鹽緩沖液1 mg/kg（空白組）。所有注射劑量均同實(shí)驗(yàn)組。24 h后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠行MRI/NIRF雙功能顯像。

1.2.2 MRI/NIRF雙功能顯像 采用Siemens 1.5T 12通道MR 儀，水平掃描架內(nèi)徑16 cm，使用38 mm 小鼠頭線圈。①抗MMP-9抗體NIR 797合成。取1 mg NIR 797溶于200 μl DMSO；取2 μl抗-oxLDL抗體溶于0.8 ml 磷酸鹽緩沖液，緩慢加入NIR 797-DMSO溶液，混勻后避光保存。②MRI掃描：使用異氟烷-空氣混合氣體麻醉小鼠并維持，MRI掃描采用軸位快速自旋回波T2WI。掃描參數(shù)：TR 4000 ms，TE 34/13 ms，層厚0.5 mm，層間距0，層數(shù)35，視野2.8cm×2.8 cm，矩陣256×256，掃描時(shí)間約45 min。③NIRF 顯像。小鼠注入熒光探針24 h后，使用異氟烷-空氣混合氣體麻醉并維持，NIRF 掃描激發(fā)波長(zhǎng)790 nm，曝光時(shí)間為500～5000 ins。④圖像處理：頸動(dòng)脈斑塊NIRF SI斑塊由成像系統(tǒng)自帶的Maestro 3.0軟件測(cè)量，取平均值，根據(jù)公式（1）計(jì)算信噪比（SNR）。采用MRI后處理工作站的Paravision 5.0軟件勾畫出匹配MRI圖像的感興趣區(qū)（ROI），測(cè)量注入熒光探針前后相同層面血管斑塊信號(hào)強(qiáng)度（SI）改變區(qū)的SI（SI斑塊），并與相鄰肌肉SI（SI肌肉）比較，計(jì)算相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度（rSI）。

1.3 病理檢查 MRI/NIRF雙功能顯像完畢后處死小鼠，暴露頸動(dòng)脈，縱向切開后將頸動(dòng)脈以最佳切片溫度包埋劑包埋，冰凍切片機(jī)橫斷面連續(xù)切片，厚度約2 μm，行常規(guī)普魯士藍(lán)與HE染色。測(cè)定并記錄頸動(dòng)脈NIRF的陽(yáng)性面積與頸動(dòng)脈總面積。同時(shí)用FITC標(biāo)記的抗MMP-9抗體檢測(cè)斑塊內(nèi)MMP-9分布，染色步驟按試劑說(shuō)明書進(jìn)行，細(xì)胞核采用DAPI 染色，使用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 MMP-9活性檢測(cè) 取處死小鼠的腦組織，加入500 μl裂解液，充分勻漿。以12 000×g離心15 min，離心溫度4℃。收集上清液，采用Bradford 法定量蛋白后，使用Western blot 檢測(cè)MMP-9與GAPDH的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法。頸動(dòng)脈NIRF 陽(yáng)性面積與脂肪陽(yáng)性面積的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-9活性 所有小鼠在AIS模型建立2 h時(shí)即可檢測(cè)到MMP-9表達(dá)；模型建立24 h時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰（圖1）。

圖1 缺血性腦卒中不同時(shí)間點(diǎn)MMP-9活性

2.2 NIRF顯像特征 所有小鼠注入熒光探針后均存活良好。其中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組注射24 h后顱腦見強(qiáng)熒光信號(hào)，而腹部未見明顯熒光信號(hào)；空白組顱腦與腹部均未見明顯熒光信號(hào)；實(shí)驗(yàn)組頸動(dòng)脈NIRF 示強(qiáng)熒光信號(hào)主要聚集于斑塊好發(fā)部位。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組與空白組SNR分別為456.39±24.19、19.48±2.19和4.19±0.89，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=144.013，P<0.05）。

2.3 病理染色與免疫熒光狀況 實(shí)驗(yàn)組小鼠頸動(dòng)脈NIRF的陽(yáng)性面積占頸動(dòng)脈總面積的（39.23±4.22）%，脂肪陽(yáng)性面積占（41.43±5.43）%，兩者呈線性相關(guān)（r=0.738，P<0.05）。頸動(dòng)脈切片免疫熒光染色顯示斑塊內(nèi)MMP-9的表達(dá)與巨噬細(xì)胞的分布一致，熒光信號(hào)主要聚集于斑塊纖維帽（圖2A）。HE染色證實(shí)頸動(dòng)脈粥樣斑塊形成（圖2B）。對(duì)照組與空白組NIRF均未見明顯熒光信號(hào)，但存在典型的動(dòng)脈粥樣斑塊病變（圖2C）。

圖3 缺血性腦卒中病理染色與免疫熒光狀況。頸動(dòng)脈切片免疫熒光染色顯示斑塊內(nèi)MMP-9的表達(dá)與巨噬細(xì)胞的分布一致，熒光信號(hào)主要聚集于斑塊纖維帽（A）；HE染色證實(shí)頸動(dòng)脈粥樣斑塊形成（B）；未見明顯熒光信號(hào)，但存在典型的動(dòng)脈粥樣斑塊病變（C）

3 討論

AIS主要由頸動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊引起，血管內(nèi)超聲成像、血管造影、CT 等對(duì)缺血性腦卒中均具有一定的診斷價(jià)值，可顯示血管壁厚度、血管腔內(nèi)狹窄程度及斑塊性質(zhì)，但無(wú)法有效反映斑塊的生物學(xué)特征及其穩(wěn)定性，導(dǎo)致臨床應(yīng)用受到一定的限制[14-15]。

MMPs是一類對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)具有降解活性的蛋白酶超家族，可降解斑塊的細(xì)胞外基質(zhì)成分而削弱斑塊的強(qiáng)度[16]。MMP-9 屬于Zn2+依賴性內(nèi)源性蛋白水解酶，其作用底物包括纖黏蛋白、層黏蛋白、Ⅳ型明膠。在腦卒中發(fā)病過(guò)程中，缺血-再灌注和氧化應(yīng)激可使MMP-9表達(dá)及活性增加，基底膜降解，從而影響預(yù)后[17-18]。血漿MMP-9水平與腦卒中患者病情呈正相關(guān)，故可以作為動(dòng)脈粥樣硬化及腦卒中病情活躍的標(biāo)志物[19]；特別是MMP-9水平增高，可導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，易脫落形成栓子，是腦卒中發(fā)生及再發(fā)的危險(xiǎn)因素[20]。本研究顯示，所有小鼠在缺血性腦卒中模型建立2 h時(shí)即可檢測(cè)到MMP-9的表達(dá)，模型建立24 h時(shí)達(dá)到高峰。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，MMP-9表達(dá)增加與慢性血-腦屏障損傷關(guān)系最為密切，血漿MMP-9水平升高與腦微出血密切相關(guān)，可導(dǎo)致小血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血-腦屏障受損[21-22]。

隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展和新設(shè)備的不斷涌現(xiàn)，影像學(xué)技術(shù)的創(chuàng)新范圍不斷擴(kuò)大，也為缺血性腦卒中的診斷和治療提供了條件。MRI 具有良好的空間分辨率與重復(fù)性，且無(wú)創(chuàng)、無(wú)輻射，可對(duì)動(dòng)脈粥樣病變的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)和示蹤[19]。在活體內(nèi)，血紅蛋白、脂質(zhì)、水對(duì)光譜范圍為650～900 nm的NIRF 吸收系數(shù)最低，可穿透更深層的組織。Alsaid 等[23]研究顯示，近紅外熒光最大可穿透6 cm的肌肉組織、5 cm的成人腦組織、12 cm的乳腺或肺組織。NIRF的基本原理是以特定波譜范圍的激發(fā)光源照射熒光分子。此時(shí)熒光分子被激發(fā)出不同光譜特性的光子信號(hào)。此信號(hào)通過(guò)濾光片后進(jìn)行采集，并通過(guò)數(shù)據(jù)處理光子信號(hào)轉(zhuǎn)換為圖像。NIRF 具有靈敏度高、實(shí)時(shí)成像、操作簡(jiǎn)便、非侵入性、非電離輻射等優(yōu)點(diǎn)，其光子量探測(cè)閾值低，故檢測(cè)靈敏度高；與生物發(fā)光成像相比，可不必轉(zhuǎn)基因，故操作相對(duì)簡(jiǎn)便[24]。特別是其與各種特異靶向探針的合成可應(yīng)用于不同疾病的實(shí)驗(yàn)性研究，從分子水平為疾病的發(fā)生及發(fā)展提供診治信息[25-27]。MRI和NIRF 利用分子影像探針可在活體無(wú)創(chuàng)地評(píng)價(jià)腦卒中頸動(dòng)脈斑塊特征。MMP-9 在斑塊的發(fā)生、進(jìn)展和易損斑塊的不穩(wěn)定性等方面發(fā)揮重要作用[28-30]。本研究結(jié)果顯示，在注入探針24 h后，NIRF 顯示強(qiáng)熒光信號(hào)聚集于實(shí)驗(yàn)組小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化病變內(nèi)，MMP-9的表達(dá)與NIRF SNR 呈線性相關(guān)，免疫熒光染色證實(shí)斑塊內(nèi)MMP-9的表達(dá)與巨噬細(xì)胞共區(qū)域；且抗MMP-9抗體NIR 797 可在頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊部位特異性聚集，表明該探針可作為小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊MRI/NIRF 顯像的有效工具。

總之，AIS后MMP-9活性的MRI/NIRF雙功能顯像可作為新的頸動(dòng)脈斑塊診斷方法，對(duì)評(píng)估AIS 病情具有重要價(jià)值。本研究的動(dòng)物模型數(shù)目較少，且模型比較單一，一定程度上可能影響結(jié)論的可靠性。本研究未進(jìn)一步動(dòng)態(tài)觀察MRI/NIRF 顯像，這將是下一步深入分析的方向。