王朝霞

摘 要：多管發(fā)酵法和濾膜法是我國(guó)現(xiàn)有的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)分析方法體系中主要的糞大腸菌群檢測(cè)方法。本文通過(guò)使用IDEXX公司提供的32份糞大腸菌群質(zhì)控標(biāo)樣進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)，了解2種方法的吻合度，并通過(guò)分析檢測(cè)過(guò)程中的各種影響因素和方法優(yōu)缺點(diǎn)，以判斷2種方法更適合的水質(zhì)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：多管發(fā)酵法;濾膜法;影響因素;優(yōu)缺點(diǎn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

糞大腸菌群是在44.5℃條件下能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌[1]。糞大腸菌群的監(jiān)測(cè)是相關(guān)環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)保工作的需要。我國(guó)有9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了濃度限值和排放限值。在我國(guó)，多管發(fā)酵法是各級(jí)環(huán)境監(jiān)測(cè)部門(mén)普遍采用的經(jīng)典方法，我國(guó)現(xiàn)有的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)分析方法體系中，糞大腸菌群的主要檢測(cè)方法為多管發(fā)酵法和濾膜法。本研究旨在將2種方法進(jìn)行對(duì)比，了解2種方法的吻合度和優(yōu)缺點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1.1 多管發(fā)酵法[2]

將樣品加入含乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，37℃初發(fā)酵富集培養(yǎng)，大腸菌群在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)生的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變?yōu)辄S色，產(chǎn)生的氣體進(jìn)入倒管中，指示產(chǎn)氣。44.5℃復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的膽鹽3號(hào)可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，最后產(chǎn)氣的細(xì)菌確定為糞大腸菌群。通過(guò)查MPN表，得出糞大腸菌群濃度值。

1.1.2 濾膜法[3]

樣品通過(guò)孔徑為0.45μm的濾膜過(guò)濾，細(xì)菌被截留在濾膜上，然后將濾膜置于MFC選擇性培養(yǎng)基上，在特定的溫度（44.5℃）下培養(yǎng)24h，膽鹽3號(hào)可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，糞大腸菌群能生長(zhǎng)并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使指示劑變色，通過(guò)顏色判斷是否產(chǎn)酸，并通過(guò)呈藍(lán)色或藍(lán)綠色菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定樣品中糞大腸菌群濃度。

1.2 水樣的采集

距水面約10～15cm處采樣，采集樣品盛裝于滅菌的采樣瓶中。

1.3 試劑

1.3.1 多管發(fā)酵法

單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、3倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基。

1.3.2 濾膜法

MFC培養(yǎng)基。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 多管發(fā)酵法

根據(jù)水樣污染程度，確定水樣接種量。將水樣接種到乳糖蛋白胨試管中，在37±0.5℃下培養(yǎng)24±2h進(jìn)行初發(fā)酵。輕微振蕩在初發(fā)酵試驗(yàn)中產(chǎn)酸產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸未產(chǎn)氣的試管，用火焰灼燒滅菌冷卻后的接種環(huán)，將培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)接到裝有EC培養(yǎng)基的試管中，在44.5±0.5℃下培養(yǎng)24±2h。培養(yǎng)后立即觀察，導(dǎo)管中產(chǎn)氣證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性管數(shù)查MPN表?yè)Q算樣品中糞大腸菌群數(shù)。

1.4.2 濾膜法

先估計(jì)出適合在濾膜上計(jì)數(shù)所使用的體積，然后再取這個(gè)體積的1/10和10倍，分別過(guò)濾。根據(jù)樣品的種類(lèi)判斷接種量，最小過(guò)濾體積為10mL，若接種量<10mL時(shí)應(yīng)逐級(jí)稀釋。將樣品充分混勻后抽濾，以無(wú)菌水沖洗器壁2～3次。用滅菌鑷子夾取濾膜移放在MFC培養(yǎng)基上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，將培養(yǎng)皿倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，44.5±0.5℃培養(yǎng)24±2h。計(jì)數(shù)陽(yáng)性菌落。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 水樣檢測(cè)結(jié)果

使用IDEXX公司提供的糞大腸菌群質(zhì)控標(biāo)樣，對(duì)濾膜法和多管發(fā)酵法進(jìn)行方法質(zhì)控，檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，濾膜法和多管發(fā)酵法的檢測(cè)結(jié)果均在質(zhì)量控制可信度區(qū)間內(nèi)。但濾膜法測(cè)定的結(jié)果要略低于多管發(fā)酵法測(cè)定的結(jié)果。

2.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程的影響因素

濾膜法受濾膜孔徑的影響，不能檢測(cè)濁度大、非大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌密度大的水樣。對(duì)于濁度大或污染嚴(yán)重的樣品，需先稀釋后再抽濾，但稀釋度越大，誤差越大[4];濾膜法每輪抽濾結(jié)束后，要對(duì)抽濾設(shè)備充分滅菌，否則會(huì)影響后面樣品的檢測(cè)結(jié)果。

多管發(fā)酵法初發(fā)酵時(shí)，因單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中的接種量?jī)H為1mL，在樣品濃度比較低的情況下，易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果不明顯的發(fā)酵管，需認(rèn)真觀察，將疑似陽(yáng)性的初發(fā)酵管也轉(zhuǎn)接進(jìn)行復(fù)發(fā)酵;多管發(fā)酵法培養(yǎng)基分裝滅菌時(shí)，發(fā)酵管內(nèi)倒管中的氣泡一定要排盡，否則會(huì)在發(fā)酵結(jié)束后的判定時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;多管發(fā)酵法吸取不同濃度的稀釋液時(shí)，每次必須更換移液管，否則會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

2.3 方法的優(yōu)缺點(diǎn)

多管發(fā)酵法是糞大腸菌群檢測(cè)的經(jīng)典方法，可用于檢測(cè)各種水樣，其它方法的研究都是與多管發(fā)酵法進(jìn)行準(zhǔn)確度和可靠性的比較，但其操作步驟繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)基保存時(shí)間短，工作量大，干擾因素多，需要消耗大量的人力和物力的缺點(diǎn)，已經(jīng)不能滿(mǎn)足當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的檢測(cè)需求。

濾膜法可檢測(cè)體積較大的水樣，操作簡(jiǎn)單，一次到位，避免操作過(guò)程中的二次污染，但稀釋度越大，誤差越大。受孔徑影響，不能檢測(cè)濁度大、非大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌密度大的水樣。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用IDEXX公司提供的32份糞大腸菌群質(zhì)控標(biāo)樣，分別用濾膜法和多管發(fā)酵法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均在質(zhì)量控制可信度區(qū)間內(nèi)，濾膜法測(cè)定的結(jié)果要略低于多管發(fā)酵法測(cè)定的結(jié)果。濾膜法操作簡(jiǎn)單，一次到位，適合于比較清潔的水質(zhì);而多管發(fā)酵法可適用于各種水質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

[1]?張少峰，劉國(guó)強(qiáng)，魏春雷.糞大腸菌群檢測(cè)方法及研究進(jìn)展[J].海洋通報(bào)，2008（03）：102-106.

[2]HJ347.2-2018，水質(zhì) 糞大腸菌群的測(cè)定 多管發(fā)酵法[S].

[3]HJ 347.1-2018，水質(zhì) 糞大腸菌群的測(cè)定 濾膜法[S].

[4]戴巧容，劉育，李燕.多管發(fā)酵法與濾膜法測(cè)定水中糞大腸菌群的探討[J].科技創(chuàng)業(yè)家， 2012（13）：213.

（責(zé)任編輯 周康）