向曉雪，周瀟瀟，肖金鵬，李敏，李俐睿，岳建國*

（1.四川省邛崍市種子管理站，四川 邛崍 611530；2.四川省成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

目前，成都市的種禽場共有9個(gè)，為了解本市種禽場2019 年前三個(gè)季度禽流感疫苗的免疫效果，成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心選取了成都市4 個(gè)區(qū)（縣）的4 個(gè)不同規(guī)模的種禽場，采集禽血清樣品進(jìn)行免疫抗體檢測，以對禽流感疫苗的免疫保護(hù)力進(jìn)行科學(xué)評估。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 根據(jù)種禽場規(guī)模和地理位置，筆者對成都市的4 個(gè)種禽場進(jìn)行采樣。其中，金堂種雞場：約3萬羽；崇州種雞場：約10.6萬羽；彭州種雞場：約20 萬羽；大邑種鴨場：約20 萬羽。采樣量均為每場30份/月，連續(xù)采樣3個(gè)季度。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 主要儀器 96孔110°V型血凝板，Eppendorf Xplorer移液器，振蕩器。

1.2.2 主要試劑 H5N1Re-8 抗原（批號：2018005）、H7N9 抗原（批號：2018001），H7 亞型陽性血清（批號：2018001）、H5 亞型陽性血清（批號：2018001），均購于哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；PBS液，購自Biosharp公司；EDTA真空采血管；1%雞紅細(xì)胞懸液。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 1%雞紅細(xì)胞懸液配制 取3支EDTA真空采血管，選擇3只SPF公雞各采血2 mL，轉(zhuǎn)移至裝有PBS液的離心管中混勻。將離心管2 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入PBS 液，再重復(fù)洗滌2次，最后一次用移液器移去上清液和紅細(xì)胞上層的薄膜。吸取1 mL 雞紅細(xì)胞移至裝有99 mL PBS液的錐形瓶中，混勻制成1%紅細(xì)胞懸液，4 ℃保存。

1.3.2 血凝（HA）試驗(yàn) 嚴(yán)格按照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936-2003）操作步驟進(jìn)行。

結(jié)果判定：將血凝板傾斜45°，觀察紅細(xì)胞的淚滴狀流淌情況。完全血凝的抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位（HAU）。取3次血凝結(jié)果的平均值作為抗原效價(jià)。

1.3.3 血凝抑制（HI）試驗(yàn) 嚴(yán)格按照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936-2003）操作步驟進(jìn)行。

根據(jù)1.3.2 血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU 抗原。如血凝效價(jià)為9log2，則4HAU為7log2，即4HAU抗原的稀釋倍數(shù)為1∶27。

結(jié)果判定：以完全抑制4HAU 抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。試驗(yàn)結(jié)果成立條件：陰性對照血清滴度≤2log2，陽性對照血清誤差在1個(gè)滴度范圍內(nèi)。HI價(jià)≤3log2判定HI試驗(yàn)為合格；HI價(jià)≥4log2判為陽性。

2 結(jié)果

將各場測得的每個(gè)季度中各月的抗體水平檢測結(jié)果（取平均值）繪制成圖表（圖1～圖4）。

圖1 金堂種雞場2019年1～3季度H7N9和H5N1Re-8抗體水平及其變化

圖2 崇州種雞場2019年1～3季度H7N9和H5N1Re-8抗體水平及其變化

圖3 彭州種雞場2019年1～3季度H7N9和H5N1Re-8抗體水平及其變化

圖4 大邑種鴨場2019年1～3季度H7N9和H5N1Re-8抗體水平及其變化

由圖1可知，金堂種雞場2019年一、二、三季度的H7N9 抗體水平和H5N1Re-8 抗體水平均為100%（90/90、90/90、90/90 和90/90、90/90、90/90）?？梢娫搱龅膬煞N抗體水平比較穩(wěn)定，抗體免疫保護(hù)效果良好。

而崇州種雞場2019年一、二、三季度的H7N9抗體水平由100%（90/90）小幅降至98.89%（89/90），再小幅降至97.41%（85/90），總體免疫水平仍然較高。H5N1Re-8 抗體水平由96.67%（87/90）先降至92.22%（83/90）再升至100%（90/90），可見H5N1Re-8抗體免疫保護(hù)效果仍較好（見圖2）。

同樣，由圖3 可知，彭州種雞場2019 年一、二、三季度的H7N9抗體水平由91.11%（82/90）上升至100%（90/90）并保持穩(wěn)定，其保護(hù)效果有所提高；H5N1Re-8 抗體水平穩(wěn)定保持在100%（90/90），可見其抗體免疫保護(hù)效果良好。

對于大邑種鴨場，2019 年一、二、三季度的H7N9 抗體水平穩(wěn)定保持在100%（90/90）；H5N1Re-8 抗體水平卻由95.56%（86/90）大幅下降至60%（54/90），乃至58.89%（53/90），表明其抗體免疫保護(hù)效果較差（見圖4）。

3 討論

3.1 禽流感疫苗免疫的必要性 禽流感是一種病毒性傳染病，禽致病后的主要臨床癥狀為頭部腫脹、頭頸震顫、呼吸困難和角弓反張［1］。從2003年由東南亞傳播到中國的H5亞型高致病性禽流感［2］，到2017 年高致病性H7N9 疫情暴發(fā)［3］，禽流感已給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。為有效控制疫情，我國緊急啟用了包含H5N1Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株兩個(gè)疫苗株的重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗。由于禽流感亞型極多，且各亞型間的保護(hù)效果極低，因此，及時(shí)根據(jù)實(shí)際情況更新?lián)Q代禽流感疫苗，對禽流感預(yù)防具有重要意義。

3.2 全國及四川禽流感疫苗的免疫抗體水平 關(guān)于全國禽流感免疫抗體水平，根據(jù)獸醫(yī)公報(bào)公布的數(shù)據(jù)［4-10］，2019 年全國前三季度雞、鴨的H5 亞型抗體平均免疫合格率分別為雞：94.46%、93.87%、93.91%；鴨：91.82%、91.43%、87.01%。全國前三季度雞、鴨的H7N9 抗體平均免疫合格率為雞：94.36%、94.9%、95.49%；鴨：90.37%、92.77、90.9%。由此可見，全國范圍內(nèi)雞、鴨的H5及H7N9 的免疫效果良好，且雞的免疫合格率均高于同季度鴨的免疫合格率。

相較于全國禽流感免疫抗體平均水平，四川省同期雞、鴨的H5 及H7N9 免疫效果均較好，每個(gè)季度抗體平均免疫合格率均高于90%。其中H5亞型抗體平均免疫合格率在90%～97%之間，H7N9 抗體平均免疫合格率在91%～97%之間。雞的免疫合格率均高于同季度鴨的免疫合格率，與全國檢測結(jié)果一致。

3.3 本次檢測情況分析與建議 本次檢測的四個(gè)種禽場的禽血清抗體水平普遍較好。其中種雞場H5N1Re-8 和H7N9 的免疫抗體合格率在小范圍內(nèi)波動(dòng)，但均高于90%。金堂種雞場雖規(guī)模不如其他三個(gè)禽場大，但免疫程序科學(xué)合理，兩種免疫抗體合格率均穩(wěn)定在100%，疫苗免疫保護(hù)力良好。崇州種雞場H5N1Re-8免疫抗體合格率先降低后上升，而H7N9 免疫抗體合格率逐漸下降，應(yīng)注意及時(shí)補(bǔ)免。彭州種雞場H5N1Re-8免疫抗體合格率穩(wěn)定在100%，H7N9免疫抗體合格率第一季度為91%，由于及時(shí)補(bǔ)免，抗體水平又穩(wěn)定在100%。大邑種鴨場H7N9 免疫抗體合格率一直穩(wěn)定在100%，但H5N1Re-8免疫抗體合格率在第二季度出現(xiàn)大幅下降，第三季度繼續(xù)小幅下降，對其鴨血清使用新毒株檢測試劑檢測，結(jié)果顯示H5N1Re-11 株和Re-12 株的免疫抗體合格率均為100%，因此免疫抗體水平下降是疫苗免疫毒株由H5N1Re-11 株和Re-12 株更替為H5N1Re-8 株所致。從四個(gè)種禽場的H5N1Re-8和H7N9 免疫抗體合格率可以看出，二價(jià)疫苗（H5+H7）能夠提高對種禽的預(yù)防保護(hù)。因此，種禽場應(yīng)重視禽流感的預(yù)防，制定科學(xué)合理的免疫程序，特別是在出現(xiàn)抗體水平下降時(shí)，需及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)免。

4 小結(jié)

總之，無論是種禽場還是其他禽場，都應(yīng)按照國家免疫計(jì)劃，對禽進(jìn)行科學(xué)合理的免疫，加強(qiáng)血清抗體水平的監(jiān)測，掌控好疫苗的免疫應(yīng)答周期和抗體水平的衰減期，根據(jù)禽場實(shí)際需要，對禽及時(shí)補(bǔ)免；了解國家的禽病免疫政策，及時(shí)更新?lián)Q代禽病疫苗。除此之外，還應(yīng)做好禽場的生物安全工作，進(jìn)出養(yǎng)殖區(qū)域做好消毒工作，將禽病傳染源擋在場外。對于疑似患病禽只，應(yīng)秉承“早、快、嚴(yán)、小”的方針，按照法定程序進(jìn)行處理。