郝曉麗,張 霞,李 磊,何 靜,吉日木圖,2,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古駱駝研究院,內(nèi)蒙古巴丹吉林 737300)

駝乳和牛乳中含有豐富的蛋白質(zhì),如免疫球蛋白、乳鐵蛋白及各種生長因子;也含有人體所必需的氨基酸、多種維生素、礦物質(zhì)。因此,不僅能夠給人體提供高的營養(yǎng)價值,還有調(diào)節(jié)人體代謝、提高機體免疫力和抗感染能力[1]。但是存在對動物乳清的利用率較低的問題,因此為了能夠更大程度地發(fā)揮其作用,研究人員開始對其乳清蛋白進行酶解。目前對牛乳清酶解制備活性多肽的研究頗多,研究人員發(fā)現(xiàn),牛乳乳清蛋白酶解后可得到含有抗氧化能力、抗高血壓和抗菌能力的活性多肽[2-3]。酶解后的乳清蛋白酶解物具有有效增加糖原的儲存[4]、降低肌酸激酶水平[5]、增強細胞存活相關(guān)因子[6]、促進動物骨骼肌的保護[7-8]、增加細胞抵抗力[9],并防止活性氧的積累降低細胞毒性的能力[10]。但是對駝乳乳清蛋白酶解物的研究相對較少,駝乳相比較于牛乳,駝乳清中含有更多的抗菌因子,如溶菌酶、扁桃體和免疫球蛋白等[11]。駱駝乳清含有一些免疫調(diào)節(jié)蛋白,如血清白蛋白、α-LA、乳酸和肽聚糖,這些天然存在的蛋白也是乳清蛋白初級序列的一部分[12],是抗氧化肽的良好來源。迄今為止,針對駝乳蛋白水解物的研究,主要集中于其抗氧化性[13]、降糖[14]、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶ACE抑制性[15]和抗菌活性的作用[12]。

目前,學(xué)者們針對單一動物乳乳清蛋白酶解制備活性多肽的研究較多,并且主要集中于牛乳乳清蛋白的酶解上,Gashaw[16]和Gomez-Ruiz等[17]通過微生物發(fā)酵法制備出具有抗氧化能力的多肽。而Peng等[18]使用Alcalase蛋白酶對乳清蛋白進行酶解以制備高抗氧化活性的多肽,并確定了高抗氧化活性肽段的分子量。沈邑等[19]經(jīng)胰蛋白酶水解牛乳乳清蛋白得到具備較高抗氧化肽。除此之外,溫祿云等[20]將堿性蛋白酶與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶復(fù)合水解乳清蛋白得到水解度高、苦味小的多肽。Moslehishad等[21]研究發(fā)現(xiàn),相比較胰蛋白酶,堿性蛋白酶等，木瓜蛋白酶是純天然的,安全性更高,使用木瓜蛋白酶酶解后的多肽具有較高的抗氧化性。對于駝乳乳清蛋白抗氧化肽的研究相對較少,目前主要研究對象是駝乳乳蛋白及駝乳酪蛋白,而乳清蛋白在乳中占有較大的比重,并且具有較高的營養(yǎng)價值,乳清蛋白中的生物活性因子表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。同時,目前的研究對不同動物乳乳清蛋白酶解制備活性多肽的比較分析的報道較少。因此本文對研究最為廣泛的牛乳和研究相對較少的駝乳乳清蛋白的生物活性肽進行比較研究。

本研究通過采用不同蛋白水解酶分別對駝乳和牛乳乳清蛋白進行酶解,篩選出水解度高的蛋白水解酶進行酶解工藝優(yōu)化試驗,并以DPPH自由基清除率為指標來確定最佳酶解條件,通過抗氧化性、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將駝乳乳清蛋白酶解液與牛乳乳清蛋白酶解液進行比較分析,充分驗證駝乳乳清蛋白酶解液和牛乳乳清蛋白酶解液的抗氧化活性,并將二者進行抗氧化性的對比分析,為進一步研究二者的差異特點奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

駱駝乳、牛乳、木瓜蛋白酶(6000 U/g)、胰蛋白酶(250 U/g)、中性蛋白酶(50000 U/g)、羥自由基清除能力檢測試劑盒、超氧陰離子清除能力檢測試劑盒、彩虹245plus光譜蛋白Marker、SDS-PAGE凝膠預(yù)混液(15%)、蛋白上樣緩沖液 北京索萊寶科技有限公司 北京索萊寶科技有限公司;鄰苯二甲醛(o-Phthalaldehyde,OPA,純度為97%) 天津市光復(fù)精細化工研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-Trinitrophenylhydrazine,DPPH) 美國Sigma公司;無水乙醇 國產(chǎn)分析純。

JC-HH-S26 恒溫水浴鍋 濟南精誠實驗儀器有限公司;5810R高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司;SYNERGY H1酶標儀 BioTek Instruments,Inc;PL303電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;PB-10數(shù)字酸度計 德國賽多利斯公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;Biorad Mini-PROTEAN Tetra Cells伯樂小型垂直電泳槽 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司;自動凝膠成像分析系統(tǒng)GelDoc-It2Endress+Hauser有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 駝乳、牛乳乳清蛋白的提取及純化 將駝乳和牛乳分別經(jīng)離心脫脂(10000 r/min,15 min,4 ℃)后,使用1 mol/L HCl溶液調(diào)整pH至pH4.6進行酪蛋白沉淀,離心(8000 r/min,20 min,4 ℃)后取上清液。將上述乳清移入透析袋(截留分子質(zhì)量為8000～14000 Da),留1/3～1/2的空間,4 ℃條件下透析24 h。每隔1～2 h 更換一次透析液。將上述透析液于-80 ℃冷凍,24 h后于冷凍干燥機(-20 ℃,10 Pa)進行干燥,在壓力小于10 Pa真空冷凍干燥,得到駝乳和牛乳乳清蛋白粉。

1.2.2 駝乳、牛乳乳清蛋白酶解液的制備 將冷凍干燥制成的駝乳和牛乳乳清蛋白凍干粉配制成一定濃度的反應(yīng)底物,水浴加熱(酶適宜溫度)5 min。用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)底物至酶解反應(yīng)適宜的pH后,加入適量蛋白酶,啟動酶解反應(yīng)。待酶解完成后,沸水浴10～15 min將酶滅活,8000 r/min冷凍離心30 min后,-20 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋白酶的篩選 實驗選取木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶進行試驗,將駝乳和牛乳乳清蛋白復(fù)溶為底物濃度3%的溶液,在pH7,溫度為45 ℃,酶與底物比3%的條件下酶解4 h,測定其水解度,篩選出能最大程度水解乳清蛋白的蛋白水解酶進行酶解工藝的優(yōu)化試驗。

1.2.4 單因素實驗 實驗控制酶解溫度50 ℃,酶解pH7.0,酶解時間4 h,酶與底物比3%,底物濃度3%,分別以酶解pH(5、6、7、8、9)、底物濃度(1%、2%、3%、4%、5%)、酶解時間(2、3、4、5、6 h)、酶與底物比(1%、2%、3%、4%、5%)、酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)為影響因素分別對駝乳乳清蛋白粉和牛乳乳清蛋白粉進行單因素實驗,并檢測上述因素對DPPH自由基清除率的影響,以用于抗氧化肽的制備。

1.2.5 響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素實驗選取酶解pH、酶解溫度和底物濃度3個因素,以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理,設(shè)計17個試驗點的響應(yīng)面分析試驗,以確定最佳酶解工藝。響應(yīng)面試驗因素水平見表 1。

表1 響應(yīng)面酶解乳清蛋白試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface enzymatic whey protein test

1.2.6 駝乳、牛乳乳清蛋白水解液水解度的測定 采用鄰苯二甲醛(OPA)法測定蛋白質(zhì)水解度[22]。200 mg SDS,7.62 g四硼酸鈉,160 mg OPA,4 mL乙醇和176 mg DTT定容到200 mL容量瓶中,即為OPA試劑,需避光冷藏。將400 μL絲氨酸溶液(標準溶液)、去離子水(空白溶液)和駝乳多肽溶液(樣品溶液)加入到裝有3 mL OPA試劑的試管中,混合均勻(5 s)后,精確靜置2 min立即讀取340 nm對應(yīng)的吸光值。計算公式為:DH(%)=h/htot×100

式中:DH為蛋白質(zhì)水解度(%);h為被水解的肽鍵數(shù)(meqv/g);htot為蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)(8.2 meqv/g)。

1.2.7 駝乳、牛乳乳清蛋白水解液抗氧化能力的測定

1.2.7.1 對DPPH·清除能力的測定 參照鄧曉陽等[23]的方法,稱取3.9 mg DPPH溶于無水乙醇中,避光條件下定容至100 mL棕色容量瓶中,配制為1×10-4mol/L的DPPH無水乙醇溶液。取2 mL樣品與2 mL濃度為1×10-4mol/L的DPPH無水乙醇溶液混合均勻,室溫條件下,避光反應(yīng)30 min。在517 nm波長處測定反應(yīng)物吸光度值A(chǔ)i。DPPH自由基的清除率公式為:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100

式中:Ai:2 mL樣品加2 mL DPPH乙醇溶液的吸光度值;Aj:2 mL樣品加2 mL蒸餾水的吸光度值;Ao:2 mL DPPH溶液加 2 mL 乙醇溶液的吸光度值。

1.2.7.2 對·OH清除能力的測定 按照試劑盒說明進行加樣,混勻后37 ℃反應(yīng)60 min,10000 r/min離心10 min后用蒸餾水將儀器調(diào)零,立即取200 μL于96孔板中測定OD536吸光值?！H的清除率公式為:

OH自由基清除率(%)=(A測-A對)/(A空-A對)×100

式中:A測:樣品的吸光度值;A對:對照標準品的吸光度值;A空:空白管的吸光度值。

式中:A測:樣品的吸光度值;A對:對照標準品的吸光度值。

1.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 利用SDS-PAGE方法[24]對駝乳和牛乳乳清蛋白以及駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液進行電泳檢測。分別配制15%分離膠、5%濃縮膠,將乳清蛋白粉復(fù)溶為3%的溶液,并將其與蛋白上樣緩沖液按4∶1稀釋后備用。將膠片制好后裝入電泳槽,倒入電極緩沖液后進行上樣。標準蛋白分子Marker和樣品的上樣量均為5 μL,然后開始電泳。將電壓調(diào)至90 V,進入分離膠后調(diào)為120 V,當條帶到達玻璃板底部上方1 cm處即可結(jié)束電泳。將膠片取出后用考馬斯亮藍染色液進行染色,再用脫色液脫色至條帶清晰即可在凝膠成像儀上拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選結(jié)果

如圖1所示,駝乳和牛乳乳清蛋白經(jīng)不同蛋白酶水解后其水解度各不相同,駝乳乳清蛋白的水解度普遍高于牛乳乳清蛋白,三種酶相比較而言,經(jīng)木瓜蛋白酶水解后水解度顯著高于胰蛋白酶和中性蛋白酶(P<0.05),駝乳乳清蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶水解后的水解度達到15%,顯著高于經(jīng)胰蛋白酶和中性蛋白酶水解后的水解度(P<0.05);而牛乳乳清蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶水解后的水解度為3.7%,顯著高于其他兩種蛋白水解酶水解后的水解度(P<0.05)。因此,選用木瓜蛋白酶對駝乳和牛乳進行酶解條件的優(yōu)化。分組如下:CEH為駝乳乳清蛋白酶解液;MEH為牛乳乳清蛋白酶解液。

圖1 不同蛋白酶對水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on hydrolysis degree注:不同字母表示同一樣品不同蛋白酶水解條件下的 差異顯著水平(P<0.05)。

2.2 駝乳和牛乳乳清蛋白酶解工藝單因素實驗結(jié)果

2.2.1 酶解pH對駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性的影響 將駝乳和牛乳乳清蛋白粉在不同pH條件下進行酶解,并測定其抗氧化性DPPH自由基清除率。駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液DPPH自由基清除率變化如圖2所示。隨著pH的增加,駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液DPPH自由基清除率總體均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,當pH達到7時,DPPH自由基清除率均達到最高,駝乳乳清酶解液的DPPH自由基清除率達到61.5%,牛乳乳清酶解液DPPH自由基清除率略低于駝乳,最高為54.5%。隨著pH的增加,酶活降低,DPPH自由基清除率隨后開始降低,因此當pH為7時,駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液具有最高的DPPH自由基清除率,此時是酶解pH的最優(yōu)條件。

圖2 酶解pH對乳清蛋白酶解液抗氧化性的影響Fig.2 Effects of enzymolysis pH value on antioxidant activity of whey protease enzymatic hydrolysate

2.2.2 底物濃度對駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性的影響 將不同底物濃度的駝乳和牛乳乳清蛋白酶解后進行抗氧化性DPPH自由基清除率的測定,結(jié)果如圖3所示,隨著底物濃度的增加,駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液的抗氧化性DPPH自由基清除率均呈現(xiàn)先上升后下降,當?shù)孜餄舛葹?%時,DPPH自由基清除最高,駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液的DPPH自由基清除率分別為60.2%、58.4%。隨著底物濃度的增加,酶的水解能力有限,無法釋放更多的抗氧化多肽,反而可能抑制其活性[20],從而降低酶解液的抗氧化性,因此當?shù)孜餄舛葹?%時,能夠得到DPPH自由基清除率最高的酶解液。

圖3 底物濃度對乳清蛋白酶解液抗氧化性的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on antioxidant activity of whey protease enzymatic hydrolysate

2.2.3 酶解時間對駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性的影響 駝乳和牛乳乳清蛋白經(jīng)不同時間酶解后抗氧化性DPPH自由基清除率結(jié)果如圖4所示,隨著酶解時間的增加,駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液的抗氧化性DPPH自由基清除率先上升后下降,當酶解時間為4 h時,駝乳和牛乳乳清酶解均有最高的抗氧化性,DPPH自由基清除率分別達到62.6%和58.4%,當酶解時間持續(xù)增加,駝乳和牛乳乳清酶解液不同程度的下降,乳清蛋白經(jīng)長時間的酶解后會發(fā)生變性,反而降低了酶解液的抗氧化性。因此酶解時間選擇4 h最為合適。

圖4 酶解時間對乳清蛋白酶解液抗氧化性的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time on antioxidant activity of whey protease enzymatic hydrolysate

2.2.4 酶與底物比對駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性的影響 駝乳和牛乳乳清蛋白添加不同量的木瓜蛋白酶反應(yīng)后酶解液的DPPH自由基清除率結(jié)果如圖5所示,酶添加量對駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性DPPH自由基清除率有一定的影響,總體呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。二者均在酶與底物比為3%時有最好的抗氧化性,駝乳乳清蛋白酶解液最高可達61.5%,牛乳乳清蛋白酶解液最高為59.7%。隨著蛋白水解酶的增加,底物濃度不變,水解效果無明顯變化,因此酶解液的抗氧化性無明顯的提高。因此,酶與底物比為3%時較為合適。

圖5 酶與底物比對乳清蛋白酶解液抗氧化性的影響Fig.5 Effects of enzyme substrate ratio on antioxidant activity of whey protease enzymatic hydrolysate

2.2.5 酶解溫度對駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液抗氧化性的影響 將駝乳和牛乳乳清蛋白在不同溫度下進行酶解并進行抗氧化性DPPH自由基清除率的測定,結(jié)果如圖6所示,駝乳乳清蛋白酶解液的總體趨勢是先上升后下降,在50 ℃時其DPPH自由基清除能力最高,為60.9%;牛乳乳清蛋白酶解液在40～60 ℃范圍內(nèi)其DPPH自由基清除能力變化幅度較小,最低為44.0%,最高達到56.4%,同樣也是在50 ℃條件下進行酶解其抗氧化能力最強。隨著溫度的不斷增加,蛋白水解酶的活性受到抑制,水解成度降低,酶解液的抗氧化性呈現(xiàn)下降的趨勢[23]。因此,酶解溫度為50 ℃較為合適。

圖6 酶解溫度對乳清蛋白酶解液抗氧化性的影響Fig.6 Effects of enzymolysis temperature on antioxidant activity of whey protease enzymatic hydrolysate

2.3 駝乳和牛乳乳清蛋白酶解工藝響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果 駝乳和牛乳乳清蛋白分別對最佳酶解條件附近值影響酶解效果較大的因素酶解溫度(A)、酶解pH(B)和底物濃度(C)進行響應(yīng)面試驗,并以抗氧化性DPPH自由基清除率為響應(yīng)指標,得到的試驗方案和結(jié)果見表2。

表2 駝乳和牛乳乳清蛋白響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Program and experimental results of Box-Behnken test of camel and bovine milk whey protein

通過Design-Expert v8.0.6軟件分析試驗結(jié)果得到駝乳乳清蛋白酶解液的DPPH自由基清除率與酶解溫度(A)、酶解pH(B)和底物濃度(C)方程為Y=60.36+2.99A-5.85B-9.39C-12.12AB-0.45AC-5.03BC+0.20A2-13.83B2-12.51C2。牛乳乳清蛋白酶解液的方程為Y=58.82+3.96A-15.21B+2.98C-2.13AB+0.30AC-4.65BC-3.90A2-9.30B2-1.82C2。

表3 駝乳乳清酶解液回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation of camel milk whey protein

酶解pH和底物濃度的交互項影響效果顯著(P<0.05),酶解pH和底物濃度的二次項對響應(yīng)值的影響均極顯著(P<0.01)。

表4 牛乳乳清酶解液回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation of bovine milk whey protein

2.3.2 交互作用分析 通過各因素的交互作用的等高線圖和曲面圖可直觀反映其對抗氧化作用的影響[25]。由圖7可知,隨著pH的增加,DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢;隨著溫度的升高,DPPH自由基清除率略微上升,但變化不明顯;隨著底物濃度的增加,DPPH自由基清除率先上升后下降。由等高線形狀[26]可知,酶解pH與酶解溫度的交互作用顯著,其次為酶解pH與底物濃度,酶解溫度與底物濃度的交互作用最不顯著,這與表4顯示結(jié)果一致。

圖7 駝乳乳清酶解液各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots of the interaction effects of various parameters of camel milk whey protein

由圖8可知,對牛乳乳清蛋白酶解液影響最大的是酶解pH,隨著pH的升高,其抗氧化性DPPH自由基清除率下降,而酶解溫度和底物濃度影響較小。酶解pH和底物濃度的交互作用最為顯著,陡峭程度最大,而酶解溫度和底物濃度交互作用的曲面陡峭程度最小,影響程度最小[27],與方差分析結(jié)果一致。

圖8 牛乳乳清酶解液各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plots of the interaction effects of various parameters of bovine milk whey protein

2.3.3 驗證試驗及結(jié)果 駝乳乳清蛋白酶解優(yōu)化通過響應(yīng)試驗得出,最佳酶解條件為酶解pH6.4,酶解溫度55 ℃,底物濃度2.73%,在此條件下DPPH自由基清除率預(yù)測值為73.29%。按照最優(yōu)推薦條件進行試驗測得駝乳乳清蛋白酶解液的DPPH自由基清除率為71.90%±0.01%,與方程預(yù)測值誤差較小。牛乳乳清蛋白酶解優(yōu)化通過回歸方程求解得到最佳酶解條件為酶解pH6.0,酶解溫度54 ℃,底物濃度4%,在此條件下DPPH自由基清除率預(yù)測值為70.15%。依照所選最優(yōu)酶解條件進行酶解試驗后測得的牛乳乳清蛋白酶解液的DPPH自由基清除率為69.90%±0.02%,與預(yù)測值幾乎一致,證明試驗效果較好。

2.4 駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液的抗氧化性

圖9 乳清蛋白的抗氧化能力Fig.9 Antioxidant capacity of whey protein注:不同字母表示組間(同一抗氧化指標) 差異顯著(P<0.05)。

2.5 駝乳和牛乳乳清蛋白酶解液SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

如圖10所示,駝乳乳清蛋白與牛乳乳清蛋白最大的區(qū)別就在于駝乳乳清蛋白中不含有致敏性成分β-乳球蛋白,駝乳乳清蛋白中的大分子的溶菌酶、α-乳清蛋白、血清白蛋白和乳鐵蛋白,牛乳乳清蛋白中的溶菌酶、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白分子量均在10 kDa以上,經(jīng)過4 h的酶解后,均被完全水解為小分子組分,分子量均小于10 kDa,充分驗證了酶解反應(yīng)已進行完全,乳清中的大分子蛋白已經(jīng)被水解為小分子的肽。

圖10 樣品的SDS-PAGE分析圖Fig.10 SDS-PAGE analysis of the sample注:1泳道為Marker;2泳道為牛乳乳清蛋白; 3泳道為牛乳乳清蛋白酶解液;4泳道為駝乳乳清蛋白; 5泳道為駝乳乳清蛋白酶解液。

3 結(jié)論