王固兵，徐秀林，胡秀枋，郭宛星

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093)

1 引 言

癌癥已成為全球首要的疾病死亡原因，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年有760萬人死于癌癥，其中我國就有196萬人，占全球癌癥死亡人數(shù)的25.89%[1]，因此，癌癥早期診斷對降低臨床死亡率、提高患者生存質(zhì)量有非常重要的意義。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，90%癌癥患者的死亡和腫瘤灶的轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]，如果癌癥患者能在腫瘤灶轉(zhuǎn)移前得到診斷和治療，至少有30%的死亡是可以預(yù)防的[3]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞作為一種由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，在醫(yī)學(xué)上被認(rèn)為是癌癥發(fā)病或轉(zhuǎn)移的早期征兆，且血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量可用于預(yù)測癌癥患者的生存期[4]。此外，分析獲取的循環(huán)腫瘤細(xì)胞有助于癌癥早期篩查、診斷、療效評價及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)控，同時可為癌癥治療提供新的思路[5]。然而，循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血液中數(shù)量極其稀少(l mL血液中僅1～100個循環(huán)腫瘤細(xì)胞)[6]，因此如何從血液中快速分離稀有循環(huán)腫瘤細(xì)胞是進行后續(xù)細(xì)胞分析的重要前提。

隨著微流控技術(shù)的高速發(fā)展，使用微流控技術(shù)進行循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選日趨成熟，然而在利用微流控技術(shù)分選循環(huán)腫瘤細(xì)胞的過程中，驅(qū)動血液樣品進樣速度的大小對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選效果具有極其重要的影響，過大或過小的進樣速度均會導(dǎo)致循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選率的降低。目前，微流控系統(tǒng)中使用微量注射泵、微量蠕動泵進樣系統(tǒng)進行驅(qū)動進樣，其流量控制精度高且流量調(diào)節(jié)范圍較大，但由于均采用脈沖式驅(qū)動的原理[7]，進樣過程中均存在流量脈動現(xiàn)象[8]，此外，注射器的自身結(jié)構(gòu)導(dǎo)致注射器內(nèi)易殘留空氣且難以排空，在進樣過程中存在死體積，嚴(yán)重影響循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選效果[9]。

本研究基于壓力泵驅(qū)動液體流動的原理，設(shè)計了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選裝置的進樣系統(tǒng)，通過精確控制氣體的壓力，確保進樣過程中流量穩(wěn)定并實現(xiàn)自動反饋調(diào)節(jié)。該系統(tǒng)的研發(fā)避免了蠕動泵和注射泵進樣系統(tǒng)中的流量脈動和死體積現(xiàn)象，同時具有較高的流量控制精度和較廣的流量調(diào)節(jié)范圍，可為循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選率的提高提供技術(shù)保障。

2 壓力進樣系統(tǒng)設(shè)計

本研究設(shè)計的進樣系統(tǒng)技術(shù)指標(biāo)為: 進樣速度30 mL/h，穩(wěn)定可靠，流量調(diào)節(jié)范圍為10～60 mL/h，驅(qū)動氣體壓力范圍為0～1.2 bar。

該進樣系統(tǒng)由壓力供給模塊、氣壓控制流量模塊、氣體壓力和液體流量信號采集模塊、上位機軟件等組成。壓力供給模塊能夠持續(xù)提供0～1.2 bar的穩(wěn)定壓強的氣壓；氣壓控制流量模塊能夠準(zhǔn)確的控制被測血細(xì)胞溶液在微流控芯片中的流量；氣壓和液體流量信號采集模塊能夠采集進樣時的氣壓和液體流量信號上傳至上位機，并使用進樣流量信號作為反饋量進行閉環(huán)流量調(diào)節(jié)；上位機軟件能夠?qū)崿F(xiàn)進樣過程中氣壓和流量的實時監(jiān)測，實現(xiàn)對通道、進樣量、進樣時間、進樣速度的設(shè)置等功能。

控制系統(tǒng)采用上、下位機結(jié)構(gòu), 下位機采用STM32作為氣壓控制的核心，用于控制電壓信號的輸出以及壓力與流量信號的采集，上位機軟件采用Visual C++開發(fā)，上下位機進行串口通訊，由上位機控制下位機電壓信號的輸出，同時上位機還對采集到的液體壓力信號和流量信號進行處理、分析和顯示。通過上位機軟件設(shè)定進樣速度，全自動的完成進樣，且進樣速度穩(wěn)定。系統(tǒng)的總體結(jié)構(gòu)框圖見圖1，系統(tǒng)實物見圖2 。

圖1 壓力進樣系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)框圖Fig.1 The overall structure of the pressure injection system block diagram

圖2 壓力進樣系統(tǒng)實物圖Fig.2 Pressure injection system physical diagram

2.1 進樣系統(tǒng)分析

2.1.1壓力驅(qū)動液體流動設(shè)計原理 該系統(tǒng)采用氣壓驅(qū)動液體流動來實現(xiàn)微流控芯片中的樣品液進樣，其結(jié)構(gòu)見圖3。工作原理是在密閉容器內(nèi)盛有一定量的樣品溶液，向密閉容器中通入一定壓力的氣體[10]，容器內(nèi)的液體在壓力的作用下沿著液體管道進入微流控芯片，由微流控芯片完成循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選。進樣速度與入口壓力成正比，對圖3所示的結(jié)構(gòu)進行分析，若不考慮液體的壓縮性，由液體的流量連續(xù)性方程得出：

(1)

假設(shè)樣品溶液在管道中做層流流動，其流量計算公式為：

(2)

式中μ為血液粘度，d為液體管道的直徑，L0為液體管道的長度，P0為內(nèi)充液的初始壓力，本系統(tǒng)中的μ為2.7 mpas，d為0.56 mm，L0為12 cm。由式(2)可知氣體驅(qū)動壓力和進樣流量之間的數(shù)據(jù)關(guān)系。

圖3 進樣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Injection system structure

2.1.2氣體壓力調(diào)節(jié) 該系統(tǒng)采用比例電磁閥(德國Tecno公司，型號PS120000-020-01)進行壓力調(diào)節(jié)，其調(diào)壓精度為2 mbar，響應(yīng)時間為0.5 ms。采用氣壓泵(上海蓬普流體科技公司，型號GEB1298406)持續(xù)供氣，其最大輸出壓力為1.2 bar，氣體流量為8.2 L/min。

比例電磁閥的工作曲線見圖4。通過控制加在其控制端的電壓(0～10 V)控制比例電磁閥的開度從而控制輸出壓力的大小，由圖4可知，比例電磁閥0～10 V對應(yīng)0～1 bar的壓力范圍，即0.01 V可調(diào)節(jié)1 mbar的壓力輸出，為滿足比例電磁閥1 mbar的壓力調(diào)節(jié)精度，需控制電路電壓輸出精度達到0.001 V，且穩(wěn)定在0.01 V，為了精確地控制密閉容器內(nèi)氣體的壓力，本研究設(shè)計了高精度電壓輸出電路，比例電磁閥配以比例-積分-微分控制器(PID)。

PID控制又稱PID調(diào)節(jié)，是根據(jù)系統(tǒng)的誤差，利用比例、積分、微分計算出輸入值，然后進行控制[11]，把系統(tǒng)的輸出值作為反饋，與系統(tǒng)的給定值進行運算后，將所得誤差加到系統(tǒng)的輸入端，從而調(diào)節(jié)系統(tǒng)的輸出值[12]?？刂圃硪妶D5，系統(tǒng)的輸入值是根據(jù)系統(tǒng)的輸出值實時變化，最終構(gòu)成閉環(huán)系統(tǒng)，從而精確地調(diào)節(jié)系統(tǒng)的輸出值。PID控制器中的誤差是由給定值r(t)和實際的輸出值y(t)所組成的。給定值與輸出值之間偏差e(t)為：

e(t)=r(t)-y(t)

(3)

圖4 比例電磁閥工作曲線Fig.4 Working curve of proportional solenoid valve

PID的控制公式為：

(4)

式中kp為比例系數(shù)，Ti為常數(shù)，Td為微分時間常數(shù)。其中，比例環(huán)節(jié)能夠成比例地反映偏差信號e(t)，通過控制kp可以提高系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)精度；積分環(huán)節(jié)可以用來消除靜態(tài)誤差以提高整個系統(tǒng)的精度；微分環(huán)節(jié)用來反映e(t)的變化趨勢，以有效加快系統(tǒng)調(diào)節(jié)速度從而縮短調(diào)節(jié)時間[13]。

圖5 系統(tǒng)PID控制原理圖Fig.5 System PID control schematic

由微流控芯片的流道結(jié)構(gòu)和細(xì)胞尺寸相關(guān)性可知，當(dāng)樣品溶液在微流孔芯片中流動時，其黏滯力和表面張力的作用變得十分顯著，微流控芯片中的流阻不斷增大，為確保進樣速度的穩(wěn)定，需不斷調(diào)整氣體驅(qū)動壓力的大小。該進樣系統(tǒng)采用流量傳感器(法國ELveflow公司，型號FS4)實時檢測微流控芯片進樣過程的流量，并作為反饋信號反饋至PID控制器，從而構(gòu)成閉環(huán)的流量調(diào)節(jié)系統(tǒng)。當(dāng)設(shè)定的液體流量與實際反饋端的流量不吻合時，PID控制器調(diào)節(jié)比例電磁閥的輸出，直至所設(shè)定的氣體壓力值和實際的氣壓值相等，從而提高了密閉容器內(nèi)的氣壓的控制精度，實現(xiàn)了系統(tǒng)的高精度進樣及穩(wěn)定性。

3 硬件電路設(shè)計

系統(tǒng)的硬件電路主要包括微控制器模塊、氣體壓力及液體流量采集模塊、氣體壓力控制模塊、串口通信模塊、電源模塊等。整體硬件電路框圖見圖6。

進樣系統(tǒng)硬件模塊主要以微控制器STM32F103ZET6為核心，氣體壓力傳感器、液體流量傳感器分別將密閉容器的氣壓信號、微流控芯片入口處的液體流量信號送至信號采集模塊，信號采集模塊中的模數(shù)轉(zhuǎn)換(Analog-to-Digital Convert)電路將信號處理后供以微控制器處理；氣體壓力控制模塊主要由PID控制器、比例電磁閥、DAC8653數(shù)模轉(zhuǎn)換電路、OP2172等比例放大電路組成，用于輸出分辨率為0.001 V、0～10 V的可調(diào)電壓信號，控制比例電磁閥，進而控制密閉溶液瓶中氣壓的調(diào)節(jié)；氣源壓力輸出模塊主要由氣泵及其驅(qū)動電路組成，微控制器根據(jù)串口通信模塊控制氣源壓力的啟動和停止、控制密閉容器的壓力大小、傳輸氣壓與液體流量數(shù)據(jù)；串口通信模塊主要完成與上位機的通信，以使整個系統(tǒng)協(xié)調(diào)運行。

圖6 氣體壓力控制硬件電路框圖Fig.6 Gas pressure control hardware circuit block diagram

4 進樣控制系統(tǒng)軟件設(shè)計

上位機軟件采用Visual Studio2015軟件開發(fā)平臺，用C++編程，該進樣系統(tǒng)上位機軟件主要的功能包括進樣通道的選擇、流量及進樣時間的設(shè)定、氣壓和液體流量信號的采集及顯示等，其軟件流程圖見圖7。

進樣前，首先設(shè)置好通道、進樣量、進樣時間、進樣速度等參數(shù)并保存。進樣開始后，在界面上顯示當(dāng)前氣壓和液體流量值，并實現(xiàn)了通過波形持續(xù)實時監(jiān)測流量的變化。進樣結(jié)束后該系統(tǒng)軟件可以自動關(guān)閉當(dāng)前檢測通道的氣壓輸出，實現(xiàn)進樣過程的自動化。通過串口通信讀取下位機的壓力和流量數(shù)據(jù)，由上位機實現(xiàn)對進樣流量等指標(biāo)的設(shè)定并進行顯示。

圖7 進樣系統(tǒng)軟件總體流程圖Fig.7 Overall flow chart of the injection system software

5 系統(tǒng)可靠性測試

將2 mL含有10 000個循環(huán)腫瘤細(xì)胞的模擬血溶液稀釋20倍，每次取稀釋后的模擬血溶液2 mL以20、30、40 mL/h的速度進樣，每種流速下進行6次實驗，時間間隔為2 d，驗證進樣過程中的壓力驅(qū)動的可靠性。實驗環(huán)境在暗室內(nèi)，基本視為無環(huán)境影響因素，讀取并記錄每種進樣速度下的流量數(shù)據(jù)，計算測量數(shù)據(jù)的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)，見表1。

表1 壓力進樣系統(tǒng)可靠性測試結(jié)果Table 1 Pressure injection system reliability test results

將實驗數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 19進行可靠性分析，每種流速下兩次進樣的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.85，說明本研究設(shè)計的壓力進樣系統(tǒng)具有良好的可靠性。

6 討論

本研究基于氣壓驅(qū)動的原理設(shè)計的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選進樣系統(tǒng)具有較高的流量調(diào)節(jié)精度及較大的流量調(diào)節(jié)范圍，同時能夠有效地避免微量注射泵進樣系統(tǒng)和微量蠕動泵進樣系統(tǒng)中的流量脈動問題以及進樣不完全等問題。系統(tǒng)采用的stm32單片機外設(shè)資源豐富、功耗低，結(jié)合微型比例電磁閥以及PID控制器的介入，確保了整個進樣過程中具有穩(wěn)定的流量輸出。系統(tǒng)還可實時監(jiān)測進樣過程中的氣壓和液體流量信號，為提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選效果提供技術(shù)保障。本系統(tǒng)采用的是傳統(tǒng)的PID控制算法，針對特定的微流控芯片使用了預(yù)設(shè)的PID控制參數(shù)，但當(dāng)微流控芯片結(jié)構(gòu)以及所需的流速發(fā)生改變時，系統(tǒng)的閉環(huán)調(diào)節(jié)性能會有所降低，為進一步增強系統(tǒng)的魯棒性，可通過模糊控制理論設(shè)計模糊PID控制器實現(xiàn)系統(tǒng)的閉環(huán)調(diào)節(jié)，該項控制的優(yōu)化尚待進一步研究。