楊洋 楊懿德 賀小蓉

摘要：以宜賓煙區(qū)為對象，以其主要的煙草與玉米輪作種植模式為切入點，分析種植模式對病毒及煙株發(fā)病的影響。結(jié)果表明，連續(xù)植煙的田塊尤其是連續(xù)植煙8年的田塊，病毒病發(fā)生較重。通過煙田土壤病毒檢測，明確連續(xù)植煙能夠增加土壤中病毒的積累量;土壤中煙根殘體是病毒重要的侵染源之一。煙草—玉米輪作種植模式能夠明顯減弱病毒病發(fā)生。表明同一生長環(huán)境中，在周邊毒源植物、傳播介體和管理模式差異不大的條件下，煙草的種植模式對病毒病的發(fā)病程度有較為明顯的影響。

關(guān)鍵詞：煙草;玉米;連作;輪作;病毒病

煙草在生長過程中易受各類病原侵染，尤其是各種植物病毒。據(jù)報道，目前世界上能夠侵染煙草的病毒有40多種，我國有20余種[1-2]。近年來，由于氣候、耕作制度、種植品種變化及煙葉產(chǎn)區(qū)調(diào)整，個別地區(qū)煙草病毒病的發(fā)生呈上升趨勢，病害發(fā)生時間提前，對煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量造成較大威脅。

病毒的傳播方式是病毒病流行的特征，是重要決定因素。煙株在田間發(fā)生病毒病的主要原因包括苗期帶毒、昆蟲傳毒、土壤帶毒傳毒等。在規(guī)范的育苗條件下，漂浮育苗期不是病毒傳播的主要途徑[3-4]。而海拔較高的植煙區(qū)，移栽前期氣候冷涼，蚜蟲數(shù)量及遷飛少，蚜蟲傳毒也非主要傳播途徑。因此，土壤傳毒則成為部分煙區(qū)煙草病毒傳播的主要途徑。據(jù)報道，一些土壤顆粒有吸附病毒粒子的能力，并且增強病毒粒子在土壤中的穩(wěn)定性[5]。這些病毒粒子極易通過根系的傷口侵入煙株，田間移苗時，土壤中的各種昆蟲會使根系產(chǎn)生許多微傷口，土壤病殘體中的病毒便會趁機侵入煙苗根部。

因此，在同一生長條件，苗期帶毒、昆蟲傳毒和煙田管理影響差異不大的情況下，推測相鄰田塊病毒病發(fā)病存在的差異與土壤中病毒的積累水平有關(guān)。輪作、間作套種等種植模式可直接影響土壤結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)、微生物豐度及生態(tài)環(huán)境，同時影響病原物在土壤中的積累量[6]。宜賓煙草種植有比較久遠的歷史，本研究以宜賓煙區(qū)為對象，以玉米和煙草輪作為主要的種植模式，對比煙草連作，分析對病毒病發(fā)生的影響，進而為當(dāng)?shù)夭《静【C合控制提供參考依據(jù)。

1 試驗方法

1.1 煙草病毒病發(fā)病調(diào)查

調(diào)查地點：宜賓市興文縣、筠連縣、珙縣、屏山縣各煙區(qū)。

調(diào)查時間：2019年4—6月，對宜賓煙草病毒病進行調(diào)查。

調(diào)查方法：5點取樣法，每點固定30株，共150株，統(tǒng)計發(fā)病率及病情指數(shù)。

煙草病毒病分級依照行業(yè)標準YC/T 39—1996中病毒病分級標準調(diào)查：0級：全株無病;1級：心葉脈明或輕微花葉，或上部1/3葉片花葉但不變形，植株無明顯矮化;2級：1/3至1/2葉片花葉，或少數(shù)葉片變形，或主脈變黑，植株矮化為正常株高的2/3以上;3級：1/2至2/3葉片花葉，或變形或主側(cè)脈壞死，或植株矮化為正常株高的1/2至2/3;4級：全株葉片花葉，嚴重變形或壞死，病株矮化為正常株高的1/3至1/2。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%;

病情指數(shù)=∑（各級發(fā)病數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級別代表值）×100;

相對防效=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

1.2 土壤取樣

2019年的4—6月，于宜賓市興文縣、筠連縣、珙縣、屏山縣各煙區(qū)，在不同種植模式下的煙田取樣。分別取3株煙草根系周圍的土壤，混合為1個土樣，取樣信息見表1。

1.3 病毒鑒定

1.3.1 植株總RNA提取 2019年6—10月，在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實驗室將采集到的病株材料適量研磨至粉末，分別迅速加入400 μL RNA緩沖液（20 mmol/L Tris·HCl（pH值8.0），1% SDS，200 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA）和400 μL混合液（水飽和酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 異戊醇=25 ∶ 24 ∶ 1）充分混勻。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清至另一離心管中。加入2倍體積的4 mol/L LiCl，混勻，-20 ℃沉淀20 min以上。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清。1 mL 70%乙醇洗滌沉淀，離心 3 min，室溫放置10 min使乙醇完全揮發(fā)。所得沉淀溶解于30 μL的無菌ddH2O中，吸取2 μL電泳檢測，剩余RNA保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 土壤病毒RNA提取 取土壤于50 mL離心管中，加入0.02 mol/L PBS（浸沒土壤即可），150 r/min 室溫振蕩混勻4～6 h;再于 4 000 r/min 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至RNase-free和 DNase-free 管中;加入PEG-6000且使其濃度達到20%，室溫放置35～45 min;取上步所得溶液 600 μL 到2 mL RNase-free和DNase-free管中并加入2倍體積的4 mol/L LiCl，-20 ℃以下沉淀2 h以上;12 000 r/min離心15 min，棄上清液，向管中加入1 mL 70%乙醇溶液，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，12 000 r/min離心1 min，室溫干燥（盡量去除干凈乙醇，防止影響下游反應(yīng)）。

1.3.3 RT-PCR擴增 反轉(zhuǎn)錄：在0.2 mL離心管中加入RNA模板8 μL、下游引物2 μL，混勻后，72 ℃ 水浴變性5 min，迅速置于冰上5 min，再依次加入RNase Inhibitor 0.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、5×first buffer 5 μL、M-MLV反向轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL;總體積20 μL，42 ℃水浴，60 min 后取出置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 13.3 μL;10×ex Taq Buffer 2.5 μL;正向引物1 μL;反向引物1 μL;dNTP（2.5 mmol/L）2 μL;第一鏈cDNA合成產(chǎn)物5 μL;ex Taq酶0.1 μL;總體積為25 μL，混勻后稍離心。所用引物序列見表2。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，循環(huán)34次;72 ℃ 10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草連作、煙草與玉米輪作種植模式下煙草病毒病的發(fā)病調(diào)查

對宜賓各煙區(qū)的病毒病進行調(diào)查，興文縣各村的病情指數(shù)在4～20，珙縣各村的病情指數(shù)在2～11，筠連縣各村的病情指數(shù)在3～5，屏山縣各村的病情指數(shù)大多在5～19（圖1）。興文縣病毒病發(fā)病相對較高，筠連縣發(fā)病較輕，各村的病情指數(shù)存在差異，亦存在局部發(fā)病較重的田塊，這些田塊主要分布在海拔1 000 m以上的長期植煙區(qū)。

進一步對這些植煙區(qū)進行調(diào)查，種植模式是主

要的差異。興文縣仙峰苗族鄉(xiāng)同一種植點的煙田調(diào)查顯示，連續(xù)植煙8年的田塊部分煙株因病毒病過于嚴重已經(jīng)拔除，后續(xù)補苗發(fā)病率近100%，病情指數(shù)達53.50;連續(xù)植煙2年的田塊病情指數(shù)在22以上，發(fā)病情況較嚴重;鄰近玉米和煙草輪作田塊病情指數(shù)較低，病情指數(shù)約為12。大雪村一煙田近3年連續(xù)植煙，病情指數(shù)達30.50，鄰近玉米和煙草輪作1年的田塊，病情指數(shù)為15.50。杜家垇村近3年連續(xù)植煙的一田塊發(fā)病率極高，病情指數(shù)達到42;鄰近玉米和煙草輪作1年的田塊，病情指數(shù)為13，具體數(shù)據(jù)見表3、圖2。說明在同一生長環(huán)境下，排除周邊毒源植物、傳播介體和管理模式的影響，煙草連作與玉米輪作的不同種植模式對煙草發(fā)病程度具有較大影響，連續(xù)植煙病毒病的發(fā)生程度有明顯加重現(xiàn)象。

2.2 煙草連作、煙草與玉米輪作種植模式下土壤攜帶病毒檢測及活力分析

前期對宜賓煙草發(fā)病煙株病毒種類進行的檢測表明TMV的檢出率最高，幾乎達到100%，其次為CMV、TVBMV、PVY。鑒于TMV抗逆性極強，后續(xù)土壤分析則針對TMV進行。

取田間煙草連作、煙草與玉米輪作種植模式下不同發(fā)病程度的煙株根際土壤，對TMV進行半定量PCR檢測，結(jié)果如圖3所示。除了土壤樣品1、2發(fā)病重，其病毒檢測水平不高之外，其他發(fā)病重的煙株根際周圍土壤的TMV病毒含量比發(fā)病輕的TMV病毒含量多，說明煙株的發(fā)病程度和土壤中TMV病毒的豐度有關(guān)，進而表明土壤中TMV的積累水平受煙草連作及輪作的影響。

為了驗證這些土壤中存在的病毒粒子是否具有活性，將前作為玉米的煙田、煙草連作2年、8年的土壤浸泡緩沖液，接種于心葉煙，通過形成的枯斑數(shù)量判斷TMV是否具有活性。接種后4 d，前茬為玉米的煙田和連作2年的煙田土樣，心葉煙上形成了幾個枯斑;連作8年的土樣形成的枯斑數(shù)量較多，達10個以上（圖4）。由此可見，土壤中的病毒粒子在長期連作下，積累數(shù)量增多，且TMV具有活力。

2.3 田間殘留煙根病毒種類和活力檢測

煙草病毒的初侵染源除了土壤，還有土壤中的病殘體。2019年4月在興文縣群魚村調(diào)查前茬為煙草的田塊，在煙苗移栽前，取土壤中殘留的煙根進行病毒種類檢測和活性分析。根據(jù)前期病毒種類的檢測，對TVBMV、TMV、CMV、PVY進行檢測，結(jié)果表明15個煙根中均含有煙草脈帶花葉病毒TVBMV，10個具有TMV，8個含CMV，未檢測到PVY（圖5）。將檢測有病毒的煙根殘體1、4、5、6研磨成汁液，接種于心葉煙幼苗，接種后第5天在接種葉出現(xiàn)明顯的枯斑（圖6）。在云煙上接種，第20天出現(xiàn)明顯的花葉和畸形（圖7），表明煙田土壤中殘留煙根攜帶的病毒也可作為第2年煙草病毒的侵染源。

3 討論

我國煙葉產(chǎn)區(qū)跨度大，氣候、耕作制度和農(nóng)業(yè)生態(tài)條件均有較大差異，煙草病毒種類復(fù)雜，各煙區(qū)間病毒的種群動態(tài)和分布差異明顯。

2018—2019年對宜賓煙區(qū)煙草病毒病進行了全面調(diào)查，煙草—玉米輪作是宜賓煙區(qū)的主要種植模式，在該種植模式下煙草病毒病發(fā)病總體不高，對煙葉產(chǎn)量沒有明顯影響。然而亦存在煙草連作多年的田塊，尤其是5年以上的連作田塊病毒病發(fā)病較重。有報道表明，連作煙田土壤中病毒含量明顯比水旱輪作田塊中高，說明輪作對減輕煙草病毒病有顯著效果，這也可能是因為輪作對病地土壤中的病毒有降解作用[7-8]。輪作對黃瓜綠斑駁花葉病毒發(fā)病地土壤中的病毒有降解作用[9]。

本研究通過半定量RT-PCR，也表明煙草連作多年田塊的土壤中的病毒量比煙草—玉米輪作田塊土壤高。連年種植煙草給病毒提供了可以增殖的時間和空間，由于TMV抗逆性較強，加上植煙年限持續(xù)升高，煙田土壤中TMV不斷積累，成為當(dāng)?shù)責(zé)煵莶《静“l(fā)生的重要因素之一[10-11]。

此外，對前茬為煙草的煙田殘留根系進行檢測，其病毒檢出率較高，且具有活性。有報道指出，如果土壤中的煙根、莖稈等病殘體碎屑清理不及時或不清理，散布在土壤中的煙草病毒極易通過根損傷、根部的線蟲以及地下害蟲危害等途徑將病毒傳入煙草。因此，這些殘留的煙根以及散落在土壤中的病毒，是煙草移栽后的重要初始病毒侵染源。隨著煙株根系伸長時穿過砂粒受傷，病毒可接觸到傷口侵染;或隨著根毛相互扭結(jié)，病毒隨分泌物進入健康根也可能造成傳染。

由于煙草病毒病不僅具有機械傳播性、蟲傳性，還有土傳性，能夠切斷傳播途徑的措施都將是行之有效的控病措施。國內(nèi)利用麥煙套作、煙和油菜套種的時間差來防治煙草病毒病具有良好效果。本研究通過煙草和玉米輪作種植模式下的病害調(diào)查，表明這種種植模式對煙草病毒病也具有較好的防治效果，可為其他地區(qū)的煙草種植提供參考依據(jù)。

參考文獻：

[1]陳瑞泰，朱賢朝，王智發(fā)，等. 全國16個主產(chǎn)煙省（區(qū)）煙草侵染性病害調(diào)研報告[J]. 中國煙草科學(xué)，1997，14（1）：1-7.

[2]劉珊珊，原雪峰. 我國部分煙區(qū)煙草病毒病的病原分析[C]. 中國植物病理學(xué)會，2017.

[3]劉 勇，江紅甲，布云紅，等. 煙草漂浮苗花葉病毒病重要初侵染源的探討[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（4）：483-492.

[4]尹躍艷，端永明，徐興陽，等. 昆明煙區(qū)育苗點煙草花葉病毒初侵染源的檢測與分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，25（1）：166-168.

[5]周雪平，濮祖芹，方中達. 黃瓜花葉病毒（CMV）土壤非介體傳播研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，17（2）：39-42.

[6]王欣英. 前茬作物玉米和甘薯對煙草的輪作效應(yīng)及其機理的研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[7]馬學(xué)萍，卯 霞，劉開全，等. 不同質(zhì)地?zé)熖锿寥缹煵莼ㄈ~病毒的吸附差異[J]. 曲靖師范學(xué)院學(xué)報，2009（6）：38-40.

[8]王秋英，趙炳梓，張佳寶，等. 土壤對病毒的吸附行為及其在環(huán)境凈化中的作用[J]. 土壤學(xué)報，2007，44（5）：808-816.

[9]蔡美艷，陳海波，葉建人. 土壤處理對黃瓜綠斑駁花葉病毒病的控制效果[J]. 基層農(nóng)技推廣，2016（7）：19-21.

[10]劉 敏，楊金廣，謝揚軍. 我國植煙土壤中TMV的污染與檢測分析[J]. 作物研究，2013（增刊1）：32-35.

[11]劉世超. 土壤中TMVLAMP檢測技術(shù)的建立及土壤傳播TMV的效率研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2016.劉忠玲，李小艷，王自力，等. 基于組合賦權(quán)的甘薯品種抗病性模糊綜合評價[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（12）：93-97.