李漪錦 肖力 徐夢(mèng)瑋

摘要：旨在采用勻漿法優(yōu)化葛根淀粉提取工藝并同時(shí)利用大孔吸附樹脂富集回收其水提液中的總異黃酮。通過單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化葛根淀粉的提取條件，同時(shí)考察葛根總異黃酮的溶出效果，最后用大孔樹脂吸附法富集回收勻漿提取液中的總異黃酮。結(jié)果表明，用勻漿法提取葛根淀粉的最佳工藝條件為液料比8 mL ∶ 1 g、勻漿時(shí)間30 s，洗滌時(shí)的液料比為6 mL ∶ 1 g，在此條件下淀粉的收率為（18.58±0.26）%（n=3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差=1.38%），總異黃酮在水中的溶出率為（1.49±0.05）%（n=3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差=3.37%）。D101大孔樹脂對(duì)葛根總異黃酮的動(dòng)態(tài)飽和吸附容量可以達(dá)到30.12 mg/mL，70%乙醇的洗脫率達(dá)到86.89%，樣品中的總異黃酮含量（紫外比色法）可以達(dá)到50.91%，其中葛根素的含量（高效液相色譜法）為28.77%。該研究方法操作簡(jiǎn)單易行，提取溶劑價(jià)格低廉且環(huán)保，淀粉、總異黃酮的收率都較高，回收的總異黃酮純度也較高，減輕了葛根淀粉提取加工過程中排放水對(duì)環(huán)境的污染，高效合理利用了葛根資源，能夠?yàn)橹行⌒透鸶庸て髽I(yè)對(duì)葛根淀粉的提取加工及資源化綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：葛根;淀粉;總異黃酮;葛根素;勻漿法

葛根（Radix Puerariae）是豆科植物野葛[Pueraria lobata （Willd.） Ohwi]或甘葛藤[Pueraria thomsonii Benth.]的干燥根，為常用的傳統(tǒng)中藥，其性味甘、辛、涼，歸脾、胃經(jīng)，具有解肌退熱、生津止渴、升陽(yáng)止瀉的功效[1]。葛根藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，被列為中品。我國(guó)葛屬植物資源豐富，目前發(fā)現(xiàn)9個(gè)品種和2個(gè)變種，應(yīng)用最多的是野葛和粉葛，其中粉葛淀粉含量豐富（含粉率一般為20%～25%），但是異黃酮含量相對(duì)于野葛而言并不高，多用于提取淀粉。野葛異黃酮含量較高而淀粉含量較低，因此對(duì)其活性成分異黃酮的研究較多[3-4]。目前，從葛根中分離鑒定的異黃酮類化合物多達(dá)幾十種，主要為葛根素，還有大豆素、大豆苷、染料木素、芒柄花素等。葛根異黃酮具有植物雌激素樣作用及擴(kuò)張冠脈血管等心血管相關(guān)作用，還具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化等活性[5-10]，因而受到人們的廣泛關(guān)注。葛根素為葛根中特有的異黃酮，在臨床上已被廣泛應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、眼底疾病、急性乙醇中毒及腫瘤的治療[11-13]。

葛根是國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)的藥食兩用植物，野葛淀粉在我國(guó)民間的食用歷史悠久。但是長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)葛根資源的開發(fā)呈現(xiàn)顧此失彼的狀況，僅限于對(duì)淀粉或者黃酮類化合物中單一成分的利用，造成了資源的浪費(fèi)。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近年來(lái)我國(guó)開始出現(xiàn)部分中小型葛根淀粉生產(chǎn)加工企業(yè)，但一般采用傳統(tǒng)工藝[14-15]。為了獲得色澤潔白的葛根淀粉，常需要多次漂洗與沉降，存在用水量大、僅利用了其中的淀粉而對(duì)生產(chǎn)過程中的勻漿提取液并未加以回收利用便直接外排，這樣不僅會(huì)對(duì)環(huán)境造成較大污染，而且會(huì)造成異黃酮資源的巨大浪費(fèi)。近年來(lái)，人們認(rèn)識(shí)到在生產(chǎn)葛根淀粉的同時(shí)回收利用異黃酮成分的重要性，提出了醇提工藝[16-17]，但是以乙醇替代水作為溶劑提取和生產(chǎn)葛根淀粉，必然導(dǎo)致生產(chǎn)工藝復(fù)雜、設(shè)備投入大、生產(chǎn)成本偏高等問題，不適合中小型加工企業(yè)的生產(chǎn)要求。本研究旨在優(yōu)化大部分中小型葛根生產(chǎn)企業(yè)在葛根淀粉提取加工中采用的勻漿法這一傳統(tǒng)加工工藝，以期減少生產(chǎn)中的用水量，同時(shí)考察葛根異黃酮的溶出情況，并以大孔樹脂吸附法富集回收加工葛根淀粉所產(chǎn)生的排放水中的總異黃酮，從而為葛根資源的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 葛根材料為粉葛，種植時(shí)間為2年，購(gòu)自張家界越天然農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司;葛根素標(biāo)準(zhǔn)樣品（編號(hào)：110752-201615），購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院;D101大孔樹脂，購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;試驗(yàn)用水為純凈水;其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司;LC-20AT高效液相色譜（HPLC）儀，日本島津公司;ATY124萬(wàn)分之一電子天平，日本島津公司;TP-520A千分之一電子天平，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司;攪拌機(jī)，廣東美的生活電器制造有限公司;TG16-WS高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葛根淀粉的生產(chǎn)工藝及方法 葛根淀粉的生產(chǎn)工藝流程如下：鮮葛根→清洗→去皮→切片→勻漿→過濾→洗滌→沉降→干燥。具體方法：將鮮葛根用自來(lái)水洗凈、去皮，切成0.2 mm左右的薄片;稱取50 g薄片放入攪拌機(jī)中，加入適量純凈水，啟動(dòng)電源勻漿一定時(shí)間;用3層紗布過濾勻漿，殘?jiān)眠m量純凈水分次洗滌，收集濾液，即為勻漿法制備得到的提取液（目前此提取液在實(shí)際生產(chǎn)中被大部分中小型葛根加工廠當(dāng)作廢水向外直接排放）;將濾液靜置沉降24 h后傾出上清液，收集上清液（用于總異黃酮的富集與回收）;沉淀用100 mL純凈水清洗1次，進(jìn)行二次沉淀，傾去上清液，將淀粉在70 ℃烘干至恒質(zhì)量，取出淀粉，在千分之一電子天平上稱質(zhì)量。按公式（1）計(jì)算淀粉收率：

1.2.2 單因素試驗(yàn)條件 考察勻漿過程中的液料比（2 mL ∶ 1 g、4 mL ∶ 1 g、6 mL ∶ 1 g、8 mL ∶ 1 g、10 mL ∶ 1 g、12 mL ∶ 1 g）、勻漿時(shí)間（30、60、90、120、150 s）、洗滌過程中的液料比（0 mL ∶ 1 g、1 mL ∶ 1 g、2 mL ∶ 1 g、3 mL ∶ 1 g、4 mL ∶ 1 g、5 mL ∶ 1 g、6 mL ∶ 1 g、7 mL ∶ 1 g、8 mL ∶ 1 g）對(duì)葛根淀粉收率及總異黃酮收率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以淀粉、總異黃酮的收率為考察指標(biāo)，對(duì)勻漿過程中的液料比、勻漿時(shí)間及洗滌過程中的液料比進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)L9（33），因素與水平設(shè)置見表1。

1.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照正交試驗(yàn)的優(yōu)選條件進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2.5 勻漿提取液中總異黃酮的回收 按照上述優(yōu)選條件提取淀粉，沉降24 h。傾出上清液并將上清液于9 000 r/min離心處理5 min，收集離心液。離心液用D101大孔樹脂以1 BV/h的流速上柱動(dòng)態(tài)吸附，吸附總異黃酮的樹脂先用2 BV的純凈水洗去殘留液，再用6 BV的70%乙醇以1 BV/h的流速洗脫。收集洗脫液，回收乙醇至干，即可得到總異黃酮樣品。

1.2.6 總異黃酮與葛根素含量的測(cè)定

1.2.6.1 紫外（UV）比色法測(cè)定總異黃酮含量 由于葛根異黃酮在250 nm處的紫外吸收特征峰與葛根素相似，因此在用UV比色法測(cè)定葛根中總異黃酮含量的過程中可以采用葛根素作為對(duì)照品，具體操作步驟如下：

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取6.0 mg葛根素標(biāo)樣于100 mL燒杯中，加適量甲醇溶解，將其定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容、搖勻。分別移取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mL儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容、搖勻。用紫外-可見分光光度計(jì)在250 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制總異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品的分析。將液體樣品作適當(dāng)稀釋后直接采用UV比色法測(cè)定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出待測(cè)液中的總異黃酮濃度C1，同時(shí)可以按照以下公式計(jì)算出樣品中的總異黃酮含量：

1.2.6.2 HPLC法分析總異黃酮樣品中的葛根素含量 HPLC條件：InertSustain-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相A為純凈水，流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫條件如下：00.00～25.00 min，30%～70% B;25.00～25.10 min，70%～100% B;25.10～27.00 min，100% B;27.00～34.00 min，30% B。流速為0.80 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制葛根素質(zhì)量濃度為 1.747～57.576 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照上述色譜條件檢測(cè)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品濃度的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取10 mg分離樣品于100 mL燒杯中，加適量甲醇溶解后定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容搖勻。按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品溶液中葛根素的濃度。按公式（3）計(jì)算葛根素含量：

2 結(jié)果與分析

2.1 UV比色法分析樣品中的總異黃酮含量

通過紫外-可見分光光度法，在250 nm處依次測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。結(jié)果表明，總異黃酮的質(zhì)量濃度在2.4～19.2 mg/L范圍內(nèi)時(shí)，其質(zhì)量濃度（x）與吸光度（y）具有很好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.016 2+59.048 96x（r=0.999 8，n=5）。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 勻漿時(shí)間對(duì)淀粉、總異黃酮收率的影響 固定勻漿過程中的液料比及洗滌過程中的液料比，研究勻漿時(shí)間對(duì)淀粉及總異黃酮收率的影響。從圖1可看出，勻漿時(shí)間為60 s時(shí)，淀粉及總異黃酮收率均已達(dá)到較高水平。由于勻漿時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，勻漿時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，給后續(xù)的過濾水洗淀粉工作帶來(lái)困難，因此，本研究選擇的勻漿時(shí)間為60 s。

2.2.2 勻漿過程中液料比對(duì)淀粉、總異黃酮收率的影響 在勻漿時(shí)間一定、固定洗滌過程中液料比的條件下，研究勻漿過程中液料比對(duì)淀粉、總異黃酮收率的影響。從圖2可以看出，隨著液料比的增大，

淀粉與總異黃酮的收率均呈現(xiàn)先升高后略有降低的趨勢(shì);當(dāng)液料比為6 mL ∶ 1 g時(shí)，淀粉收率最高;當(dāng)液料比為8 mL ∶ 1 g時(shí)，總異黃酮收率最高。綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)中的用水成本，最后選擇勻漿過程中的液料比為6 mL ∶ 1 g。

2.2.3 沖洗過程中液料比對(duì)淀粉和總異黃酮收率的影響 在勻漿時(shí)間及勻漿過程中液料比一定的條件下，研究洗滌過程中液料比對(duì)淀粉、總異黃酮收率的影響。從圖3可以看出，在沖洗過程中，隨著液料比增大，淀粉收率也提高，當(dāng)液料比大于 6 mL ∶ 1 g 時(shí)，淀粉收率的變化不明顯，即吸附在殘?jiān)系牡矸垡呀?jīng)被水沖洗干凈;在洗滌過程中，當(dāng)液料比≥3 mL ∶ 1 g時(shí)，總異黃酮收率基本保持不變。由于水量增加時(shí)，會(huì)導(dǎo)致企業(yè)的生產(chǎn)成本增加和排放水處理工作量增大，因此，綜合考慮后選擇的液料比為6 mL ∶ 1 g。

2.3 正交試驗(yàn)

為了進(jìn)一步優(yōu)化勻漿法提取淀粉、總異黃酮的條件，對(duì)勻漿過程中的液料比、洗滌過程中液料比及勻漿時(shí)間進(jìn)行3因素3水平的L9（33）正交試驗(yàn)。從表2可見，3個(gè)因素對(duì)淀粉收率影響的排序?yàn)锽（洗滌液料比）>C（勻漿時(shí)間）>A（勻漿用液料比）。對(duì)于總異黃酮的收率而言，勻漿液料比的影響最大。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，以2年生栽培粉葛為原料，用勻漿法提取淀粉的最佳工藝條件為A3B2C1，即勻漿用液料比為8 mL ∶ 1 g，洗滌液料比為6 mL ∶ 1 g，勻漿時(shí)間為30 s;用勻漿法以水為溶劑提取總異黃酮的最佳工藝條件為A1B3C2，即勻漿用液料比為 5 mL ∶ 1 g，洗滌過程中的液料比為 7 mL ∶ 1 g，勻漿時(shí)間為60 s。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

由于葛根淀粉生產(chǎn)中的總異黃酮僅為回收利用，故按上述淀粉提取的優(yōu)選條件進(jìn)行3個(gè)平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，3次平行試驗(yàn)中，淀粉收率分別為18.29%、18.77%、17.69%，平均值為（18.58±0.26）%（n=3，RSD=1.38%），此時(shí)總異黃酮在水中的溶出率分別為1.54%、1.44%、1.50%，平均值為（1.49±0.05）%（n=3，RSD=3.37%）。說明用優(yōu)選條件提取葛根淀粉是可行的，同時(shí)對(duì)總異黃酮的溶出效果也是穩(wěn)定的。

2.5 勻漿提取液中總異黃酮的回收

沉降分離淀粉后，水中含有較高含量的葛根素及其他異黃酮，其中葛根異黃酮具有重要的生物活性，用途廣泛，而葛根素已被廣泛應(yīng)用于生物制藥中。因此，將工業(yè)生產(chǎn)過程中沉降淀粉后的水直接排放，不僅會(huì)污染環(huán)境，而且會(huì)造成異黃酮資源的巨大浪費(fèi)。本研究用D101大孔樹脂吸附排放水中的異黃酮，再用6 BV的70%乙醇以1.0 BV/h的流速洗脫吸附在樹脂上的異黃酮，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收洗脫液中的乙醇至干，得到葛根總異黃酮樣品。用UV比色法分析樣品中的總異黃酮含量，結(jié)果表明，D101大孔樹脂對(duì)葛根總異黃酮的動(dòng)態(tài)飽和吸附容量可達(dá)到30.12 mg/mL，70%乙醇的洗脫率達(dá)到86.89%，樣品中的總異黃酮含量可達(dá)50.91%。

采用HPLC法檢測(cè)并分析用大孔樹脂富集回收所得總異黃酮樣品中的葛根素含量，用HPLC法對(duì)葛根素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品（保留時(shí)間為11.63 min）及總異黃酮樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。如圖4所示，葛根素質(zhì)量濃度（x）在1.747～57.576 mg/L范圍內(nèi)時(shí)，與積分面積（y）具有良好線性關(guān)系：y=29 348.4x-841.565，r2=0.999 6（n=7）。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，用D101大孔樹脂富集回收得到的總異黃酮樣品中葛根素的含量為28.77%。

3 討論

通過單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)勻漿法提取葛根淀粉及其總異黃酮的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并用大孔吸附樹脂富集了勻漿提取液中的總異黃酮。結(jié)果表明，在勻漿液料比為8 mL ∶ 1 g、洗滌液料比為 6 mL ∶ 1 g、勻漿時(shí)間為30 s的條件下提取淀粉，淀粉收率為（18.58±0.26）%（n=3，RSD=1.38%），此時(shí)總異黃酮的溶出率為（1.49±0.05）%（n=3，RSD=3.37%）。D101大孔樹脂對(duì)葛根總異黃酮的動(dòng)態(tài)飽和吸附容量可達(dá)到30.12 mg/mL，70%乙醇的洗脫率達(dá)到86.89%。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收洗脫液中的乙醇至干，所得樣品中的總異黃酮含量可達(dá)到50.91%（UV比色法），葛根素含量為28.77%（HPLC法）。

葛根為常用中藥材，葛根素在臨床上用于治療心腦血管等疾病，主要藥用成分為葛根素等異黃酮類化合物，此外葛根中還有高含量的淀粉。葛根對(duì)生長(zhǎng)的環(huán)境要求不高，耐貧瘠，耐干旱，適合在山區(qū)種植。近年來(lái)，葛根種植與淀粉加工已經(jīng)成為山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的一條重要途徑。一些地區(qū)小型淀粉加工廠多，在技術(shù)上僅利用了葛根淀粉，這不僅造成葛根素等異黃酮資源的巨大浪費(fèi)，而且在葛根淀粉加工過程中排放的水也對(duì)環(huán)境造成了較為嚴(yán)重的污染。因此，中小型葛根加工企業(yè)可以在生產(chǎn)實(shí)際中大力推廣采用勻漿法優(yōu)化后的葛根淀粉提取工藝，同時(shí)利用大孔吸附樹脂富集回收其水提液中總異黃酮的方法。這一生產(chǎn)工藝既符合國(guó)家的綠色發(fā)展戰(zhàn)略，又可以高效合理利用葛根資源，不僅能夠從生產(chǎn)源頭防止企業(yè)對(duì)環(huán)境造成污染，而且可以為企業(yè)增加經(jīng)濟(jì)收益。

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