摘要：采用紫外線誘導和化學誘變相結合的方法，對生防木霉T11菌株進行選育得到T11-5-2變異菌株。該菌株在多菌靈濃度為100 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中，于25 ℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，用HPLC-MS檢測顯示，處理 2 d 的培養(yǎng)液中檢測出多菌靈和3種代謝產(chǎn)物;處理5 d的培養(yǎng)液經(jīng)檢測未發(fā)現(xiàn)多菌靈和代謝產(chǎn)物;以玉米秸稈為原料，在溫度為 25 ℃ 條件下固體發(fā)酵6 d，制成生物修復劑。該修復劑可有效降解5種常用農藥，并對黃瓜灰霉病的活體防治效果達到79.5%，優(yōu)于化學農藥多菌靈。

關鍵詞：溫室大棚;木霉;生物修復;代謝物;多菌靈

由于溫室大棚的不易遷移和常年重茬種植同一種作物，土壤中大量土傳病原菌滋生繁殖，易引發(fā)植物病害。而病害的頻繁發(fā)生，又促使農民用藥次數(shù)增加，致使土壤中農藥殘留升高，形成惡性循環(huán)，導致棚內土壤生態(tài)平衡受到嚴重破壞。筆者對蔬菜大棚內土壤采用多點采樣進行檢測分析，然后與同一地未建大棚的耕地土壤檢測數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)棚內土壤中的農藥殘留量是非大棚耕地的3.6倍，而細菌、放線菌、霉菌等微生物種群卻減少4～6倍。可見，化學農藥的大量、重復使用，使土壤中的農藥殘留量大幅增加，不僅使生產(chǎn)的農產(chǎn)品殘留超標，而且還破壞了土壤的微生態(tài)平衡，導致微生物數(shù)量大幅減少。隨著人們生活水平的提高，對食品安全和環(huán)境安全也提出了更高要求。無藥物殘留、無副作用的綠色農副產(chǎn)品越發(fā)受到人們青睞。因此，對溫室大棚內的土壤進行生物修復意義重大。目前，國內外對多菌靈降解菌的研究多集中于細菌，且均為液體降解研究[1-9]。

木霉（Trichoderma sp.）T11菌株，是筆者所在實驗室分離出的高效生防真菌菌株，對灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、鐮刀菌（Fasarium spp.）等多種土傳病原菌具有良好的抑制作用;通過藥物馴化、紫外線誘導和化學誘導相結合的方法，對篩選出的生防木霉T11菌株進行改良，得到T11-5-2木霉變異菌株。使其在保持對多種病原菌有良好拮抗性的同時，對速克靈、多菌靈等化學農藥殘留有顯著的降解效果，可使生產(chǎn)的蔬菜等農產(chǎn)品有害殘留量大幅降低，達到綠色食品標準。農藥殘留被降解為二氧化碳和水，對環(huán)境不會造成二次污染，同時，還可以防治農作物灰霉病、枯萎病、霜霉病等常見和多發(fā)病害，使土壤修復、農藥殘留降解和土傳病害的防治有機結合，從而大幅提高勞動生產(chǎn)效率、降低成本，有效提高大棚蔬菜的經(jīng)濟效益，有較高的應用前景和推廣價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料主要有木霉（Trichoderma sp.）T11降解菌株，由筆者所在實驗室在農藥廠土壤中分離、選育得到;50%多菌靈可濕性粉劑，由江蘇靖江農藥廠提供;馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15 g瓊脂，1 000 mL水，pH值自然;PDA藥物培養(yǎng)基：把PDA培養(yǎng)基熔化后，加入一定量多菌靈粉劑混合均勻后倒入平板制得;無機鹽培養(yǎng)基：5.710 g K2HPO4，1.700 g KH2PO4，2.630 g（NH4）2SO4，0.095 g MgSO4·7H2O，0.050 g MnSO4，0.05 g FeSO4，0.003 g CaCl2，1 000 mL 水，pH值為7.0;甲基磺酸乙酯（ethylmethylsulfone，簡稱EMS），由上海艾研生物科技有限公司提供。

1.2 紫外線多重誘導及藥物馴化處理

在接種木霉菌株T11于25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d的PDA培養(yǎng)基平板上，加入50 mL無菌水，輕輕洗刷綠色分生孢子，制成107個/mL孢子懸浮液。在含多菌靈 10 mg/L 的PDA藥物培養(yǎng)基上涂抹0.1 mL上述孢子懸浮液。去蓋在20 W、波長為253.7 nm的紫外燈管下30 cm處，避光照射后立即用黑紙包好，放入25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每次照射時間為 60 min。每個處理重復3次。統(tǒng)計平板上菌落數(shù)并將其轉接到含10 mg/L多菌靈的PDA藥物培養(yǎng)基上。選取生長迅速的變異木霉菌株，待產(chǎn)生大量綠色分生孢子后，再按上述方法配制孢子懸浮液，涂抹在含 20 mg/L 多菌靈PDA藥物培養(yǎng)基上，進行第2次紫外線重復誘導和馴化處理。依此類推，逐步提高多菌靈濃度達到1 500 mg/L，獲降解性變異菌株T11-5。

1.3 化學誘導處理

在接種木霉菌株T11-5于25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d的PDA培養(yǎng)基平板上，刮取少量綠色分生孢子，用無菌生理鹽水和0.1 mol/L磷酸鉀緩沖溶液（pH值為5.0）各洗滌1～2次后，將洗好的T11-5菌株分生孢子懸浮于含有10 g/L甲基磺酸乙酯的磷酸鉀溶液（pH值=5.0）中，25 ℃振蕩處理1～2 h。取 10 mL 處理后的懸液用0.16 mol/L硫代硫酸鈉溶液稀釋10倍終止反應，離心收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌后，加入無菌水，制成107個/mL孢子懸浮液，取0.1 mL上述孢子懸浮液均勻涂在PDA培養(yǎng)基平板上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，從平板上挑取菌落較大的進行純化。最后得到能在多菌靈濃度達到 2 000 mg/L 的PDA平板上良好生長的變異菌株T11-5-2。

1.4 菌株T11-5-2對多菌靈降解

在無機鹽培養(yǎng)基中加入100 mg/L多菌靈，以5%接種量接入木霉T11-5-2種子液，于25 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)。2、5 d后分別取樣1次，用液相色譜-質譜聯(lián)用技術（HPLC-MS）檢測培養(yǎng)液中多菌靈及代謝產(chǎn)物含量[10]。

1.5 對其他幾種常用農藥的降解

在pH值為6.0的無機鹽培養(yǎng)基中分別加入100 mg/L多菌靈、速克靈、撲海因、甲基托布津、三唑酮，以5%接種量接入種子液，于25 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)5 d，取樣分別測定各自農藥的殘留量[11]并計算降解率。每個處理重復3次。

1.6 制備種子液

液體培養(yǎng)基：8～10 mL馬鈴薯浸出液，0.2～0.4 g （NH4）2SO4，0.2～0.3 g K2HPO4，1 g CaCO3，補加水至1 000 mL，調節(jié)pH值至6.0～6.5。取上述培養(yǎng)液100 mL，高壓滅菌20～30 min。冷卻后接入已活化好的木霉菌T11-5-2菌株，于25～26 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，用分光光度計測量D600 nm達到0.30～0.35 停止液體發(fā)酵。發(fā)酵液作為種子液備用。

1.7 固體發(fā)酵

固體培養(yǎng)基：10 g玉米秸稈粉（粉碎至30～40目），3 g麩皮，0.8～0.9 g葡萄糖，0.20～0.40 g（NH4）2SO4，0.10～0.20 g KH2PO4，0.08～0.10 g MgS04·7H2O，1 000 mL水，調節(jié)pH值至6.0～6.5。高壓滅菌30 min，冷卻后接入上述T11-5-2菌株種子液100～130 mL，攪拌均勻，放在25～26 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，用血球計數(shù)板測量固體發(fā)酵物的分生孢子量達到1010 個/g，即可結束固體發(fā)酵出料，常溫風干或使用真空干燥器控制溫度在45 ℃左右干燥。即可得到復合生物修復劑。

1.8 生物防效試驗

經(jīng)過固體培養(yǎng)基發(fā)酵獲得木霉T11-5-2菌株分生孢子粉，把孢子粉和多菌靈可濕性粉劑用無菌水稀釋800倍，各取一定量藥液與等量灰霉菌孢子懸浮液（孢子濃度為105個/mL）混合均勻，然后噴施在盆栽黃瓜苗上。每盆種植8株津青1號黃瓜，每株留3片復葉，用藥10 mL/株。并噴施等量無菌水作空白對照。于20 ℃恒溫保濕3 d，調查葉片發(fā)病情況，計算發(fā)病率和防治效果。每個處理4盆，重復3次。

發(fā)病率=感病株數(shù)/總株數(shù)×100%;? 防治效果=（對照發(fā)病率-用藥發(fā)病率）/對照發(fā)病率×100%。

2 結果與分析

2.1 菌株T11-5-2對多菌靈的降解試驗

對處理多菌靈2 d的培養(yǎng)液采用HPLC-MS分析，結果出現(xiàn)4個峰（圖1），結合相應的質譜分析認為，代謝產(chǎn)物A為2-氨基苯腈、B為2-氨基苯并咪唑、C為苯并咪唑、D為未降解的殘留多菌靈，保留時間分別為1.42、1.81、2.42、3.14 min。而在對T11-5-2菌株處理多菌靈5 d的培養(yǎng)液進行HPLC-MS分析時，卻未再檢測出代謝產(chǎn)物和多菌靈殘留（圖2）。說明T11-5-2菌株5 d已完全降解100 mg/L的多菌靈，且經(jīng)過10次繼代轉接后降解效果仍較穩(wěn)定。

對多菌靈經(jīng)過5 d處理，通過HPLC-MS分析，已經(jīng)檢測不到多菌靈及其降解物的存在，已經(jīng)被徹底轉化為成二氧化碳和水，對環(huán)境不會產(chǎn)生二次污染。

2.2 對其他幾種常用農藥的降解

由圖3可知，降解菌對速克靈、多菌靈的降解率分別高達98.1%、90.4%，對撲海因、甲基托布津、三唑酮的降解率分別達到86.5%、40.1%、55.3%。表明該降解菌株對5種不同類型的化學農藥均具較好的降解作用，表明T11-5-2菌株具有較廣泛的降解能力，這在降解菌的研究中還未見報道過。

由于農作物病害種類繁多，施用1種農藥已不能完全達到防病效果，為保證穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)，往往會在田間施用多種農藥，因此降解菌株能夠對多種農藥具有降解特性是十分必要且應用價值極高的。

2.3 生物防效試驗

試驗前應把盆栽黃瓜用水澆透，然后噴施各處理800倍藥液。于20 ℃恒溫保濕處理3 d，調查感病葉片數(shù)。

活體拮抗性試驗結果（表1）表明，木霉菌對黃瓜灰霉病的防治效果可達到79.5%，優(yōu)于化學農藥多菌靈的防治效果（71.7%），且差異明顯。這充分表明木霉T11-5-2菌株除具有良好的降解效果外，還具有優(yōu)良的對土傳病害防治效果。

3 結論

通過藥物馴化、紫外線誘導、化學誘導相結合的方法，人工選育出木霉變異菌株T11-5-2，在多菌靈濃度為100 mg/L條件下，于25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，可完全降解多菌靈。以玉米秸稈為主要原料，通過固體發(fā)酵6 d，制備的修復劑分生孢子數(shù)達到1.4×1010 CFU/g。木霉菌株T11-5-2對濃度為 100 mg/L 的速克靈、多菌靈、撲海因、三唑酮、甲基托布津在最適條件下處理5 d，降解率分別達到 98.1%、90.4%、86.5%、55.3%、40.1%。木霉菌對黃瓜灰霉病的防治效果可達到79.5%，優(yōu)于化學農藥多菌靈的防治效果（71.7%），且差異明顯。

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