張婷婷，蔡小姚，滕 麗，3，劉紅美，尚小麗*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

真菌病毒是指可以侵染絲狀真菌、酵母和卵菌，并能在其中復(fù)制的病毒。在植物病原真菌中存在著大量的真菌病毒[1-3]。大多數(shù)情況下，真菌病毒感染寄主表現(xiàn)為無(wú)癥狀，通常稱為潛伏或隱性感染。此外，研究表明，大多數(shù)真菌病毒是雙鏈RNA(dsRNA)病毒。目前，具有dsRNA基因組的真菌病毒主要由6個(gè)科[呼腸孤病毒科(Reoviridae)、全病毒科(Totiviridae)、雙分病毒科(Paritiviridae)、產(chǎn)黃青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分體病毒科(Quadriviridae)、巨型雙節(jié)段病毒科(Megabirnaviridae)]和最近提出的Botybirnaviridae家族組成。現(xiàn)已將全病毒科家族中的病毒分為5個(gè)屬：全病毒屬(Totivirus)、維多利亞屬(Victorivirus)、梨形鞭毛蟲(chóng)病毒屬(Giardiavirus)、滴蟲(chóng)病毒屬(Trichomonasvirus)和利什曼原蟲(chóng)病毒屬(Leishmaniavirus)[4]。其中，全病毒屬和維多利亞屬的病毒主要感染真菌，而滴蟲(chóng)病毒屬、梨形鞭毛蟲(chóng)病毒屬和利什曼原蟲(chóng)病毒屬則常存在于原生動(dòng)物中[5]。最近又提出了另外兩個(gè)屬，分別為感染魚(yú)類(lèi)和節(jié)肢動(dòng)物的Artivirus屬[6]和感染昆蟲(chóng)的Insevirus屬[7]。Rhodosporidiobolusodoratus是Rhodosporidiobolus屬的一個(gè)新種，首次從不同樹(shù)種(楓木、檸檬、平面和玉米)的葉狀平面中分離到(以前稱為Sporobolomycesodoratus)[8]。近年，從葡萄、葡萄汁或葡萄酒中也分離出擬酵母形態(tài)的Rhodosporidiobolusodoratus[9]。

油茶是一種起源于中國(guó)的獨(dú)特油種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其衍生物廣泛用于化學(xué)工業(yè)、食品、飼料等工業(yè)[10]。但是，隨著自然生態(tài)環(huán)境的變化，油茶的病害明顯，嚴(yán)重影響其利用價(jià)值。油茶具有多種病害，其中油茶葉腫病又名茶餅病、葉枯病，主要危害油茶花芽和葉芽，該病害在我國(guó)絕大多數(shù)油茶基地普遍發(fā)生。葉腫病通常以油茶幼葉的部分或完整葉片腫大成變態(tài)葉為基本特征，俗稱茶耳、茶片和木子耳；或使頂芽腫大變形為空心泡狀的變態(tài)芽，俗稱茶泡或茶苞[11-12]。油茶葉腫病是由細(xì)麗外擔(dān)菌[Exobasidiumgracile(Shirai)Syd]侵染油茶幼芽和幼葉引起的真菌性病害，病原菌感染油茶幼嫩的花芽和葉芽后，促進(jìn)油茶的組織增生、細(xì)胞膨大而成為變態(tài)芽和變態(tài)葉，導(dǎo)致葉片干枯脫落，已經(jīng)嚴(yán)重影響到油茶的種植和生產(chǎn)[13-14]。因此，筆者首次從油茶的茶耳表面分離出了Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017，而且檢測(cè)出其攜帶真菌病毒。在此基礎(chǔ)上，側(cè)重于獲取Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017中攜帶的真菌病毒的全基因組序列，并且對(duì)其進(jìn)行基因組解析，從而明確病毒的分類(lèi)學(xué)地位。并將此病毒命名為RhodosporidiobolusodoratusTotivirus1 (RoTV1)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017從油茶茶耳表面上分離得到，長(zhǎng)期保存于-80℃。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNase I酶、S1 Nuclease酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Klenow酶、pMD18-T載體、T4RNA連接酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；2×PCR mix購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；電泳儀，北京六一公司；凝膠成像儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；恒溫振蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；PCR儀，美國(guó)ABI公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，切片，用去離子水1.4 L煮沸，過(guò)濾，量取1 L浸出液，加入葡萄糖20 g，瓊脂15 g，121℃恒溫高壓濕氣滅菌20 min。LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 L，121℃恒溫高壓濕氣滅菌20 min。

1.1.4 引物設(shè)計(jì) 試驗(yàn)引物由武漢天一輝遠(yuǎn)公司合成，引物及序列詳見(jiàn)表1。

1.2 dsRNA的獲取

將目的菌株接種至加有玻璃紙的PDA平板上，恒溫培養(yǎng)箱中28℃擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌株完全生長(zhǎng)后撕下玻璃紙放入研缽中，用液氮將其研磨成粉末狀，取約0.5 g裝入2.0 mL 離心管中。將0.6 mL 2×GPS、0.6 mL苯酚、0.6 mL氯仿∶異戊醇(24∶1)和138 μL 10% SDS依次加入樣品中，室溫下充分震蕩，12 000 r/min離心10 min。將0.04 g無(wú)離子纖維素粉末(CF-11)放入無(wú)菌2.0 mL 離心管中，取0.6 mL上清液緩慢移入管中，并且每0.6 mL上清液加114 μL無(wú)水乙醇，混勻后4℃冰浴過(guò)夜。然后離心機(jī)12 000 r/min離心5 min后棄上清，倒扣濾紙上吸干殘液，移液器加入0.6 mL清洗

表1 試驗(yàn)引物設(shè)計(jì)

緩沖液，混勻后靜置1 min；重復(fù)洗脫3次，加入640 μL 1× STE，混合搖勻，12 000 r/min離心8 min后吸取0.6 mL上清至1.5 mL的離心管，加入60 μL的3 mol/L 醋酸鈉(pH 5.2)，0.6 mL的異丙醇(或1.2 mL無(wú)水乙醇)，混勻，-20℃下預(yù)沉淀2 h，4℃離心機(jī)12 000 r/min離心30 min，去除上清液，沉淀用500 μL 75%酒精進(jìn)行洗脫，12 000 r/min，4℃，離心5 min，瀝干上清液，并在37℃恒溫箱中干燥待其酒精揮發(fā)干凈，用20 μL DEPC-H2O溶解沉淀，即為粗提的RNA樣品，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 dsRNA純化及鑒定

DNaseI酶用于鑒定提取的核酸條帶是否為DNA，S1 Nuclease酶用于鑒定提取的核酸條帶是否為ssRNA，RNase A用于鑒定所提取的樣品是否為RNA。利用DNase I酶處理樣品的PCR體系為1 μL DNase I酶、89 μL樣品、10 μL DNase I Buffer；反應(yīng)程序37℃、30 min，65℃、5 min，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL備用；利用DNase I酶處理過(guò)的樣品再用S1 Nuclease酶處理，PCR體系為0.1 μL S1 Nuclease酶、44.9 μL DNase I酶處理的樣品、5 μL S1 Nuclease酶buffer；反應(yīng)程序37℃、30 min，65℃、5 min，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL備用。另取新的樣品用RNase A處理，PCR體系為0.2 μL RNase A、4 μL樣品、1 μL RNase A Buffer、4.8 μL ddH2O；反應(yīng)37℃、30 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL備用。然后將DNase I酶、S1 Nuclease酶、RNase A處理的備用的5 μL樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 dsRNA中間序列的獲取

將經(jīng)過(guò)DNase I酶和S1 Nuclease酶處理的樣品用清潔回收試劑盒回收，所得的樣品通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)后所得的cDNA樣品用Klenow Fragment酶進(jìn)行補(bǔ)平，補(bǔ)平條件為37℃、2 h，65℃、5 min，隨后將補(bǔ)平的樣品進(jìn)行PCR隨機(jī)擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃保持5 min。所得樣品通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離不同大小的隨機(jī)片段，將凝膠中750～1 000 bp的隨機(jī)片段切下，裝入離心管中，利用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收，回收的樣品過(guò)夜連接pMD18-T載體，然后從-80℃超低溫冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞放在冰上融化；取10 μL連接產(chǎn)物放入裝有25 μL感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，冰浴30 min；42℃熱激70 s，立即放置冰上冰浴5 min；每管體系加入500 μL 37℃預(yù)熱的未加Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基，放在37℃環(huán)境中200 r/min搖床中培養(yǎng)1 h；取部分菌液涂在加有Amp的LB培養(yǎng)皿上；作好標(biāo)記后放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～15 h。次日從培養(yǎng)皿中挑取20～30個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別加到有Amp的0.6 mL LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)5 h，同時(shí)對(duì)這20～30個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用通用引物M13-47和M13-48進(jìn)行PCR鑒定，PCR條件反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃保持5 min，根據(jù)凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析及拼接，獲取dsRNA中間片段。

1.5 dsRNA末端序列的獲取

RoTV1兩末端非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不能通過(guò)隨機(jī)片段擴(kuò)增得到，需在獲得RoTV1中間序列的基礎(chǔ)上在2個(gè)末端加上1個(gè)接頭引物后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，另一端再用基于已獲取的RoTV1片段，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增才能得到末端序列。即將dsRNA樣品加接頭連接，反應(yīng)體系為dsRNA14 μL，REV-anchor 2 μL，DMSO 2 μL，充分混勻94℃保持2 min后取出立刻放置冰上冰浴1 min，然后立即加入PEG4000 17 μL，10× T4RNA buffer 5 μL，RRI 2 μL，BSA 5 μL，T4RNA連接酶4 μL，混勻，16℃連接過(guò)夜。將加接頭的50 μL體系加入DEPC水補(bǔ)足600 μL，加入600 μL氯仿混勻，4℃離心機(jī)12 000 r/min離心10 min；取570 μL的上清液，加入0.1倍體積的3 mol/L 醋酸鈉以及等體積的異丙醇，-20℃下沉淀2 h；4℃離心機(jī)12 000 r/min高速離心30 min，緩慢倒掉上清，室溫晾干，加入20 μL的DEPC-H2O。取14 μL樣品用反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)，所得樣品通過(guò)設(shè)計(jì)的末端特異引物進(jìn)行PCR，PCR樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將目的片段切膠回收，連接pMD18-T載體，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液送公司測(cè)序，然后分析測(cè)序結(jié)果獲取末端序列。

1.6 序列拼接及系統(tǒng)進(jìn)化分析

序列拼接和開(kāi)放閱讀框(ORF)的預(yù)測(cè)使用DNAMAN5.0軟件；序列同源性搜索使用NCBI網(wǎng)站的在線BLAST程(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建使用最大似然法(ML)。ML樹(shù)的計(jì)算使用MEGA7.0軟件，采用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置，并以自展法(bootstraP)對(duì)ML樹(shù)進(jìn)行評(píng)估，重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析中所用的病毒如下(表2)。

表2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析所用的病毒

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株GZ2017中的真菌病毒

如圖1所示，菌株GZ2017攜帶3條清晰的病毒條帶，在4～5 kb有1條病毒條帶為dsRNA1；在1 kb左右有2條病毒條帶，分別為dsRNA2、dsRNA3。該病毒命名為Rhodosporidiobolus odoratus Totivirus 1(RoTV1)。

2.2 dsRNA真菌病毒鑒定

如圖2所示，經(jīng)DNase I酶、S1 Nuclease酶、RNase A處理粗提的樣品，DNase I酶處理后去掉了DNA條帶，RNA條帶無(wú)變化；S1 Nuclease酶處理后DNA條帶與RNA條帶無(wú)變化；RNase A處理后RNA條帶消失。表明，菌株GZ2017攜帶的真菌病毒為dsRNA真菌病毒。

2.3 RoTV1中間序列的獲取

如圖3A所示，Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017攜帶的dsRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用隨機(jī)引物RACE-3擴(kuò)增得到大量隨機(jī)片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈彌散條帶。切下750～1 000 bp的隨機(jī)片段進(jìn)行膠回收、連接、篩選得到陽(yáng)性克隆，在1%瓊脂糖凝膠上呈大小不一的單一片段(圖3B)。挑取較大的隨機(jī)片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分析后用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接。

2.4 RoTV1末端序列的獲取

如圖4所示，擴(kuò)增得到的末端序列通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(部分結(jié)果)條帶清晰。可用于下一步的回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序試驗(yàn)。

2.5 RoTV1 dsRNA1基因組序列

從Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017中提取的RhodosporidiobolusodoratusTotivirus 1(RoTV1)病毒，經(jīng)過(guò)測(cè)序得出其基因組由3個(gè)片段(dsRNA 1-3)組成，長(zhǎng)度分別為4 675 bp、1 183 bp和1 112 bp，已獲取GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)，分別為MN937194、MN937195和MN937196。dsRNA1的序列全長(zhǎng)為4 675 bp，G+C含量為53.3%。使用通用的遺傳密碼翻譯，dsRNA1基因組包含2個(gè)不連續(xù)的大的開(kāi)放閱讀框(ORF)，位于基因組正鏈

的不同框架中。dsRNA1的5′和3′非翻譯區(qū)(UTR)分別長(zhǎng)63 bp和335 bp。5′-ORF(ORF1)位于63～2 112 bp，編碼的蛋白有682個(gè)氨基酸，分子量大小是75.6 kDa。3′-ORF(ORF2)不與ORF1重疊，位于2 120～4 340 bp，編碼的蛋白有711個(gè)氨基酸，分子量大小是79.2 kDa。RoTV1的2個(gè)ORF(ORF1和ORF2)相隔92 bp。在ORF1的終止密碼子TAG(2 110 bp到2 112 bp)之間發(fā)現(xiàn)了1個(gè)潛在的移碼序列七聚體(GGATTTT，1 993～2 000 bp)(圖5)。在XdV-L1A和XdV-L1B中也發(fā)現(xiàn)了相同的移碼七聚體[15]。在這種情況下，ORF2與ORF1可能通過(guò)-1核糖體移碼機(jī)制，從63～4 341 bp處，融合成為1個(gè)大的融合蛋白(Gag-Pol蛋白)。

2.6 RoTV1 dsRNA2、dsRNA 3基因組序列

dsRNA2和dsRNA3的全長(zhǎng)分別是1 183 bp和1 112 bp。經(jīng)DNAMAN分析，在dsRNA2和dsRNA3中未發(fā)現(xiàn)編碼有意義的大ORF，只發(fā)現(xiàn)dsRNA2和dsRNA3編碼的小ORF。對(duì)dsRNA2和dsRNA3編碼的小ORF進(jìn)行BLASTp分析顯示，無(wú)任何已知的蛋白質(zhì)與dsRNA2和dsRNA3的小ORF編碼的蛋白質(zhì)有相似性。此外，使用不同濃度的環(huán)己酰亞胺處理Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017時(shí)發(fā)現(xiàn)，dsRNA2和dsRNA3不會(huì)丟失，也不能跟dsRNA1分開(kāi)(圖6)。因此，可以看出dsRNA1，dsRNA2，dsRNA3在菌株GZ2017中非常穩(wěn)定和相互依賴，推測(cè)dsRNA2和dsRNA3可能是dsRNA1的衛(wèi)星RNA(SatRNA)。

2.7 基于RoTV1的RdRp區(qū)域構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

由圖7可見(jiàn)，根據(jù)RoTV1和選擇20種病毒RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)構(gòu)建RoTV1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，RoTV1與Totiviridae科Totivirus屬的XdV-L1B、XdV-L1A、RPaTV3、BrV-F、ScV-L-A、TaV1聚成一簇，與其他病毒相距較遠(yuǎn)。因此，從RoTV1的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)系統(tǒng)進(jìn)化的角度證實(shí)了RoTV1是Totiviridae科Totivirus屬的新成員。

2.8 基于RoTV1的CP區(qū)域構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

由圖8可見(jiàn)，根據(jù)RoTV1和選擇20種RNA病毒的外殼蛋白(CP)構(gòu)建RoTV1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，RoTV1與Totiviridae科Totivirus屬的XdV-L1B，XdV-L1A，RPaTV3聚成一簇，與其他病毒相距較遠(yuǎn)。因此，從RoTV1的外殼蛋白(CP)系統(tǒng)進(jìn)化的角度再次證實(shí)了RoTV1是Totiviridae科Totivirus屬的新成員。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017攜帶的真菌病毒RoTV1的研究得知，真菌病毒RoTV1含有3條病毒條帶，分別為dsRNA1、dsRNA2和dsRNA3。在獲取RoTV1的dsRNA1、dsRNA2和dsRNA3全基因組序列后，對(duì)dsRNA1進(jìn)行序列分析得知，含2個(gè)閱讀框分別為ORF1和ORF2，對(duì)ORF1和ORF2進(jìn)行BLASTp比對(duì)顯示，分別與Totiviridae科Totivirus屬病毒的外殼蛋白(CP)和RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)具有相似性。

對(duì)RoTV1的dsRNA2和dsRNA3進(jìn)行序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)無(wú)編碼大的閱讀框，對(duì)其編碼的小閱讀框進(jìn)行BLASTp比對(duì)也未發(fā)現(xiàn)任何同源蛋白。另外，使用不同濃度的環(huán)己酰亞胺(Cycloheximide)處理Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017時(shí)發(fā)現(xiàn)，即不能丟失dsRNA1、dsRNA2和dsRNA3，也不能將dsRNA1與dsRNA2和dsRNA3分開(kāi)。因此，可以看出dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3在菌株GZ2017中非常穩(wěn)定和相互依賴，推測(cè)dsRNA2和dsRNA3可能是dsRNA1的衛(wèi)星RNA(SatRNA)。

本研究首次從油茶茶耳表面分離出Rhodosporidiobolusodoratus菌株，而且發(fā)現(xiàn)其攜帶真菌病毒RoTV1。在成功獲得RoTV1的全基因組序列后，并對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，明確了真菌病毒RoTV1的分類(lèi)學(xué)地位，在后續(xù)的研究中計(jì)劃獲取Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017的脫毒菌株(RoTV1-)，將RoTV1-與未脫毒菌株(RoTV1+)同時(shí)培養(yǎng)，檢測(cè)兩者在生長(zhǎng)速度、表型，次級(jí)代謝產(chǎn)物的異同，從而初步了解RoTV1的存在是否對(duì)其寄主有影響。