楊俊蕓，劉起軍

（1.四川省內(nèi)江市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川內(nèi)江641000；2.四川恒通動(dòng)保生物科技有限公司研究院，四川內(nèi)江 641000）

蓮黃顆粒收載于 《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)·中藥卷》（2017版），是由穿心蓮、黃芩等8味中藥組方，經(jīng)提取加工制成的顆粒劑，具有清熱燥濕，涼血止痢功效，用于治療雞的熱毒下痢[1]。該制劑盡管在我國(guó)有多家獸藥企業(yè)申報(bào)文號(hào)，產(chǎn)品也具有較廣泛的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)且積累了諸多經(jīng)驗(yàn)，然而我們卻很少見(jiàn)到關(guān)于該制劑的相關(guān)研究論文。為了更好地確定該產(chǎn)品的臨床定位，我們采用實(shí)驗(yàn)臨床試驗(yàn)方法，采用致病性大腸桿菌造模，觀察了蓮黃顆粒治療雞大腸桿菌病的有效性與安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品

蓮黃顆粒，由四川恒通動(dòng)保生物科技有限公司中試生產(chǎn)，批號(hào)為20190701。每1g相當(dāng)于原生藥1.26g。規(guī)格：100g/袋。

氟苯尼考粉，河南省天億源動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格100g，批號(hào)19062401。

1.1.2 菌株及標(biāo)準(zhǔn)血清

大腸桿菌O78株與大腸桿菌“O”抗原定型血清，購(gòu)自中國(guó)獸藥品監(jiān)察所。

1.1.3 其它試劑及主要儀器

普通肉湯培養(yǎng)基 （產(chǎn)品批號(hào)：20190614）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（產(chǎn)品批號(hào)：20190708），購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TGL-16B型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限責(zé)任公司；智能蒸汽滅菌器，長(zhǎng)春市百奧生物儀器有限責(zé)任公司；HZQ-C02型空氣浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏檢測(cè)儀：BDPhoenixTMSystem，型號(hào) ：PhoenixTM100，BD （Becton and Dickinson Company）公司。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

未經(jīng)雞大腸桿菌疫苗免疫的1日齡健康海蘭褐公雛，從長(zhǎng)春市農(nóng)科院飼養(yǎng)場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。飼養(yǎng)至12日齡時(shí)隨機(jī)抽取30只，分別采血并從泄殖腔取排泄物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，用抗大腸桿菌O78的標(biāo)準(zhǔn)血清作玻片凝集反應(yīng)，確認(rèn)試驗(yàn)雞群中不存在雞大腸桿菌O78感染。并且每天觀察記錄雞群健康狀況，確認(rèn)無(wú)疫病發(fā)生。

1.1.5 飼料及試驗(yàn)雞飼養(yǎng)管理

雛雞無(wú)抗生素添加的全價(jià)飼料，四川簡(jiǎn)陽(yáng)佳旺飼料有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)雞飼養(yǎng)在本研究院動(dòng)物中心雞舍，自由采食與飲水。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌O78株復(fù)壯

選4日齡健康海蘭褐雞3只，胸肌注射0.2 ml菌液方式進(jìn)行 （平板計(jì)數(shù)確定為1010cfu/ml）。隔離飼養(yǎng)，待典型癥狀出現(xiàn)后，無(wú)菌采集病雞的肝、脾組織或心包內(nèi)分泌物，分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂、麥康凱瓊脂和伊紅美蘭瓊脂上，經(jīng)37℃培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)的細(xì)菌菌落形態(tài)，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢、觀察結(jié)果。

1.2.2 病原分離與鑒定

無(wú)菌操作采取瀕死雞肝臟、脾臟、心臟及心包液等，做病料觸片及染色鏡檢。

將病料接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，37℃，24h后觀察肉湯變化。

采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏檢測(cè)儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定。取1個(gè)或幾個(gè)菌落于0.85%NaCl基物安培管，用ATB麥?zhǔn)媳葷峁苤苽浠鞚岫认喈?dāng)于0.5 McFarland（1McFarland相當(dāng)于含細(xì)菌3×108個(gè)/ml）的菌懸液，用定量連續(xù)ATB接種器于ID32E試驗(yàn)條每孔接種55μl菌懸液。在ADH、LDC、URE、LARL、GAT、5KG孔中滴2滴礦物油， 蓋上蓋子，37℃好氧培養(yǎng)18～24h后，在吲哚反應(yīng)孔中加1滴James試劑，用ATB分析儀讀取結(jié)果并用相應(yīng)軟件分析。

血清型鑒定按中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所《大腸埃希氏菌“O”抗原定型血清使用說(shuō)明書(shū)》進(jìn)行。

1.2.3 大腸桿菌計(jì)數(shù)及感染液制備

挑取斜面保存的大腸桿菌O78，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h，將菌液5000r/min離心15min，棄上清液，沉淀用0.05mol/L的PBS（pH7.2）洗滌兩次，按照倍比稀釋法，依次配制稀釋度為10-2～10-9的菌懸液。采用10-4～10-9稀釋度的菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)。分別移取不同稀釋度的菌液0.1mL，均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂平板上，靜置20～30min，使菌液滲透于培養(yǎng)基內(nèi)，然后將培養(yǎng)皿倒轉(zhuǎn)，37℃培養(yǎng)16h后計(jì)數(shù)，每個(gè)濃度重復(fù)4次。用PBS液調(diào)整至1×1010cfu/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 試驗(yàn)雞分組與處置

將供試雞隨機(jī)分為7組，每組80只，如表3-1所示。9日齡時(shí)，中藥預(yù)防組開(kāi)始給藥，到12日齡時(shí)，除健康對(duì)照組外每只雞胸肌注射大腸桿菌培養(yǎng)液攻毒0.2ml(攻毒濃度為3.5×109cfu/ml)。各組動(dòng)物按表3-1進(jìn)行處置，為準(zhǔn)確把握給藥劑量，采用灌胃方式給藥，各組不同劑量的藥物溶解成同體積灌胃。

表3-1試驗(yàn)雞分組與處置

1.2.5 臨床判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5.1 感染發(fā)病 健康對(duì)照組精神活潑，行為、飲食欲正常。與此相對(duì)應(yīng)，雛雞接種大腸桿菌后呈現(xiàn)精神沉郁，蹲伏扎堆，不欲飲食等明顯臨床癥狀；無(wú)菌采集心血、肝臟或氣囊等，能分離到大量與攻毒菌株相同血清型大腸桿菌者判定為感染發(fā)病。

發(fā)病率(%)=組內(nèi)發(fā)病數(shù)（只）/該組試驗(yàn)雞數(shù)（只）×100%

保護(hù)率(%)=（攻毒對(duì)照組發(fā)病率－給藥組發(fā)病率）/攻毒對(duì)照組發(fā)病率×100%。

1.2.5.2 感染死亡 試驗(yàn)期間，雞在接種大腸桿菌后突然死亡或出現(xiàn)明顯大腸桿菌病臨床癥狀后死亡，剖檢可見(jiàn)多數(shù)具有大腸桿菌病內(nèi)臟器官病變，并從肝臟、心血或氣囊等分離等到與接種菌相同的大腸桿菌者判定為感染死亡。

感染死亡率(%)=組內(nèi)死亡數(shù)(只)/該組試驗(yàn)雞數(shù)(只)×100%

1.2.5.3 治愈 發(fā)病雞經(jīng)治療后精神狀態(tài)、飲食欲、糞便恢復(fù)正常，其它臨床癥狀消失，抽查剖檢內(nèi)臟器官正常，從肝臟、心血或氣囊等分離不到與接種菌相同的大腸桿菌者判定為治愈。治愈率(%)=組內(nèi)治愈數(shù)(只)/該組試驗(yàn)雞發(fā)病數(shù)(只)×100%

1.2.5.4 增重 稱量試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)雞的體重，觀察試驗(yàn)雞體重變化情況，為盡量減少試驗(yàn)雞抓捕應(yīng)激，僅稱量各組平均體重。

增重率 (%)=組內(nèi)最終平均體重－初始平均體重/初始平均體重×100%

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS19.0軟件對(duì)蓮黃顆粒用于人工感染雞大腸桿菌病各組雞的發(fā)病率、病死率、治愈率采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；對(duì)蓮黃顆粒對(duì)各組試驗(yàn)雞增重的影響結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 人工感染發(fā)病情況

按照預(yù)備臨床試驗(yàn)的攻菌劑量和造模條件，給12日齡雞胸肌注射大腸桿菌培養(yǎng)液0.2ml攻毒(攻毒濃度為3.5×109cfu/ml)，成功造成了雞大腸桿菌病模型。試驗(yàn)雞攻菌3h后，各組雞開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病，最初出現(xiàn)精神沉郁，食欲減損，活動(dòng)減少，蹲伏或擁擠扎堆。試驗(yàn)雞攻菌4h后，除中藥預(yù)防組僅有少數(shù)雞只發(fā)病外，其余各組全部發(fā)病。此后病雞精神萎靡，閉目呆立，或扎堆而臥，羽毛蓬亂，飲、食欲大減，排污黃色或黃綠色稀便；部分雞呼吸困難，張口伸頸，氣促喘粗；有的雞站立不穩(wěn)，腿翅無(wú)力，或癱軟臥地。攻菌6h后開(kāi)始有雞死亡，10h死亡數(shù)增加，24-48h達(dá)死亡高峰，72h后死亡明顯減少。各組雞發(fā)病和死亡情況見(jiàn)表 3-3、3-4。

2.2 病理變化

病死雞肛門(mén)及其周?chē)鹈掣郊S污，早期死亡雞僅見(jiàn)急性敗血癥病變，中后期死亡病雞出現(xiàn)典型的心包炎、肝周炎、氣囊炎，少數(shù)可見(jiàn)關(guān)節(jié)炎病變。心包腔積有淡黃色渾濁滲出液，心包壁增厚，不透明，附著纖維素性滲出物，少數(shù)雞只甚至可見(jiàn)黃色干酪樣物質(zhì)，心臟腫大，心肌有壞死灶；肝臟腫大，肝臟表面覆蓋灰白色纖維素性滲出物，容易剝離，肝實(shí)質(zhì)偶有灰色壞死區(qū)；腎臟腫大充血；氣囊壁混濁，不均勻增厚，呼吸面被覆干酪樣滲出物；嗉囊內(nèi)容物充實(shí)，酸臭氣味濃烈；腺胃、肌胃內(nèi)容物有酸臭氣味，腺胃黏膜糜爛，肌胃角質(zhì)層潰瘍，有斑點(diǎn)狀出血；十二指腸、空腸、回腸、盲腸等黏膜出血、脫落，腸系膜充血出血。

2.3 細(xì)菌分離與鑒定

將所采集病料，用無(wú)菌生理鹽水洗脫、稀釋，劃線接種于麥康凱和伊紅美蘭培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，挑取麥康凱平板上的粉紅色菌落、伊紅美蘭平板上的黑色泛金屬光澤的菌落，鏡檢呈革蘭氏染色陰性中等大小桿菌。對(duì)照組樣品未分離到致病性大腸桿菌。

采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏檢測(cè)儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定，確定致病病原為大腸桿菌。

按中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 《大腸埃希氏菌“O”抗原定型血清使用說(shuō)明書(shū)》進(jìn)行血清型鑒定，確定各人工感染組樣品均為O78菌株。

2.4 蓮黃顆粒對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的預(yù)防作用

攻毒前3天給藥，給予中劑量蓮黃顆粒每1kg體重0.2g，以溫開(kāi)水溶解后灌服給藥，每天1次，連續(xù)用藥5d，對(duì)人工感染雞大腸桿菌病有明顯的預(yù)防作用，攻菌后發(fā)病率僅為12.5%，其保護(hù)率達(dá)87.5%，與感染對(duì)照組相比，發(fā)病率和病死率均有顯著差異（P＜0.01）。預(yù)防組發(fā)病雞經(jīng)繼續(xù)服用蓮黃顆粒后全部康復(fù)，結(jié)果見(jiàn)表3-2。

2.5 蓮黃顆粒對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的治療作用

表3-2蓮黃顆粒對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的治療作用

雞接種大腸桿菌發(fā)病后，蓮黃顆粒治療組分別按每 1kg體重 0.1g、0.2g、0.3g的劑量溶解成同體積灌胃給藥，病情很快得到控制。12h后精神、飲食欲明顯好轉(zhuǎn)；36h-48h后病雞臨床癥狀基本消失，活動(dòng)增加，飲食欲基本恢復(fù)正常。蓮黃顆粒高中低劑量組治療效果均極顯著優(yōu)于感染對(duì)照組（P＜0.01）。其中，高、中劑量治療組與氟苯尼考治療組的治療效果相當(dāng)（P＞0.05），且顯著高于低劑量治療組（P＜0.01或P＜0.05，表3-3）

表3-3 蓮黃顆粒對(duì)人工感染雞大腸桿菌病治療作用

2.6 蓮黃顆粒對(duì)試驗(yàn)雞增重的影響

各組雞在12日齡時(shí)平均體重差異不顯著（P＞0.05）。在17日齡各組雞停藥后，感染對(duì)照組體重極顯著低于其他各組（P＜0.01），預(yù)防組體重與正常對(duì)照組體重相仿，且極顯著高于其他各組（P＜0.01）；低劑量組與健康對(duì)照組、預(yù)防組、中、高劑量治療組以及氟苯尼考治療組相比，也存在極顯著性差異（P＜0.01）；中、高劑量組和氟苯尼考組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。詳見(jiàn)表3-4。

表3-4 蓮黃顆粒對(duì)試驗(yàn)雞增重的影響

3 討論

蓮黃顆粒收載于 《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)·中藥卷》（2017版），是由穿心蓮、黃芩、白頭翁、地榆、馬齒莧、訶子、秦皮、甘草等8味中藥組方，經(jīng)提取加工制成的顆粒劑，具有清熱燥濕，涼血止痢功效，用于治療雞的熱毒下痢[1]。蓮黃顆粒組方藥物中，穿心蓮味苦性寒，具有清熱解毒、消腫止痛功效，主治感冒發(fā)熱，濕熱下痢，蛇蟲(chóng)咬傷，瘡癰疔毒等病證；黃芩味苦性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎功效，主治肺熱咳嗽，胃腸濕熱，瀉痢，黃疸，高熱貪飲，便血，衄血，目赤腫痛，癰腫瘡毒，胎動(dòng)不安等病證。二藥共為君藥。白頭翁味苦性寒，具有清熱解毒，涼血止痢功效，主治熱毒血痢，濕熱腸黃等病證；地榆味苦酸澀，性微寒，具有涼血解毒，止血斂瘡功效，主治血痢，衄血，子宮出血，瘡黃疔毒，燙傷等病證；馬齒莧味酸、性寒，具有清熱解毒、涼血止痢功效，主治熱毒下痢，瘡黃腫毒，熱淋血尿，便血，蛇蟲(chóng)咬傷等病證。三藥共為臣藥。訶子味苦酸澀、性平，具有澀腸、斂肺功效，主治久瀉久痢，便血，脫肛，肺虛咳喘等病證；秦皮味苦澀、性寒，具有清熱燥濕、收澀止痢和明目等功效，主治濕熱下痢、目赤腫痛、云翳等病證。二藥共為佐藥。甘草味甘性平，具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、和中緩急、解毒、調(diào)和諸藥、緩解藥物毒性烈性等功效，主治脾胃虛弱、倦怠無(wú)力、咳喘、咽喉腫痛、中毒和瘡瘍等病證，為使藥。盡管《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中藥卷標(biāo)明蓮黃顆粒的主治是雞熱毒下痢，但眾多研究文獻(xiàn)表明，組成蓮黃顆粒的中藥及其成分對(duì)抑制大腸桿菌或防治雞大腸桿菌病有效[3-8]。王娜通過(guò)研究證實(shí)黃芩提取物黃芩苷能在體外有效抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，MIC為1.56mg/ml。趙銀麗等研究表明，黃芩水煎液藥物濃度為5g/ml時(shí)可使7日齡雛雞獲得90%以上的攻毒保護(hù)；藥物濃度為10g/ml時(shí)可使100%雛雞獲得攻毒保護(hù)，說(shuō)明黃芩可以對(duì)抗雞大腸桿菌，用于防治雞的大腸桿菌病。梁英等研究發(fā)現(xiàn)黃芩提取物(黃芩黃酮)對(duì)雞大腸桿菌具有明顯的體內(nèi)抑菌作用，并對(duì)人工誘發(fā)的雞大腸桿菌病有明顯的防治效果，預(yù)防組有效率達(dá)80%，治療組有效率達(dá)70%。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，給藥組雞的發(fā)病癥狀較感染對(duì)照組輕；剖檢觀察表明，給藥組雞臟器的病理變化較感染對(duì)照組輕；給藥組的病死率均極顯著低于感染對(duì)照組（P＜0.01），治愈率、試驗(yàn)雞增重均極顯著高于感染對(duì)照組（P＜0.01），表明蓮黃顆粒對(duì)人工誘發(fā)的雞大腸桿菌病有較好的防治作用。

4 結(jié)論

4.1 采用12日齡海蘭褐公雛，每只雞胸肌注射0.2ml濃度為3.5×109cfu/ml的大腸桿菌O78株，成功造成了雞大腸桿菌病模型，發(fā)病率100%，致死率78.8%，發(fā)病雞具有較穩(wěn)定的雞大腸桿菌病臨床癥狀和病理剖檢特征，并從病死雞臟器分離到雞致病性大腸桿菌。

4.2 攻毒前3d，按每1kg體重0.2g蓮黃顆粒的劑量，灌胃給藥，對(duì)人工感染雞致病性大腸桿菌具有明顯的保護(hù)作用，其保護(hù)率達(dá)87.5%，表明該濃度的蓮黃顆?？捎糜陔u大腸桿菌病的預(yù)防。

4.3 按每1kg體重0.1g、0.2g、0.3g蓮黃顆粒的劑量，灌胃給藥，對(duì)人工感染雞大腸桿菌病有較好的治療作用，各組治愈率分別為73.75%、88.75%和91.25%，中、高劑量組的療效與氟苯尼考（92.50%）治療效果相當(dāng)。

4.4 推薦蓮黃顆粒用于預(yù)防和治療雞大腸桿菌病的劑量為每1kg體重0.2～0.3g，內(nèi)服給藥，每日1次，連用5d。