萬 意 盛環(huán)宇 馬瑞鈺 杜 強(qiáng) 楊榮斌 詹 凱*

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230001；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230001；3.安徽圣迪樂村生態(tài)食品有限公司，安徽 銅陵 244100)

隨著蛋雞產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，雞舍內(nèi)部的環(huán)境衛(wèi)生質(zhì)量逐漸受到養(yǎng)殖企業(yè)的重視[1-2]。持續(xù)不斷的清潔飲用水和干燥的采食環(huán)境對(duì)雞群胃腸道系統(tǒng)健康和日常生產(chǎn)性能至關(guān)重要[3-5]。乳頭式密閉式飲水系統(tǒng)是目前國內(nèi)規(guī)?；半u場普遍采用的飲水裝置，可以有效地封閉水源，提高水質(zhì)潔凈度[6-7]。在生產(chǎn)過程中，大部分養(yǎng)殖場為了防止水線乳頭故障漏水和雞群飲水外灑滴落糞便傳送帶，導(dǎo)致傳送帶上糞便含水率增加，通常在飲水線水管的下方對(duì)應(yīng)安裝一條V型接水槽，將灑漏出的水盛接起來匯集流向舍外[8-9]。由于V型槽長期暴露于空氣環(huán)境中，生物氣溶膠中致病菌落[10]及水線水中夾雜的金屬沉淀物和各種藥物等會(huì)滴落至槽中聚集[11]，在適宜溫度下造成微生物迅速繁殖，時(shí)間久了還會(huì)形成一些粘稠的沉淀污物附著于槽壁上。通過對(duì)籠內(nèi)雞群活動(dòng)的觀察發(fā)現(xiàn)，蛋雞在采食后喜歡啄飲V型槽中的水和堆積物，這可能會(huì)對(duì)雞群的生長健康和生產(chǎn)性能有著嚴(yán)重影響。

本研究擬以8層層疊式密閉籠養(yǎng)蛋雞舍為研究對(duì)象，在夏季高溫天氣對(duì)舍內(nèi)不同籠層飲水裝置中細(xì)菌微生物進(jìn)行檢測，比較水線水和V型槽水的污染情況及其對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)的影響，以期為蛋雞舍內(nèi)環(huán)境控制和乳頭式飲水系統(tǒng)的完善提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)雞舍概況

本試驗(yàn)于2019年06-04—08-13，在安徽圣迪樂村生態(tài)食品有限公司的8層層疊式籠養(yǎng)密閉雞舍內(nèi)進(jìn)行。雞舍分為上下各4層，中間為鋼網(wǎng)管理走道，單棟存欄羅曼粉殼商品蛋雞5 萬只；雞舍呈南北走向，長73.0 m，寬16.0 m，高6.3 m，4列5走道，單列單層籠位數(shù)量為135個(gè)；舍內(nèi)安裝縱向濕簾通風(fēng)系統(tǒng)，濕簾位于雞舍凈道端山墻及兩側(cè)，面積138 m2；風(fēng)機(jī)位于污道端山墻上，分3層排列，每層6臺(tái)；采用行車喂料、乳頭飲水器飲水、傳送帶清糞、自動(dòng)集蛋系統(tǒng)的生產(chǎn)工藝。試驗(yàn)雞日糧營養(yǎng)水平參照《羅曼粉殼商品蛋雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)》執(zhí)行。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

在蛋雞371日齡時(shí)，選擇雞舍內(nèi)東邊相鄰2列的前端(靠近濕簾端，第13號(hào)籠)、中端(第73號(hào)籠)、后端(靠近風(fēng)機(jī)端，第133號(hào))，每端選測1、3、5、7層，共計(jì)24個(gè)監(jiān)測點(diǎn)(圖1(a)(b))，試驗(yàn)期內(nèi)若有雞只死亡，則選用體重相近的雞只代替。

1.3 水線水和V型槽水采集

每2周1次，測定各監(jiān)測點(diǎn)對(duì)應(yīng)雞籠內(nèi)水線內(nèi)水和V型槽內(nèi)水(圖1(c))細(xì)菌總拷貝數(shù)，同時(shí)記錄各點(diǎn)的溫度和濕度。水線水用無菌離心管直接接取50 mL；V型槽中積水用2 mL膠頭滴管吸取，V型槽內(nèi)無水時(shí)使用滅菌棉拭子刮取，一同加入離心管后加DEPC水稀釋至50 mL。所有采樣材料均提前1天高壓滅菌。

1.4 細(xì)菌總數(shù)測定

1.4.1引物設(shè)計(jì)

Real-Time PCR(QPCR)引物使用諾禾致源16S rDNA微生物測序引物擴(kuò)增16S V4～V5區(qū)域，引物序列為515-F：5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′；907-R：5′-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3′，擴(kuò)增片段長度為412 bp。

圖1 采樣檢測點(diǎn)示意圖Fig.1 Diagram of the monitor points

1.4.2樣本總DNA提取

離心管中50 mL樣本過濾于0.22 μm 濾膜后，用1 mL滅菌水洗脫；拭子用滅菌水渦旋洗滌，使得細(xì)菌充分溶解于1 mL水中；樣本DNA采用磁珠法DNA提取試劑盒提取(MagBead DNA Purification Kit，CW2508)，使用微量核酸檢測儀器測定濃度(杭州奧盛Nano-100，超微量核酸蛋白定量儀)，用于檢測后數(shù)據(jù)計(jì)算。

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒制備

標(biāo)準(zhǔn)品以大腸桿菌16S rDNA為參照物，根據(jù)細(xì)菌16S rDNA通用引物(515-F/907-R)擴(kuò)增位置，將大腸桿菌16S rDNA第515～926位共412 bp的序列插入克隆載體pUC57中(本試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒采用基因合成的形式獲得)，重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒命名為pUC57-16S rDNA。pUC57-16S rDNA全長3122 bp，抽提質(zhì)粒濃度為142.93 ng/μL，計(jì)算其拷貝數(shù)為4.17×1010拷貝數(shù)/μL。用ddH2O將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至拷貝數(shù)為4.17×109～4.17×103拷貝數(shù)/μL，共計(jì)7個(gè)濃度梯度，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線建立。

1.4.4QPCR反應(yīng)體系及步驟

采用SYBR Green I法實(shí)時(shí)熒光定量PCR(絕對(duì)定量)進(jìn)行樣本細(xì)菌總拷貝數(shù)檢測；定量PCR試劑盒為TransStart Green qPCR SuperMix(北京全式金，AQ131)。20 μLQPCR反應(yīng)體系如下：2×PCR Mix10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNaseFree ddH2O 7 μL，模板2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；循環(huán)程序?yàn)?4 ℃變性5 s，61 ℃退火延伸50 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線法的反應(yīng)條件如下：97 ℃ 1 s，65 ℃ 60 s，95 ℃ 1 s；其中 65～95 ℃區(qū)間為熔解曲線生成區(qū)間。

1.5 產(chǎn)蛋性能測定

在各監(jiān)測點(diǎn)選擇3個(gè)相鄰籠位為1組，每籠飼養(yǎng)6只雞，每組共18只雞。試驗(yàn)過程中，每天上午記錄各組蛋雞的產(chǎn)蛋率、雞蛋質(zhì)量和畸形蛋率。每2周1次，收集各組蛋雞所產(chǎn)雞蛋，測定蛋品質(zhì)性狀：雞蛋質(zhì)量、蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋殼顏色、蛋黃顏色、蛋白高度和哈氏單位。蛋殼顏色用蛋殼顏色測定儀(QCR 型)測定，使用前采用黑白2塊標(biāo)準(zhǔn)瓷塊校正，黑色瓷塊的校正值為0，白色瓷塊的校正值為79.9，分別測定蛋殼鈍端、中間和銳端3個(gè)點(diǎn)的蛋殼顏色，最后取平均值；蛋殼厚度用蛋殼厚度測定儀(GSA-1020型)測定；蛋殼強(qiáng)度用蛋殼強(qiáng)度測定儀(EGG-0503型)測定；雞蛋質(zhì)量、蛋白高度、蛋黃顏色和哈氏單位用多功能蛋品質(zhì)分析儀(EMT-5200型)測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用Turkey法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.01作為差異顯著性判斷。每1 mL樣本水中細(xì)菌總拷貝數(shù)以10為底取對(duì)數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同籠層的溫、濕度

夏季不同時(shí)間測定第1、3、5、7層溫度和濕度見表1。不同時(shí)間點(diǎn)所測定溫、濕度存在明顯差異，由平均值來看，舍內(nèi)平均溫度從第1層(29.33 ℃)至第7層(30.26 ℃)逐漸升高，平均相對(duì)濕度呈降低趨勢。

表1 夏季雞舍內(nèi)不同籠層溫度和濕度Table 1 The temperature and humidity on different tiers in layer house during summer

2.2 不同籠層水線水和V型槽水中細(xì)菌總拷貝數(shù)

夏季不同時(shí)間測定第1、3、5、7層水線水和V型槽水中細(xì)菌總數(shù)見表2。各籠層水線水中細(xì)菌總拷貝數(shù)在各階段差異不大，第5、7層平均值比第1、3層約高0.16個(gè)單位(1.45倍)。各籠層V型槽水細(xì)菌總拷貝數(shù)各階段差異不大(P>0.01)，其中第1層平均值最高為9.77個(gè)單位，第7層值最低為9.70個(gè)單位。比較水線水和V型槽水細(xì)菌總拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)各階段V型槽水中細(xì)菌總拷貝數(shù)均遠(yuǎn)高于水線水中(P<0.01)，高達(dá)46.77至 1 905.46 倍。

2.3 不同籠層蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)

舍內(nèi)不同籠層蛋雞產(chǎn)蛋率、畸形蛋率及蛋品質(zhì)比較分別見表3、4。各籠層產(chǎn)蛋率存在顯著差異(P<0.01)，第7層最高為81.08%，第1層最低為77.61%，第3層和第7層均高于第1層和第5層。各籠層畸形蛋率無顯著差異(P>0.01)。從蛋品質(zhì)性狀看，第1層雞蛋質(zhì)量最大，蛋黃顏色最深，蛋殼強(qiáng)度最??；第7層雞蛋質(zhì)量最小，蛋殼強(qiáng)度最大；蛋殼顏色最深，蛋黃顏色最淺；第7層蛋白高度和哈氏單位均顯著高于其他各層(P<0.01)；各籠層蛋殼厚度均無顯著差異(P>0.01)。

2.4 細(xì)菌拷貝數(shù)與產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)的相關(guān)性分析

水線水和V型槽水細(xì)菌數(shù)與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性分析見表5。水線水和V型槽水中細(xì)菌總拷貝數(shù)在各籠層均呈弱正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.046～0.183。水線水中細(xì)菌總拷貝數(shù)與產(chǎn)蛋率均呈弱相關(guān)；與雞蛋質(zhì)量除了在第7層呈弱負(fù)相關(guān)，在其他層均呈弱正相關(guān)；與蛋白高度和哈氏單位在第3、5層呈正相關(guān)，在第1、7層呈弱負(fù)相關(guān)。V型槽水中細(xì)菌總拷貝數(shù)與產(chǎn)蛋率和雞蛋質(zhì)量除了在第1層呈弱正相關(guān)，在其余各籠層均呈負(fù)相關(guān)；與蛋白高度和哈氏單位在各籠層均呈不同程度弱負(fù)相關(guān)(r=-0.037～-0.192)。

表3 雞舍內(nèi)不同籠層產(chǎn)蛋率和畸形蛋率Table 3 The laying rate and abnormal egg rate of layers ondifferent tiers in layer house

3 討論與結(jié)論

雞群采食和飲水是有害微生物進(jìn)入體內(nèi)的主要途徑[12]，隨著密閉式乳頭飲水器的普及，水線水的生物安全防治逐漸得到生產(chǎn)者的重視[13]，但是V型接水槽的衛(wèi)生情況容易被忽視。飲水器漏出的水和雞采食的殘?jiān)温┲罺型槽中，加上長期暴露于空氣中從而促使細(xì)菌滋生嚴(yán)重，還可能會(huì)產(chǎn)生有害氣體[14]。利用16S rDNA 細(xì)菌通用引物擴(kuò)增，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測細(xì)菌含量已被廣泛的應(yīng)用于畜禽健康及其制品的衛(wèi)生安全[15-17]。本試驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR 的方法成功檢測了水線水和V型槽水中細(xì)菌含量，發(fā)現(xiàn)在夏季各階段所測V型槽水中細(xì)菌總拷貝數(shù)量在各籠層均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水線水中，最高可達(dá)1 905倍。水線水中細(xì)菌含量遠(yuǎn)低于V型槽中，這是因?yàn)樯a(chǎn)過程中會(huì)對(duì)雞群飲用水提前進(jìn)行消毒處理，同時(shí)舍內(nèi)水線水也會(huì)定期沖洗，然而從未清洗處理過V型槽內(nèi)積水和堆積的內(nèi)容物，因此槽內(nèi)細(xì)菌微生物隨著時(shí)間繁殖滋生，污染程度遠(yuǎn)高于水線水中。

韓海霞等[18]發(fā)現(xiàn)在5層層疊式籠養(yǎng)蛋雞舍內(nèi)，上層產(chǎn)蛋率高于下層；盧元鵬等[19]通過比較不同4層層疊式雞舍不同籠層蛋雞產(chǎn)蛋性能，發(fā)現(xiàn)第1層產(chǎn)蛋率最低，第3層產(chǎn)蛋率最高。本試驗(yàn)中，8層層疊式蛋雞舍內(nèi)第3、7層產(chǎn)蛋率高于第1、5層，雞蛋質(zhì)量小于第1、5層，剔除雞只本身的原因，這可能還與各籠層間溫度、濕度、通風(fēng)量等環(huán)境差異有關(guān)[19-20]；第1、5層V型槽中細(xì)菌總拷貝數(shù)高于第3、7層，因此推測蛋雞產(chǎn)蛋率可能與V型槽內(nèi)微生物環(huán)境有關(guān)，槽內(nèi)污物等有機(jī)物中含有大量的病原微生物，如不及時(shí)清理和消毒，會(huì)使致病菌滋生易引起禽病發(fā)生，從而降低生產(chǎn)性能[21]；同樣發(fā)現(xiàn)第7層蛋雞蛋白高度和哈氏單位均顯著高于其余各層，這可能與第7層V型槽中細(xì)菌總拷貝數(shù)最低有關(guān)，推測V型槽內(nèi)環(huán)境水平可能對(duì)蛋雞輸卵管健康有一定影響。

商品蛋雞場環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測是蛋雞養(yǎng)殖技術(shù)體系的重要部分，養(yǎng)殖場在完善禽病防控的過程中，禽舍內(nèi)部環(huán)境的消毒和病原微生物控制至關(guān)重要[22-23]。本試驗(yàn)中，水線水和V型槽水中細(xì)菌總拷貝數(shù)在不同籠層均呈正相關(guān)，因?yàn)楫?dāng)雞啄飲乳頭時(shí)會(huì)造成飲水器漏水或外灑至V型槽內(nèi)[8]，所以水線中微生物滋生也會(huì)增加V型槽中的細(xì)菌數(shù)量。水線水中細(xì)菌總拷貝數(shù)與產(chǎn)蛋率、雞蛋質(zhì)量、蛋白高度和哈氏單位在各籠層均呈不同程度的正、負(fù)弱相關(guān)，且無規(guī)律性，未呈現(xiàn)出對(duì)生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)有影響趨勢；V型槽水中細(xì)菌數(shù)與產(chǎn)蛋率和雞蛋質(zhì)量在第3、5、7層均呈弱負(fù)相關(guān)，與蛋白高度和哈氏單位在各籠層均呈不同程度弱負(fù)相關(guān)，表明V型槽內(nèi)細(xì)菌微生物污染有致使蛋雞生產(chǎn)性能和雞蛋品質(zhì)下降的趨勢，舍內(nèi)雞群若長期啄飲V型槽內(nèi)水可能會(huì)影響機(jī)體健康。因此，雞場在做好舍內(nèi)飲水線安全衛(wèi)生控制的同時(shí)，還需要提高對(duì)V型水槽內(nèi)污染情況的關(guān)注。

層疊式蛋雞舍內(nèi)V型槽內(nèi)細(xì)菌含量遠(yuǎn)高于水線水中，槽內(nèi)污染嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致有害菌群滋生，對(duì)蛋雞健康、產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)有較大的潛在負(fù)面影響。養(yǎng)雞場可以定期采集舍內(nèi)水樣和V型槽內(nèi)容物，監(jiān)測細(xì)菌微生物含量和污染情況，進(jìn)一步按照飲水衛(wèi)生管理的要求，依照自身?xiàng)l件制訂并執(zhí)行一套實(shí)用的V型槽清潔消毒技術(shù)規(guī)程。