趙芳，趙建新，張灝,2，陳衛(wèi)，陸文偉,2*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(揚州)食品生物技術研究所，江蘇 揚州，225004)

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是首批定殖于人體腸道的微生物，與宿主健康密切相關[1]。人體腸道中雙歧桿菌的種類和數(shù)量隨著年齡的增長而變化，是嬰兒和成人胃腸道的優(yōu)勢菌群[2]。長雙歧桿菌(B.longum)是人體腸道雙歧桿菌的優(yōu)勢菌種，占34.30%，在各個年齡段都存在，尤其是在中青年、老人和長壽老人中豐度最高[3]。B.longum具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡[4]、抑制致病菌生長[5]、調(diào)節(jié)免疫[6]、緩解便秘[7]、降血脂[8]、預防肥胖和糖尿病[9]、抑制結(jié)直腸癌[10]等眾多益生特性，且B.longumsubsp.longum已被歐洲食品安全局(European Food Safety Agency，EFSA)列入安全資格認定(qualified presumption of safety，QPS)清單[11]，因此B.longum已成為全球范圍內(nèi)應用最廣泛的益生菌之一。但有些雙歧桿菌對氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類和青霉素類抗生素均表現(xiàn)出抗性，且其基因組中也鑒定到相關的抗性基因[12-14]?？股乜剐曰?antibiotic resistance genes，ARGs)作為一種新型環(huán)境污染物，可通過水平基因轉(zhuǎn)移到環(huán)境中進行傳播和擴散[15]。因此在潛在益生雙歧桿菌菌株商業(yè)化應用時，應對其抗生素耐藥進行安全性評估。

目前人們多聚焦于致病菌耐藥性研究，對潛在益生雙歧桿菌菌株抗生素耐藥性缺乏監(jiān)測。特別是，不同種雙歧桿菌抗生素耐藥性判定普遍使用EFSA制定的雙歧桿菌屬水平微生物折點值(microbiological cut-off values，MCOFFs)[16]。MCOFFs的制定常基于細菌-抗生素組合的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)分布[17]，而MIC分布因細菌種類、抗生素類別和抗生素敏感性實驗方法的不同而變化[18]，因此最好制定細菌種水平MCOFFs。本研究旨在通過測定52株B.longum對6類常見抗生素的MIC值，采用2種經(jīng)典統(tǒng)計學方法進行B.longum抗生素種特異性初始微生物折點值的制定，以用于區(qū)分敏感菌株與獲得性抗性菌株，并從分子基因?qū)用孢M行固有耐藥和獲得性耐藥機制解析。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 測試菌株

實驗所選的52株長雙歧桿菌均保藏在江南大學食品生物技術菌種保藏中心，菌株分離信息見表1。

表1 52株長雙歧桿菌菌株來源信息表

續(xù)表1

1.1.2 質(zhì)控菌株

本研究選用B.longumATCC 15707作為抗生素敏感性實驗的質(zhì)控菌株，為商業(yè)購買菌株。

1.1.3 主要試劑

四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氨芐青霉素、氯霉素、萬古霉素，購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

1.1.4.1 MRS培養(yǎng)基

菌株活化培養(yǎng)基(MRS-Cys)(g)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，葡萄糖20，Na2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO40.25，檸檬酸氫二銨2，KH2PO42.6，吐溫1 mL，1 L MRS培養(yǎng)基中添加0.5 gL-半胱氨酸鹽酸鹽，pH調(diào)至6.8。

1.1.4.2 LSM培養(yǎng)基

抗生素敏感性實驗用培養(yǎng)基(LSM-Cys)：ISO-SENSITEST BROTH (OXOID，貨號CM0473B)和MRS培養(yǎng)基按照9∶1的體積比混合為LSM培養(yǎng)基，1 L LSM培養(yǎng)基中添加0.5 gL-半胱氨酸鹽酸鹽為LSM-Cys培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設備

電子天平(ME3002E)、pH計(FE-20)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；全自動高壓蒸汽滅菌鍋(SX-500)，日本Tomy Digital Biology公司；電熱恒溫鼓風干燥箱(DGG-9123A)，上海森信實驗儀器有限公司；超凈工作臺(ZHJH-C1109B)，江蘇蘇凈集團有限公司；紫外可見分光光度計(UV-1800)，日本島津企業(yè)管理有限公司；厭氧工作站(Whitley DG250)，英國Don Whitley Scientific公司；全波長自動酶標儀(MULTISCAN GO)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化

將測試菌株和質(zhì)控菌株按體積分數(shù)1%的接種量接種到MRS-Cys培養(yǎng)基中，置于厭氧工作站，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，活化2代。

1.3.2 抗生素敏感性實驗

抗生素敏感性實驗方法為肉湯微量稀釋法，具體操作參照國際標準方法ISO 10932(IDF 223:2010)[19]。

1.3.3 初始微生物折點值的制定

TMCOFFs的制定參照TURNIDGE等[20](T)和KRONVALL[21](K)兩種經(jīng)典統(tǒng)計方法。MIC值經(jīng)統(tǒng)計分析得MIC累積頻數(shù)分布表，按照相應的方法說明將頻數(shù)分布表分別導入ECOFFinder(T法)和Automatic_NRI-MIC_Win_V02beta(K法)2個數(shù)據(jù)表中。T法計算過程為：先將MIC分布進行以2為底的對數(shù)正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布的MIC分布進行非線性最小二乘法回歸擬合，得到3個重要參數(shù)：菌株估計值、log2平均值(log2Mean)和log2標準差(log2SD)，然后從頻數(shù)分布最高或高于1個2倍濃度的MIC分布開始迭代擬合，直至包含所有抗生素濃度。當擬合估計值(N)與真值之差最小時，擬合度最佳，此時的MIC為最佳MIC值，基于最佳MIC下的log2平均值和log2標準差計算得到微生物折點值真值。本文選取包含99%野生型菌群的折點值真值向上四舍五入至鄰近的2倍抗生素濃度即定義為TMCOFFs[22]。同樣地，K法計算過程為：將MIC分布導入數(shù)據(jù)表后，得到3個重要參數(shù)值：log2平均值(log2Mean)、log2標準差(log2SD)和平均值加2個標準差(Mean+2SD)；Mean+2SD向上四舍五入至鄰近的2倍抗生素濃度即定義為TMCOFFs。

1.3.4 耐藥基因的鑒定

將52株測試菌株的基因組序列與抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(CARD)和可移動耐藥基因數(shù)據(jù)庫(ResFinder)比對，以氨基酸序列一致性≥30%和比對覆蓋度≥90%為閾值，篩選出推定的抗生素耐藥基因[23-24]。

1.3.5 可移動耐藥基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

根據(jù)ResFinder數(shù)據(jù)庫的鑒定結(jié)果提取目的菌株中的可移動耐藥基因序列,并在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載相應的耐藥基因序列，兩者通過ClustalW(默認參數(shù))進行多重比對，系統(tǒng)發(fā)育樹的構建采用MEGA-X。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用HemI 1.0進行可移動耐藥基因的熱圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 長雙歧桿菌抗生素敏感性評估

本研究測定了52株B.longum對四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氨芐青霉素、氯霉素和萬古霉素的MIC值。由表2可知，在MIC分布上，B.longum對四環(huán)素的MIC分布范圍為0.125～64 μg/mL，菌株FGZ23I1M2的MIC值僅為0.125 μg/mL(表3)，而有8株B.longum的MIC高達64 μg/mL。紅霉素MIC分布范圍為0.032～>8 μg/mL，克林霉素MIC分布范圍為0.032～>16 μg/mL，分別覆蓋7和6個2倍抗生素濃度梯度。13株B.longum對紅霉素和克林霉素的MIC值均超出其測定的最大抗生素濃度范圍，并表現(xiàn)出同步抗性。在氨芐青霉素的MIC分布上，絕大多數(shù)B.longum的MIC≤4 μg/mL；而在氯霉素MIC分布上，除菌株FJSWXJ2M1的MIC<0.125 μg/mL外(表3)，剩下的B.longum菌株的MIC分布僅涵蓋4個濃度梯度。而對于萬古霉素MIC分布，19%(10/52)B.longum菌株的MIC值明顯分離于正常敏感菌群。

表2 52株B. longum對6種抗生素的MIC分布

表3 52株B. longum對6種抗生素的MIC分布結(jié)果 單位:μg/mL

續(xù)表3

續(xù)表3

2.2 長雙歧桿菌抗生素耐藥性微生物折點值制定

本文基于52株B.longum對6種抗生素的MIC頻數(shù)分布，采用Turnidge(T)和Kronvall(K)兩種經(jīng)典統(tǒng)計學方法，進行B.longum種特異性TMCOFFs的制定及耐藥率比較分析，并與已制定的雙歧桿菌屬水平折點值進行比較。表4為2種統(tǒng)計方法計算過程中得到的重要參數(shù)值：log2Mean、log2SD和基于前面2個參數(shù)計算得到的折點值真值，折點值真值向上四舍五入至鄰近的2倍抗生素濃度，即為TMCOFFs。由表5可知，采用T法制定的B.longum對四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氨芐青霉素、氯霉素和萬古霉素的TMCOFFs依次為8、8、0.25、8、8和2 μg/mL；而基于K法計算得到的B.longum對這6種抗生素的TMCOFFs依次為8、8、0.25、2、8和2 μg/mL。2種不同統(tǒng)計方法計算結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)：除氨芐青霉素TMCOFFs相差2個抗生素濃度外，T法與K法計算得到的B.longum與剩下5種抗生素組合的TMCOFFs完全相等，這表明2種統(tǒng)計方法計算結(jié)果的一致性非常高。因此本文初步制定的B.longum對給定抗生素的種特異性微生物折點值是可靠的。

表4 基于Turnidge和Kronvall方法下長雙歧桿菌折點值的估計

表5 52株B. longum的初始微生物折點值和耐藥率統(tǒng)計結(jié)果

種特異性折點值與EFSA屬水平折點值相比較發(fā)現(xiàn)：種水平和屬水平折點值之間既存在一致性又存在差異性；相較于屬水平折點值，基于種特異性折點值B.longum對四環(huán)素、紅霉素、克林霉素和萬古霉素耐藥率水平相當，為中度抗性；氨芐青霉素耐藥率水平均較低；而氯霉素耐藥率由13.46%降為0。

2.3 種特異性微生物折點值下長雙歧桿菌多重耐藥性分析

基于種特異性微生物折點值進行B.longum對給定抗生素表型抗性的鑒定，若菌株對3類或3類以上抗生素表現(xiàn)出抗性時，即定義為多重耐藥[25]。表6為52株長雙歧桿菌對6種抗生素的多重耐藥性統(tǒng)計結(jié)果，由表6可知,21(40.4%)株菌為野生型，14株菌對1種抗生素有抗性，11株菌對2種抗生素具有抗性。5株菌對3種抗生素具有抗性，1株菌對5種抗生素具有抗性。6(11.5%)株菌為多重耐藥菌，其中FGSYC28M5是耐藥譜最廣的菌株，耐藥譜為四環(huán)素-紅霉素-克林霉素-氨芐青霉素-萬古霉素(表3)?？傮w來看，基于B.longum種特異性微生物折點值對52株分離株與給定6種抗生素的多重耐藥分析，發(fā)現(xiàn)其多重耐藥情況較輕，為今后長雙歧桿菌的安全性應用提供參考。

表6 52株B. longum的多重耐藥性結(jié)果

2.4 長雙歧桿菌抗生素耐藥性基因分析

表7為52株B.longum菌株基因組與CARD數(shù)據(jù)庫比對鑒定的表型抗性相關的耐藥基因。由表7可知，52株測試菌株均比對到了四環(huán)素耐藥基因rpsJ和tetB(P)，紅霉素耐藥基因macB，克林霉素耐藥基因lmrB、lmrC和lmrD，而B.longum對這3種抗生素的表型耐藥率依次為28.85%、25%和28.85%；故推測B.longum對這3種抗生素耐受可能由其他新的耐藥基因介導或需多個耐藥基因共同作用。但僅有17株菌株比對到四環(huán)素抗性基因tet(W)，且其序列一致性高達97%，其中13株菌株為四環(huán)素耐藥菌株；而且通過可移動耐藥基因數(shù)據(jù)庫ResFinder鑒定發(fā)現(xiàn)，13株四環(huán)素耐藥菌株中，可移動耐藥基因tet(W)的檢出率高達92.31%(12/13)(圖1)，故推測基因tet(W)可提高長雙歧桿菌四環(huán)素耐受性，且該基因具有水平基因轉(zhuǎn)移至其他致病菌的風險。有13株B.longum菌株同時表現(xiàn)出紅霉素和克林霉素抗性，其中10株菌株基因組中均存在可移動抗性基因erm(X)(圖1)，推測B.longum對紅霉素和克林霉素共同抗性是由可移動耐藥基因erm(X)介導，這與MARTíNEZ等[26]的研究結(jié)果一致；而菌株FJSWXJ41M1和FSDLZ50M2均含有erm(X)，但其對紅霉素和克林霉素均敏感，因此推測其基因erm(X)可能為沉默基因。所有菌株均未比對到β-內(nèi)酰胺類抗性基因，這與B.longum對氨芐青霉素表型敏感率吻合程度高達92.31%。51株菌均比對到了多重耐藥基因CIPa，1株菌比對到了clbB，而B.longum的多重耐藥率僅為11.5%，故推測CIPa和clbB可能為沉默基因或需與多個耐藥基因共同作用。B.longum基因組中比對到的糖肽類抗性基因有vanB、vanD、vanRO、vanSO、vanRI和vanRA；WEI等[27]在B.longumJDM301中鑒定到推定的萬古霉素抗性基因有vanD、vanU、vanH、vanSB、vanSD5和vanSc3，而本文中10株萬古霉素耐藥菌株基因組中均只存在vanD基因，故推測該基因是部分B.longum糖肽類抗生素耐受的關鍵抗性基因。

表7 52株B. longum中表型抗性相關耐藥基因的鑒定結(jié)果

圖1 52株長雙歧桿菌菌株基因組中可移動耐藥基因tet(W)和erm(X)的分布結(jié)果

2.5 可移動耐藥基因tet(W)和erm(X)的系統(tǒng)進化分析

將含有可移動耐藥基因的B.longum菌株的tet(W)和erm(X)耐藥基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的11個tet(W)和4個erm(X)基因序列進行比對分析，并采用MEGA-X中的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2和圖3。

圖3 長雙歧桿菌中可移動耐藥基因erm(X)的系統(tǒng)進化樹

圖2 長雙歧桿菌中可移動耐藥基因tet(W)的系統(tǒng)進化樹

由圖2可知，15株B.longum菌株分布在2個分支上，其中的13株B.longum菌株與NCBI庫下載的長雙歧桿菌長亞種(Bifidobacteriumlongumsubsp.longum)和嬰兒亞種(B.longumbv.infantis)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、假小鏈雙歧桿菌(B.pseudocatenulatum)、動物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)、杰氏棒桿菌(Corynebacteriumjeikeium)和Parasutterellaexcrementihominis在同一分支上，其序列相似度高，推測可能來源于同一耐藥基因；而菌株FGDLZ19M5、FGDLZ8M1和FJSNT32M4與NCBI下載的短雙歧桿菌(B.breve)和長雙歧桿菌(B.longum)位于另一分支上，且各基因間的進化距離較遠，可能來源于不同供體。

由圖3可知，13株B.longum菌株分布在2個大分支上，說明不同B.longum菌株的erm(X)基因序列具有顯著的變異。其中6株B.longum菌株FXJWS49M9、HUB225、FXJWS23M7、FHeNJZ44M8、FYNLJ22M3和FGSYC28M5與NCBI數(shù)據(jù)庫下載的3種棒狀桿菌(Corynebacterium)菌株和化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes)菌株的erm(X)基因序列同源性較高，推測B.longum菌株中的erm(X)基因可能是由其他細菌水平轉(zhuǎn)移耐藥基因所獲得。此外，第2個分支上分離自同一地區(qū)菌株FSDLZ50M2、FSDLZ51M1、FJSWXJ41M1、FJSNT32M4、FJSWXJ41M1的erm(X)基因序列相似度達到100%。

3 結(jié)論

本研究基于長雙歧桿菌與6種抗生素組合的MIC分布，初步制定B.longum對四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氨芐青霉素、氯霉素和萬古霉素的種特異性微生物折點值分別為8、8、0.25、8/2(T/K)、8和2 μg/mL，其可用于區(qū)分敏感菌株與獲得性抗性菌株。25%的B.longum菌株同時表現(xiàn)出紅霉素和克林霉素抗性，其抗性是由可移動耐藥基因erm(X)介導；可移動耐藥基因基因tet(W)介導B.longum四環(huán)素表型抗性。系統(tǒng)進化分析表明長雙歧桿菌耐藥基因tet(W)和erm(X)來源于不同宿主，同一地區(qū)分離菌株的耐藥基因具有高度同源性。益生菌菌株的耐藥性判定關系到食品安全，本文通過制定長雙歧桿菌的耐藥性折點值，對長雙歧桿菌在食品中的安全性應用具有指導價值。