肖 娜 張秋英 龍 偉

（1.吉安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西吉安 343000；2.江西省吉安市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江西吉安 343000）

在全世界范圍內(nèi)，水稻病害主要有3 種類(lèi)型：稻瘟病、白葉枯病及紋枯病[1-3]。其中，稻瘟病又被“譽(yù)為”水稻3 大病害之首，是由子囊菌Magnaporthe grisea （Hebert）Barr稻梨孢屬真菌引起的水稻真菌性病[4-5]。對(duì)于稻瘟病的防治目前還沒(méi)有強(qiáng)有力的措施，通常主要從栽培管理、抗病品種選育、化學(xué)防治、生物防治等方面對(duì)稻瘟病進(jìn)行綜合防治[6-8]。克里本類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus kribbensis）屬于原核生物界，厚壁菌門(mén)，桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，類(lèi)芽孢桿菌屬。近年來(lái)，人們逐漸發(fā)現(xiàn)克里本類(lèi)芽孢桿菌具有較好的抗真菌活性，已有相關(guān)學(xué)者在對(duì)其進(jìn)行深入研究[9-12]。本文先研究這兩種菌在不同培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況，選擇一種合適的培養(yǎng)基做培養(yǎng)基對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，在水稻上噴灑稻瘟病菌孢子懸浮液和克里本類(lèi)芽孢桿菌菌株發(fā)酵液，同時(shí)觀測(cè)水稻發(fā)病情況，研究克里本類(lèi)芽孢桿菌對(duì)水稻稻瘟病是否有抑制作用。所得到實(shí)驗(yàn)?zāi)芙o水稻稻瘟病的生物治療提供一個(gè)新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 實(shí)驗(yàn)供試菌株：江西天人股份有限公司保存的克里本類(lèi)芽孢桿菌菌株，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)保存的稻瘟病菌菌株，水稻由井岡山應(yīng)用科技學(xué)校提供。

供試培養(yǎng)基：固體PDA 培養(yǎng)基（PDA 8 g、瓊脂2 g）；固體察氏培養(yǎng)基（蔗糖6 g、硝酸鈉0.3 g、磷酸氫二鉀0.2 g、硫酸鎂0.1 g、氯化鉀0.1 g、硫酸鐵0.002 g、瓊脂4 g）；固體牛肉浸膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉浸膏1 g、蛋白胨2 g、氯化鈉1 g、瓊脂4 g）；液體PDA 培養(yǎng)基（PDA 8 g）；液體察氏培養(yǎng)基（蔗糖6 g、硝酸鈉0.3 g、磷酸氫二鉀0.2 g、硫酸鎂0.1 g、氯化鉀0.1 g、硫酸鐵0.002 g）。YXQSG46-280S 高壓滅菌鍋由上海東亞壓力容器制造有限公司生產(chǎn)，DHP-9082MBE 電熱恒溫培養(yǎng)箱由常州市人和儀器廠生產(chǎn)。SW-CJ-2D 雙人超凈工作臺(tái)由蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)克里本類(lèi)芽孢桿菌和稻瘟病菌的生長(zhǎng)影響 ①將供試克里本類(lèi)芽孢桿菌菌株分別接種至固體PDA 培養(yǎng)基、固體察氏培養(yǎng)基、固體牛肉浸膏蛋白胨培養(yǎng)基3 種培養(yǎng)基上，并在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察并記錄菌株生長(zhǎng)性狀。②將供試稻瘟病菌菌株菌絲體分別接種上述3 種培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察并記錄菌株生長(zhǎng)性狀。

1.2.2 克里本芽孢桿菌和稻瘟病菌對(duì)峙實(shí)驗(yàn) 將克里本類(lèi)芽孢桿菌用劃線法接在察氏培養(yǎng)基的一半，再將稻瘟病用劃線法接到另一半培養(yǎng)基，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中48 h 后觀察兩種菌的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 克里本類(lèi)芽孢桿菌對(duì)水稻盆栽稻瘟病菌的抑制 稻瘟病菌孢子懸浮液的制備方法如下。將已純培養(yǎng)的供試稻瘟病菌菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，待菌絲長(zhǎng)滿后加入1.5 mL 的滅菌水并輕輕刮菌絲，后移取菌絲液到盛有PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（9 cm）上，涂布均勻后放置在28℃恒溫箱中培養(yǎng)。待平板上菌絲長(zhǎng)滿后（約7 d），在無(wú)菌條件下刮除平板上菌絲后置于室內(nèi)組織培養(yǎng)架上光照培養(yǎng)24 h，室溫維持在25℃～28℃。等到充分產(chǎn)孢（約5 d）后，每皿用5 mL 蒸餾水洗下孢子，對(duì)孢子濃度進(jìn)行濃縮，在100 倍顯微鏡下計(jì)數(shù)孢子數(shù)量，最后用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)孢子濃度至5×103個(gè)/mL，制備稻瘟病菌孢子懸浮液。

克里本類(lèi)芽孢桿菌菌株發(fā)酵液的制備方法如下。將克里本類(lèi)芽孢桿菌活化后，挑取單菌或菌落接種到液體察氏培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)30℃震蕩培養(yǎng)84 h 后得克里本類(lèi)芽孢桿菌菌株發(fā)酵液，對(duì)克里本類(lèi)芽孢桿菌菌株發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，最后用血球計(jì)數(shù)板在100 倍顯微鏡下計(jì)數(shù)菌株數(shù)量。選用品種為欣榮優(yōu)08，按照水稻盆實(shí)驗(yàn)方法浸種、催芽后，待胚根長(zhǎng)至2 cm左右，選擇兩株長(zhǎng)勢(shì)一致的水稻苗移栽至塑料放盤(pán)中土培，長(zhǎng)至3 葉期，一株水稻噴灑稻瘟病菌孢子懸浮液和克里本類(lèi)芽孢桿菌菌株發(fā)酵液，另一株則作為空白對(duì)照組，不噴灑克里本類(lèi)芽孢桿菌菌株發(fā)酵液，同時(shí)觀測(cè)水稻發(fā)病情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)克里本類(lèi)芽孢桿菌的影響 克里本類(lèi)芽孢桿菌菌株在不同培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)性狀有明顯的差異，菌落形態(tài)較為相似。在察氏培養(yǎng)基和牛肉浸膏蛋白胨培養(yǎng)基上，克里本類(lèi)芽孢桿菌菌落呈乳白色、膿狀、近圓形、邊緣整齊、菌落隆起，表面黏稠；在PDA 培養(yǎng)基上，克里本類(lèi)芽孢桿菌不生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，在上述3 種培養(yǎng)基中，PDA 培養(yǎng)基沒(méi)有菌株生長(zhǎng)，不適合克里本類(lèi)芽孢桿菌生長(zhǎng)，而察氏培養(yǎng)基和牛肉浸膏蛋白胨培養(yǎng)較適合克里本類(lèi)芽孢桿菌生長(zhǎng)，其中以察氏培養(yǎng)基最適合，如圖1、圖2、圖3 所示。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。

圖1 察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的克里本類(lèi)芽孢桿菌

圖2 牛肉浸膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)的克里本類(lèi)芽孢桿菌

圖3 PDA 培養(yǎng)的克里本類(lèi)芽孢桿菌

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)稻瘟病菌的影響 稻瘟病菌菌株在不同培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)性狀有明顯的差異，菌落形態(tài)較為相似。稻瘟病菌菌株在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，早期為灰色半透明，24 h 后轉(zhuǎn)為灰色有黑色輪紋，菌落底面黑色，培養(yǎng)基不變色。在察氏培養(yǎng)基上菌株生長(zhǎng)較快，早期菌絲層薄半透明，48 h 后菌絲由白色變?yōu)榛疑?，菌絲層較為疏松，菌落表面灰色，底面黑色，培養(yǎng)基不變色。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌株生長(zhǎng)最慢，但菌絲致密，菌絲層厚，菌落表面白色，菌落邊緣培養(yǎng)基變?yōu)辄S褐色。由此可見(jiàn)，PDA 培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基都適合稻瘟病菌生長(zhǎng)，如圖4、圖5、圖6 所示。

圖4 PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)的稻瘟圖

圖5 察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的稻瘟病菌

圖6 牛肉浸膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)的稻瘟病菌

2.3 克里本芽孢桿菌和稻瘟病菌對(duì)峙實(shí)驗(yàn) 將克里本類(lèi)芽孢桿菌用劃線法接在察氏培養(yǎng)基的一半，再將稻瘟病用劃線法接到另一半，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中72 h 后觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)克里本類(lèi)芽孢桿菌能對(duì)稻瘟病菌產(chǎn)生抑菌效果,如圖7 所示。

圖7 克里本芽孢桿菌和稻瘟病菌對(duì)峙實(shí)驗(yàn)

2.4 克里本類(lèi)芽孢桿菌對(duì)水稻盆栽稻瘟病的影響 試驗(yàn)表明，空白對(duì)照組的葉片病斑呈梭形或紡錘形，長(zhǎng)1 ～1.5 cm，寬0.3 ～0.5 cm，病斑中央呈灰白色，邊緣褐色，外圍常有淡黃色暈圈，病斑兩端有向葉脈延伸的褐色壞死線，背面生有灰色霉層。病斑多時(shí)互相連接形成不規(guī)則大斑，一些葉片逐漸枯死；而經(jīng)過(guò)克里本類(lèi)芽孢桿菌的無(wú)菌發(fā)酵液處理的葉片沒(méi)有出現(xiàn)，葉片呈梭形或紡錘形，中央呈灰白色，邊緣褐色，外圍常有淡黃色暈圈的病斑，且葉片仍然保持綠色，表現(xiàn)出良好的抑菌活性。由此可見(jiàn)，克里本類(lèi)芽孢桿菌對(duì)水稻稻瘟病有抑制作用如圖8、圖9、圖10、圖11 所示。

圖8 稻瘟病水稻

圖9 稻瘟病水稻葉子

圖10 稻瘟病-克里本水稻

圖11 稻瘟病-克里本水稻葉子

3 結(jié)語(yǔ)

PDA 培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基都適合稻瘟病菌生長(zhǎng)；PDA 培養(yǎng)基不適宜克里本類(lèi)芽孢桿菌生長(zhǎng)，察氏培養(yǎng)基和牛肉浸膏蛋白胨為主的培養(yǎng)基較適宜克里本類(lèi)芽孢桿菌生長(zhǎng)。將克里本類(lèi)芽孢桿菌和稻瘟病菌同時(shí)接種到察氏培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)克里本類(lèi)芽孢桿菌能對(duì)稻瘟病菌產(chǎn)生一定的抑菌效果。只噴灑稻瘟病菌包子懸濁液的水稻盆栽出現(xiàn)稻瘟病，而噴灑了稻瘟病菌孢子懸濁液和克里本類(lèi)芽孢桿菌菌株發(fā)酵液的水稻盆栽無(wú)明顯變化，表明克里本類(lèi)芽孢桿菌對(duì)水稻稻瘟病有良好的抑制作用。所得到的結(jié)果可以為克里本類(lèi)芽孢桿菌抗水稻稻瘟病研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為治療水稻稻瘟病提供一定的理論依據(jù)，具有重要的意義。