陳 穎

(濮陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，河南 濮陽(yáng) 457000)

姜黃素是從姜科、天南星科植物的根莖中提取的化學(xué)成分，是一種含有酚基和醌基的天然藥物，可用于心血管疾病、慢性肝病、腫瘤及自身免疫性疾病的治療。中醫(yī)認(rèn)為，姜黃素有行氣活血、通經(jīng)止痛的功效，對(duì)跌打腫痛、閉經(jīng)等癥有良好治療效果[1]。有報(bào)道稱姜黃素能促進(jìn)海馬神經(jīng)元的分化，改善阿爾茨海默病中認(rèn)知功能障礙[2]，經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有良好的抗炎、抑制氧化應(yīng)激、抗腫瘤等藥理作用[3]，而炎癥是機(jī)體最常見的一種病理變化，可由感染、機(jī)械損傷等誘發(fā)炎癥因子的生成或釋放導(dǎo)致，使機(jī)體功能障礙或發(fā)生器質(zhì)性損傷[4]。本實(shí)驗(yàn)采用改良的Allen’s打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型，觀察姜黃素對(duì)模型大鼠相關(guān)炎癥因子水平的影響，探討姜黃素對(duì)大鼠急性脊髓損傷的抗炎作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

姜黃素由Sigma公司提供；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測(cè)試劑盒、白介素-1β(IL-1β)ELISA檢測(cè)試劑盒、白介素-6(IL-6)ELISA檢測(cè)試劑盒、白介素-10(IL-10)ELISA檢測(cè)試劑盒，由北京誠(chéng)林生物科技有限公司提供；髓過(guò)氧化物試劑盒(MPO)由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雌性，SPF級(jí)，240～260 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(豫)2015-0001。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SAF-680T酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司；Allen’s脊髓損傷打擊器；UV1000紫外/可見分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海比朗儀器制造有限公司生產(chǎn)；移液器若干。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

將姜黃素溶于0.1%DMSO的PBS溶液中，取SD大鼠80只，隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組，模型組，姜黃素低劑量組(40 mg/kg)、姜黃素中劑量組(80 mg/kg)、姜黃素高劑量組(120 mg/kg)，于脊髓損傷前一天進(jìn)行腹腔注射給藥，1次/d，持續(xù)7天，假手術(shù)組和模型組給予等體積0.1% DMSO的PBS溶液[5]。

2.2 動(dòng)物模型的制備

本實(shí)驗(yàn)采用改良的Allen’s打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型。各組大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL /100 g)腹腔注射麻醉，俯臥于鼠板上，手術(shù)將T9-T10椎板摘除并暴露脊髓，用Allen’s打擊器，重量為10 g的擊打棍于5 cm處自由落體造脊髓急性損傷。造模后出現(xiàn)脊髓組織水腫、出血，硬脊膜呈紫紅色，雙下肢出現(xiàn)遲緩性痙攣、回縮樣撲動(dòng)，尾巴痙攣性擺動(dòng)，視為造模成功。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 術(shù)后7天，采用脊髓損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(BBB)評(píng)分法對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，觀察其后肢的關(guān)節(jié)活動(dòng)、步態(tài)等運(yùn)動(dòng)功能。評(píng)分分為3個(gè)部分：第1部分(0～7分)，評(píng)價(jià)動(dòng)物后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)情況；第2部分(8～13分)，評(píng)價(jià)動(dòng)物后肢協(xié)調(diào)功能及步態(tài)；第3部(14～21分)，評(píng)價(jià)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)時(shí)爪子的精細(xì)動(dòng)作，3個(gè)部分滿分共21分，評(píng)分時(shí)采用雙盲法，每次評(píng)分由培訓(xùn)后兩人單獨(dú)完成，數(shù)據(jù)取其平均值。

2.3.2 相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè) 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分后，水合氯醛麻醉處死大鼠，取損傷處脊髓組織并精密稱重，加入9倍的冰生理鹽水勻漿制成10%的脊髓勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，檢測(cè)IL-1β、IL-6、IL-10、MPO相關(guān)指標(biāo)，具體操作步驟詳見試劑盒內(nèi)說(shuō)明書。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)姜黃素對(duì)急性脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分的影響。見表1。

表1 姜黃素對(duì)急性脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分的影響

由表1可知，與假手術(shù)組相比，模型組后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.01)，提示急性脊髓損傷造模成功。與模型組相比，姜黃素各組可有效改善急性脊髓損傷大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能，有良好的改善趨勢(shì)。其中，姜黃素高劑量組可顯著改善大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能(P<0.01)，姜黃素中劑量、小劑量組可明顯改善大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能(P<0.05)。

(2)姜黃素對(duì)急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液TNF-α、IL-1β水平的影響。見表2。

表2 姜黃素對(duì)急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液TNF-α、IL-1β水平的影響

由表2可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓勻漿液中TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.01)，與急性脊髓損傷模型指標(biāo)趨勢(shì)相一致，提示模型造模成功。與模型組相比，姜黃素各劑量組可明顯降低大鼠脊髓勻漿液中TNF-α、IL-1β水平，其中姜黃素高劑量組可顯著降低脊髓勻漿中TNF-α水平(P<0.01)，明顯降低脊髓勻漿IL-1β水平(P<0.05)；姜黃素中劑量組、小劑量組可明顯降低脊髓勻漿中TNF-α和IL-1β水平(P<0.05)。

(3)姜黃素對(duì)急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液IL-6、IL-10水平的影響。見表3。

表3 姜黃素對(duì)急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液IL-6、IL-10水平的影響

由表3可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓勻漿液中IL-6、IL-10水平顯著升高(P<0.01)，與急性脊髓損傷模型指標(biāo)趨勢(shì)相一致，提示造模成功。與模型組相比，姜黃素各劑量組可有效改善脊髓勻漿液中IL-6、IL-10水平，其中姜黃素大劑量可明顯降低勻漿液中IL-6水平(P<0.05)，顯著降低勻漿液中IL-10水平(P<0.01)；姜黃素中劑量組、小劑量組可明顯降低脊髓勻漿液中IL-6、IL-10水平(P<0.05)。

(4)姜黃素對(duì)急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液MPO水平的影響。見表4。

表4 姜黃素對(duì)急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液MPO水平的影響

由表4可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓勻漿液中MPO水平顯著升高(P<0.01)，與急性脊髓損傷模型指標(biāo)趨勢(shì)相一致，提示急性脊髓損傷造模成功。與模型組相比，姜黃素各劑量組可有效改善勻漿液中MPO水平，其中姜黃素高劑量組可顯著降低脊髓勻漿液中MPO水平(P<0.01)，姜黃素中劑量組、小劑量組可明顯降低脊髓勻漿液中MPO水平(P<0.05)。

4 結(jié)論

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)作為一種嚴(yán)重的外科疾病，已對(duì)人們生命健康造成嚴(yán)重威脅，一旦發(fā)生，可能會(huì)對(duì)患者造成永久性損害，給家庭、社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)[6]。SCI的發(fā)生過(guò)程中，會(huì)伴隨相關(guān)炎癥因子的生成和釋放，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中相關(guān)炎性細(xì)胞及黏附分子表達(dá)會(huì)升高，在脊髓組織中浸潤(rùn)、聚集，進(jìn)一步加重缺血損傷區(qū)的損傷。有研究表明，損傷局部過(guò)量的炎性因子是引起脊髓漸進(jìn)性潰變壞死的重要因素，且所引發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)會(huì)破壞神經(jīng)元，影響損傷脊髓功能恢復(fù)，進(jìn)一步加重?fù)p傷[7]。

脊髓發(fā)生損傷，其血脊髓屏障被破壞，血脊髓屏障通透性增加，以致大量的白細(xì)胞可以通過(guò)功能紊亂的血脊髓屏障進(jìn)入脊髓實(shí)質(zhì)而發(fā)生炎癥反應(yīng)[8-9]。TNF-α是機(jī)體重要的炎癥介質(zhì)和致病因子，是炎癥發(fā)生過(guò)程中重要的啟動(dòng)因子，誘導(dǎo)如IL-1β、IL-6等多種炎癥介質(zhì)的釋放，還可誘導(dǎo)EAA、C反應(yīng)蛋白等出現(xiàn)神經(jīng)毒性作用[10]。IL-1β和IL-6是具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，脊髓損傷早期，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生的IL-1β、IL-6能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)和功能，參與中樞神經(jīng)內(nèi)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，可能是導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域炎癥反應(yīng)放大，造成損傷后繼發(fā)免疫損傷的重要因素[11]。IL-10通過(guò)減少抑制促炎因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，是目前公認(rèn)的炎癥和免疫抑制因子。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MPO也是自由基生成的另一來(lái)源[12]，因此也可以對(duì)炎性反應(yīng)的損傷進(jìn)行評(píng)估。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可有效抑制機(jī)體TNF-α的合成和釋放，而作為炎癥過(guò)程中重要的啟動(dòng)因子，TNF-α的抑制使機(jī)體中IL-1β、IL-6等多種炎癥因子的釋放減少，從而減輕因脊髓損傷所致的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損害。

姜黃素具有良好的抗炎作用，其抗炎活性可比擬如吲哚美辛和保泰松等甾體藥物和非甾體類藥物，其抗炎作用主要通過(guò)抑制環(huán)氧酶(COX)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及轉(zhuǎn)錄因子如核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)等發(fā)揮效應(yīng)[13-14]。

由本實(shí)驗(yàn)可知，姜黃素可明顯改善急性脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能，使功能評(píng)分不同程度升高，可有效降低急性脊髓損傷大鼠脊髓勻漿液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10相關(guān)炎癥因子水平，還可不同程度降低勻漿液中MPO水平，提示姜黃素可降低急性脊髓損傷大鼠脊髓組織中炎性介質(zhì)，并能提高急性脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能，從而發(fā)揮保護(hù)作用。