張潔 宋怡軒 張鑫磊 張耀鴻

摘要：選用微堿性氮貧瘠的上海市崇明島稻田和微酸性氮豐富的南京市稻田剖面（0～50 cm），比較研究稻田土壤中氨氧化微生物類群豐度的差異及其環(huán)境驅(qū)動機(jī)制，評價(jià)其與氨氧化潛力的內(nèi)在關(guān)系。結(jié)果表明，崇明稻田的凈硝化速率為12.82～22.30 mg/（kg·d），明顯高于南京稻田[4.26～7.46 mg/（kg·d）]。崇明稻田土壤剖面的Comammox amoA基因總拷貝數(shù)（Clade A與Clade B之和）均值為1 g 8.8×106拷貝，是南京稻田的2.4倍，且Clade A與Clade B的比值范圍為2.5～12.7，證實(shí)了Comammox存在于2種不同類型的稻田土壤中。崇明稻田和南京稻田剖面的氨氧化細(xì)菌（AOB）的amoA基因拷貝數(shù)均值分別為1 g 3.75×108拷貝和1.23×108拷貝，氨氧化古菌（AOA）的amoA基因拷貝數(shù)均值分別為1 g 2.05×107拷貝和0.35×107拷貝，這2種菌群基因拷貝數(shù)均在10.1～20.0 cm土層達(dá)到最高?；貧w分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)稻田中氨氧化細(xì)菌（AOB）對氨氧化潛力的貢獻(xiàn)率達(dá)到90%～94%，而Comammox僅為3%左右，表明氨氧化細(xì)菌（AOB）在氨氧化過程中發(fā)揮主要作用。

關(guān)鍵詞：稻田;全程氨氧化細(xì)菌;氨氧化細(xì)菌;氨氧化古菌;氨氧化潛力

中圖分類號：S511.061文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）03-0584-07

Differentiation characteristics of complete ammonia-oxidizing microorganisms in different types of paddy soils

ZHANG Jie 1，2，SONG Yi-xuan 1，2，ZHANG Xin-lei 1，3，ZHANG Yao-hong1

（1.Nanjing University of Information Science and Technology， Collaborative Innovation Center for Forecast and Evaluation of Meteorological Disasters/Jiangsu Provincial Key Laboratory of Agricultural Meteorology， Nanjing 210044， China;2.State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture， Institute of Soil Science， Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210008， China;3.Shanxi Climate Center， Taiyuan 030006， China）

Abstract：In this study， the alkaline coastal paddy field profile （0-50 cm） with low nitrogen and acidic Nanjing paddy field profile with high nitrogen were selected to compare the abundance of ammonia-oxidizing microorganisms in paddy soils and its environmental driving mechanism， and to evaluate its internal relationship with ammonium oxidation potential was evaluated. The results showed that the net nitrification rate of coastal paddy fields ranged from 12.82 mg/（kg·d） to 22.30 mg/（kg·d）， which was significantly higher than that of Nanjing paddy fields [4.26-7.46 mg/（kg·d）]. The average number of total copies of comammox amoA gene （the sum of Clade A and Clade B） in the soil profile of coastal paddy fields was 8.8×106 copies per gram， which was 2.4 times greater than that of Nanjing paddy fields， confirming that comammox existed in two different types of paddy fields. In addition， the ratio of Clade A to Clade B ranged from 2.5 to 12.7. The average copy number of amoA gene of ammonia-oxidizing bacteria（AOB） in coastal and Nanjing paddy fields was 3.75×108 copies per gram and 1.23×108 copies per gram， respectively. The average copy number of amoA gene of ammonia-oxidizing archaea （AOA） was 2.05×107? copies per gram and 0.35×107 copies per gram， respectively. The abundance of these two bacteria were the highest in 10.0-20.0 cm soil layer. The results of regression analysis indicated that AOB contributed 90%-94% to the potential of ammonia oxidation in the two paddy fields， while comammox only contributed about 3%， indicating that AOB could play a major role in ammonia oxidation in the two soils.

Key words：paddy soils;complete ammonia oxidizers（comammox）;ammonia-oxidizing archaea（AOA）;ammonia-oxidizing bacteria（AOB）;potential of ammonia oxidation

硝化作用是自然界氮循環(huán)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化過程，也是農(nóng)田土壤氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié)[1]。氨氧化作用是硝化過程的第一步反應(yīng)，也是整個(gè)過程的限速步驟。一直以來，普遍認(rèn)為變形菌綱的氨氧化細(xì)菌（AOB）是其唯一承擔(dān)者，直到氨氧化古菌（AOA）被發(fā)現(xiàn)[2]，才證實(shí)了氨氧化過程是由AOB 和AOA 兩類微生物共同承擔(dān)。

根據(jù)經(jīng)典動力學(xué)理論計(jì)算，一種微生物獨(dú)自將NH3氧化為亞硝酸鹽，再繼續(xù)氧化為硝酸鹽的兩步氧化過程是可行的[3]。2015年底，科學(xué)家在水生生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了全程氨氧化微生物（Complete ammonia oxidizers，Comammox），能夠直接完成從NH+4到NO-3的氧化[4-5]。新近的研究結(jié)果證實(shí)，Comammox廣泛存在于農(nóng)田土壤、自然濕地、河流沉積物、廢水污泥和飲用水處理系統(tǒng)中[4-7]。但是，Comammox對氨氧化速率的貢獻(xiàn)以及與傳統(tǒng)的AOA和AOB如何相互競爭/共存及其相對重要性，仍不清楚，是目前研究的熱點(diǎn)。

稻田土壤因受到施肥、淹水、農(nóng)業(yè)耕作等因素的影響，其氨氧化及硝化作用非常強(qiáng)烈。有報(bào)道認(rèn)為，稻田土壤中NH3濃度的變化可能是驅(qū)動Comammox 和AOA及AOB的關(guān)鍵環(huán)境因子[8]。受農(nóng)業(yè)施肥的影響，稻田土壤中的活性N水平差異極大;且施肥往往會導(dǎo)致土壤酸化，深刻影響著活性N尤其是NH+4的存在形態(tài)。受H+介導(dǎo)的化學(xué)平衡影響，酸性土壤中NH3濃度通常遠(yuǎn)低于中性和堿性土壤[9]。經(jīng)典AOA和AOB的氨單加氧酶只能催化非離子態(tài)氨（NH3），而不能催化離子態(tài)銨（NH+4）[10];而Comammox是否也只能氧化非離子態(tài)氨仍不清楚。許多研究者認(rèn)為，AOA對NH3的親和力遠(yuǎn)高于AOB[11]。因此AOA 通常主導(dǎo)酸性土壤氨氧化[12]，而AOB 則在中性和堿性土壤中發(fā)揮作用[13-14]。而最新的研究結(jié)果則表明，全程氨氧化細(xì)菌對NH3的親和力遠(yuǎn)高于大多數(shù)可培養(yǎng)的AOA，能夠更好地適應(yīng)于極低NH3濃度的脅迫環(huán)境[15]。然而，在不同pH值、不同活性N水平的稻田土壤環(huán)境中，Comammox和AOA、AOB對稻田土壤氨氧化速率的相對貢獻(xiàn)仍不清楚。

因此，本試驗(yàn)選取2個(gè)不同類型的稻田——微堿性N貧瘠的長江口崇明稻田和微酸性N豐富的南京稻田，研究這2個(gè)稻田土壤剖面的氨氧化潛勢及各類氨氧化微生物的豐度，揭示兩者之間的內(nèi)在關(guān)系。

1材料與方法

1.1土壤樣品采集

采樣地點(diǎn)為上海市崇明島圍墾稻田（31.50°N， 121.92°E）和南京信息工程大學(xué)農(nóng)業(yè)氣象試驗(yàn)站稻田（32.16°N， 118.86°E）。兩個(gè)稻田都處于北亞熱帶濕潤氣候區(qū)，年均降水量1 000～1 100 mm，年均氣溫15.6 ℃。在每個(gè)稻田內(nèi)以S形設(shè)置6個(gè)采樣點(diǎn)，各采樣點(diǎn)間距約為10～15 m，用土鉆取 0～10.0 cm、10.1～20.0 cm、20.1～35.0 cm、35.1～50.0 cm的土層鮮土，并將相同深度土層的土樣充分混合，放入冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2土壤理化性質(zhì)測定

土壤全氮（TN）含量采用半微量凱氏定量法測定。土壤總有機(jī)碳（TOC）含量采用濃硫酸-重鉻酸鉀消煮-硫酸亞鐵滴定法測定。土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量用2 mol/L KCl溶液浸提后，采用AA3流動分析儀測定。土壤pH采用水土比為2.5∶1.0（質(zhì)量比）提取水溶液后，用數(shù)字酸度計(jì)測定。

用凈硝化速率反映稻田剖面土壤的好氧氨氧化潛力。凈硝化速率的測定采用好氣培養(yǎng)法。取沉積物土樣10 g（干基），加15 ml去離子水，將土樣分散均勻，形成懸濁液。稱取總質(zhì)量并記錄。25 ℃避光預(yù)培養(yǎng)7 d以便激活土壤微生物。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將每個(gè)土樣分為2組：第1組的3個(gè)錐形瓶，直接測定正式培養(yǎng)起始時(shí)刻（t0）的硝態(tài)氮濃度。第2組的6個(gè)錐形瓶中，用移液槍加入（NH4）2SO4溶液使N最終濃度達(dá)到200 mg/L，再根據(jù)質(zhì)量法補(bǔ)加去離子水，使之去離子水總量為20 ml，然后在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃避光培養(yǎng)7 d（t）后，取出錐形瓶，測定其中的硝態(tài)氮濃度。硝化速率的計(jì)算公式為：

N=[（NO-3）t-（NO-3）t0]/（t-t0），式中，N為硝化速率，單位為mg/（kg·d），（NO-3）t和（NO-3）t0 分別為t d和0 d時(shí)NO-3-N含量。

1.3土壤DNA提取

利用Fast DNA Spin kit for soil提取試劑盒 （MP Biomedicals， USA） 提取土壤樣品中的總DNA。取0.5 g土壤樣品，按試劑盒說明書的步驟提取DNA，取部分DNA提取液用分光光度計(jì)（NanoDrop -1000 UV-Vis）測定DNA濃度和純度。土壤DNA保存于-80 ℃冰箱待用。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在C1000TM Real-Time System擴(kuò)增儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。測定氨氧化古菌（AOA）、氨氧化細(xì)菌（AOB）和全程氨氧化細(xì)菌分支A與分支B（Comammox Clade A與Comammox Clade B）的amoA基因拷貝數(shù)。AOB、AOA、Comammox的 amoA基因定量 PCR 所用擴(kuò)增引物和擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[16]、[17]和[18]。反應(yīng)體系均為20.0 μl，包括DNA樣品1.0 μl、Taq DNA聚合酶10.0 μl、前后引物各0.5 μl、無菌水8.0 μl。提取氨氧化微生物的amoA基因的重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測序驗(yàn)證，再用分光光度計(jì)（ NanoDrop ND-1000 UV-Vis）測定質(zhì)粒濃度，并用無菌水將質(zhì)粒稀釋6～8個(gè)梯度，用于制作定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的基因的拷貝數(shù)。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過單因素方差分析（one-way ANOVA）和Pearson分析進(jìn)行土壤理化性質(zhì)、氨氧化微生物豐度的差異性以及相關(guān)性檢驗(yàn)，顯著性水平α=0.05。

2結(jié)果與分析

2.1不同類型稻田土壤的理化性質(zhì)

南京稻田和崇明稻田剖面的土壤理化性質(zhì)如表1所示。南京稻田土壤剖面中NH+4和NO-3含量范圍分別為8.6～9.6 mg/kg和13.1～17.8 mg/kg，明顯高于崇明稻田土壤剖面，且隨土壤深度的變化較小。而崇明稻田剖面中NH+4和NO-3含量變化幅度較大，表現(xiàn)為0～10.0 cm土層的硝態(tài)氮含量顯著高于底層，其垂直分布特征與南京稻田土壤明顯不同。南京稻田的TN和TOC均值分別為1.72 g/kg和18.68 g/kg，分別是崇明稻田的3.3倍和2.9倍。南京稻田剖面的pH值為6.3～6.5，崇明稻田剖面的pH值為7.6～7.9?？傮w而言，南京稻田為微酸性氮豐富土壤，且活性氮和總氮含量隨剖面深度增加而變化較小;崇明稻田為微堿性氮貧瘠土壤，且表層土壤活性氮和總氮含量顯著高于底層土壤。這為進(jìn)一步深入分析兩個(gè)稻田的氨氧化過程提供了很好的試驗(yàn)材料。

TN：土壤全氮;TOC：土壤總有機(jī)碳。同一列不同字母表示在0.05水平差異顯著。

2.2不同類型稻田土壤的硝化速率

圖1顯示，南京稻田的硝化速率為4.26～7.46 mg/（kg·d），其中，10.1～20.0 cm土層的土壤硝化速率顯著高于深層。崇明稻田的硝化速率為12.82～22.30 mg/（kg·d），表現(xiàn)為表層硝化速率最高，隨深度增加而逐漸減小。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)稻田的硝化速率與土壤氨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.66*和0.92*，與土壤TOC也呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.70*和0.87*。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3不同類型稻田土壤的氨氧化細(xì)菌和古菌豐度特征

由圖2可知，南京稻田和崇明稻田的氨氧化古菌（AOA）的amoA基因拷貝數(shù)（以干土計(jì)）均值分別為1 g 0.35×107拷貝和2.05×107拷貝，其中，在10.1～20.0 cm土層最高，分別為1 g 0.82×107拷貝和4.18×107拷貝。兩個(gè)稻田土壤的氨氧化細(xì)菌（AOB）的amoA基因拷貝數(shù)均值分別為1 g 1.23×108拷貝和3.75×108拷貝，其中，也在10.1～20.0 cm土層達(dá)到最高，分別為1 g 2.41×108拷貝和6.21×108拷貝。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，崇明稻田剖面中氨氧化古菌（AOA）與氨氧化細(xì)菌（AOB）的amoA基因拷貝數(shù)顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.92*。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.4不同類型稻田土壤的全程氨氧化細(xì)菌豐度特征

由圖3可知，兩個(gè)稻田土壤中全程氨氧化細(xì)菌Comammox Clade A的豐度差異很大。南京稻田和崇明稻田土壤的Comammox Clade A amoA基因拷貝數(shù)均值分別為1 g 0.29×107拷貝和0.87×107拷貝，其中，在10.1～20.0 cm土層達(dá)到最高，分別為1 g 0.73×107拷貝和1.97×107拷貝。兩個(gè)稻田剖面的Comammox Clade B amoA基因拷貝數(shù)均值分別為1 g 0.75×106拷貝和1.04×106拷貝，其中，也在10.1～20.0 cm土層達(dá)到最高，分別為1 g 2.15×106拷貝和2.22×106拷貝。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)稻田剖面中全程氨氧化細(xì)菌Comammox Clade A與Comammox Clade B的amoA基因拷貝數(shù)均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.98*和0.94*。

2.5不同類型稻田土壤氨氧化微生物拷貝數(shù)比較及對氨氧化速率的貢獻(xiàn)

對南京稻田和崇明稻田土壤的氨氧化微生物拷貝數(shù)進(jìn)行比較。結(jié)果（表2）表明，兩個(gè)稻田中氨氧化古菌（AOA）與全程氨氧化細(xì)菌的比值分別為1.54和2.32，說明兩者的拷貝數(shù)為同一數(shù)量級。相反，氨氧化細(xì)菌（AOB）與全程氨氧化細(xì)菌的比值均大于40，而且氨氧化細(xì)菌（AOB）與氨氧化古菌（AOA）的比值也均大于10，說明3類氨氧化微生物中，氨氧化細(xì)菌（AOB）的數(shù)量占有絕對優(yōu)勢。值得注意的是，兩個(gè)稻田中全程氨氧化細(xì)菌Clade A與Clade B的比值均高于1.0，說明Clade A在全程氨氧化細(xì)菌中數(shù)量上占有明顯優(yōu)勢。

將各類氨氧化微生物amoA基因拷貝數(shù)與硝化速率進(jìn)行線性回歸分析（表3），發(fā)現(xiàn)南京稻田和崇明稻田中，隨土壤硝化速率的增加氨氧化細(xì)菌AOB的響應(yīng)度均最大，其線性方程的斜率分別達(dá)到7.67和2.54;其次是氨氧化古菌（AOA），響應(yīng)度最小的是全程氨氧化細(xì)菌Clade A和Clade B。根據(jù)響應(yīng)方程進(jìn)一步計(jì)算氨氧化微生物對氨氧化速率的貢獻(xiàn)率，結(jié)果顯示兩個(gè)稻田中氨氧化細(xì)菌（AOB）對硝化速率的貢獻(xiàn)率達(dá)到90%～94%，而全程氨氧化細(xì)菌（Clade A+Clade B）的貢獻(xiàn)率僅為2.9%～3.4%。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

AOA：氨氧化古菌;AOB：氨氧化細(xì)菌;Comammox Clade A：全程氨氧化細(xì)菌分支A;Comammox Clade B：全程氨氧化細(xì)菌分支B。

AOA、AOB、Comammox Clade A、Comammox Clade B見表2注。

3討論

已有研究結(jié)果表明，全程氨氧化微生物可能廣泛分布于土壤、沉積物、水等生態(tài)環(huán)境中[4-7]。本研究在微酸性氮豐富的南京稻田和微堿性氮貧瘠的崇明稻田土壤中，均檢測出高數(shù)量級的全程氨氧化細(xì)菌（Comammox）amoA基因拷貝數(shù)，分支A（Comammox Clade A）與分支B （Comammox Clade B）amoA 基因拷貝數(shù)分別為1 g 0.5×106 ～2.0×107拷貝和1.1×105 ～2.2×106拷貝，證實(shí)了全程氨氧化細(xì)菌與氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）一樣，廣泛分布于不同類型的稻田土壤中。而且，兩個(gè)稻田土壤中Comammox amoA基因拷貝數(shù)（分支A 與分支B 之和）均值與AOA的數(shù)量級相同，說明全程氨氧化細(xì)菌可能在這兩種類型的水稻土硝化過程中發(fā)揮著一定的作用。

一般認(rèn)為，氨氧化過程是硝化反應(yīng)的第一步，也是限速步驟[19];氨氧化過程的反應(yīng)底物為非離子態(tài)氨（NH3）而不是離子態(tài)銨（NH+4）[10]，因此氨氧化過程是對pH高度敏感的典型生物學(xué)過程[20]。酸性土壤中NH3質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低，所以一直以來科學(xué)家們認(rèn)為硝化過程不能在酸性土壤中發(fā)生。但隨后越來越多的證據(jù)表明酸性土壤中也存在硝化作用[21]，但普遍低于中性或堿性土壤。本試驗(yàn)中，微酸性南京稻田土壤的硝化速率為5.58 mg/（kg· d），僅為微堿性崇明稻田的34%，原因可能是pH值導(dǎo)致南京稻田中硝化底物NH3含量降低而影響氨氧化作用，最終硝化速率減小。此外，已有許多研究結(jié)果表明，AOB 對氮肥更敏感，高氮條件下土壤中氨氧化過程的主要承擔(dān)者是AOB而非AOA[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)稻田土壤中，氨氧化細(xì)菌（AOB） amoA 基因拷貝數(shù)比AOA高出一個(gè)數(shù)量級，而且對硝化速率的貢獻(xiàn)率高達(dá)90%～94%，表明本試驗(yàn)稻田中氨氧化速率的主要貢獻(xiàn)者是AOB，而非AOA。

已有研究結(jié)果表明，全程氨氧化細(xì)菌（Comammox）可能更適應(yīng)低氮的貧營養(yǎng)環(huán)境。Kits 等通過氨氧化的動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，全程氨氧化細(xì)菌（Comammox）生長的氨底物Km值僅為0.05 μmol/L，遠(yuǎn)低于氨氧化古菌的Km值（0.7～4.4 μmol/L），表現(xiàn)出極強(qiáng)的氨底物捕獲能力[15]。此外，Palomo 等發(fā)現(xiàn)[22]，全程氨氧化細(xì)菌（Comammox）能編碼低氧、磷饑餓下高效表達(dá)的基因phoD。本試驗(yàn)中，盡管檢測到全程氨氧化細(xì)菌（Comammox）存在于兩個(gè)稻田中，但對氨氧化潛力的貢獻(xiàn)率僅為3%左右。Wang等[23]對長期施肥19年農(nóng)田中的全程氨氧化細(xì)菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)全程氨氧化細(xì)菌對土壤氨氧化速率和亞硝酸鹽還原速率的貢獻(xiàn)極小，認(rèn)為Comammox對底物NH3具有高親和力，而氨氧化速率很低，非常適應(yīng)于氨濃度極低的貧營養(yǎng)環(huán)境中，但在長期施肥的農(nóng)田中，氨濃度遠(yuǎn)高于這類微生物的需求量，其數(shù)量和酶促速率不隨施肥量增加而增加，表現(xiàn)出較小的氨氧化貢獻(xiàn)率。本試驗(yàn)的崇明稻田母質(zhì)盡管是河口沉積物，土壤養(yǎng)分較為貧瘠，但該圍墾稻田已有20年左右的種稻施肥歷史，其土壤全氮和活性氮含量明顯高于海堤之外的自然灘涂濕地[24]。因此，與其他養(yǎng)分貧瘠生態(tài)系統(tǒng)相比，兩個(gè)稻田中長期施肥導(dǎo)致的土壤氮含量增加，可能是全程氨氧化細(xì)菌（Comammox）對氨氧化潛力貢獻(xiàn)率降低的重要原因之一。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)類型稻田土壤中，全程氨氧化細(xì)菌（Comammox）Clade A與Clade B amoA基因拷貝數(shù)的比值均大于1.0，最高達(dá)12.7。Pjevac 等在意大利水稻土中檢測到全程氨氧化細(xì)菌分支A（Comammox CladeA）的豐度明顯高于分支B （Comammox Clade B）[25]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。王梅等報(bào)道在重慶中性紫色水稻土中全程氨氧化細(xì)菌以分支A（Comammox Clade A）為主，且Comammox Clade A 對施肥更敏感，隨施肥量增加而增加，而Comammox Clade B 卻無顯著變化[7]。本試驗(yàn)中兩個(gè)類型稻田土壤中全程氨氧化細(xì)菌（Comammox）也是以分支A（Comammox Clade A）為主，對硝化速率的貢獻(xiàn)可能遠(yuǎn)高于分支B（Comammox Clade B）。

參考文獻(xiàn)：

[1]賀紀(jì)正，張麗梅. 氨氧化微生物生態(tài)學(xué)與氮循環(huán)研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（1）：406-415.

[2]KNNEKE M，BERNHARD A E，DE LA TORRE J R，et al. Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon[J]. Nature， 2005， 437（7058）：543-546.

[3]COSTA E， PREZ J， KREFT J U. Why is metabolic labour divided in nitrification？[J] Trends in Microbiology， 2006， 14（5）： 213-219.

[4]DAIMS H， LEBEDEVA E V， PJEVAC P， et al. Complete nitrification by Nitrospira bacteria[J]. Nature， 2015， 528（7583）： 504-509.

[5]VAN KESSEL M A H J，SPETH D R，ALBERTSEN M， et al.Complete nitrification by a single microorganism[J]. Nature，2015， 528（7583）： 555-559.

[6]PALOMO A， JANE F S， GLAY A， et al. Metagenomic analysis of rapid gravity sand filter microbial communities suggests novel physiology of Nitrospira spp[J]. ISME Journal， 2016， 10（11）： 2569-2581.

[7]王梅，王智慧，石孝均，等. 長期不同施肥量對全程氨氧化細(xì)菌豐度的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)， 2018， 39（10）： 4727-4734.

[8]曹彥強(qiáng)，王智慧，莫永亮，等. 施肥和淹水管理對水稻土氨氧化微生物數(shù)量的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào)， 2019， 56（4）： 1004-1011.

[9]PROSSER J I， NICOL G W. Archaeal and bacterial ammonia-oxidisers in soil： the quest for niche specialisation and differentiation[J]. Trends in Microbiology， 2012， 20（11）： 523-531.

[10]SUZUKI I， DULAR U， KWOK S C. Ammonia and ammonium ion as substrate for oxidation by Nitrosomonas europaea cells and extracts[J]. Journal of Bacteriology， 1974， 120（1）： 556-558.

[11]MARTENS-HABBENA W，BERUBE P M，URAKAWA H，et al. Ammonia oxidation kinetics determine niche separation of nitrifying Archaea and Bacteria[J]. Nature， 2009， 461（7266）： 976-979.

[12]LU L， HAN W， ZHANG J， et al. Nitrification of archaeal ammonia oxidizers in acid soils is supported by hydrolysis of urea[J]. ISME Journal， 2012， 6（10）： 1978-1984.

[13]JIA Z J， CONRAD R. Bacteria rather than Archaea dominate microbial ammonia oxidation in an agricultural soil[J]. Environmental Microbiology， 2009， 11（7）： 1658-1671.

[14]XIA W， ZHANG C， ZENG X， et al. Autotrophic growth of nitrifying community in an agricultural soil[J]. ISME Journal， 2011， 5（7）： 1226-1236.

[15]KITS K D， SEDLACEK C J， LEBEDEVA E V， et al. Kinetic analysis of a complete nitrifier reveals an oligotrophic lifestyle[J]. Nature， 2017， 549（7671）： 269-272.

[16]YU C， HOU L， ZHENG Y， et al. Evidence for complete nitrification in enrichment culture of tidal sediments and diversity analysis of clade a comammox Nitrospira in natural environments[J]. Applied Microbiological Biotechnology， 2018， 102： 9363-9377.

[17]WANG M， HUANG G， ZHAO Z， et al. Newly designed primer pair revealed dominant and diverse comammox amoA gene in full-scale wastewater treatment plants[J]. Bioresource Technology， 2018， 270： 580-587.

[18]BEMAN J M， FRANCIS C A. Diversity of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in the sediments of a hyper-nutrified subtropical estuary： Bahía del Tóbari， Mexico[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2006， 72（12）： 7767-7777.

[19]PROSSER J I. Autotrophic nitrification in bacteria. Advances in microbial physiology[J]. Advances in Microbial Physiology，1990，30（1）：125-181.

[20]DE BOER W， KOWALCHUK G A. Nitrification in acid soils： micro-organisms and mechanisms[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2001， 33（7）： 853-866.

[21]DAHLGREN R A. Soil acidification and nitrogen saturation from weathering of ammonium-bearing rock[J]. Nature， 1994， 368（1）： 838-841.

[22]PALOMO A， PEDERSEN A G，F(xiàn)OWLER S J， et al. Comparative genomics sheds light on niche differentiation and the evolutionary history of comammox Nitrospira[J]. The ISME Journal， 2018， 12： 1779-1793.

[23]WANG J， WANG J L， RHODES G， et al. Adaptive responses of comammox Nitrospira and canonical ammonia oxidizers to long-term fertilizations： Implications for the relative contributions of different ammonia oxidizers to soil nitrogen cycling[J]. Science of the Total Environment， 2019， 668：224-233.

[24]林黎，崔軍，陳學(xué)萍，等. 灘涂圍墾和土地利用對土壤微生物群落的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2014， 34（4）： 899-906.

[25]PJEVAC P， SCHAUBERGER C， POGHOSYAN L， et al. AmoA-targeted polymerase chain reaction primers for the specific detection and quantification of comammox Nitrospira in the environment[J]. Frontiers in Microbiology， 2017， 8： 1508-1514.

（責(zé)任編輯：張震林）