尹萌 孫寓姣 李潔 徐上崴 趙娟娟

摘要：利用16s rRNA高通量測(cè)序技術(shù)研究了生物質(zhì)廢棄物玉米秸稈、畜禽糞便、活性污泥混合物在不同氧含量條件下發(fā)酵過(guò)程中微生物的群落特征變化，同時(shí)采用選擇培養(yǎng)基篩選對(duì)秸稈具有降解能力的菌株，以尋找能在秸稈還田中具有較大應(yīng)用潛力的菌種資源。高通量測(cè)序結(jié)果表明：在秸稈、畜禽糞便、污泥共發(fā)酵體系中，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，不同氧含量堆肥條件下發(fā)酵體系營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)、微生物群落結(jié)構(gòu)不同，氧含量較低的條件更有利于秸稈的降解。通過(guò)純培養(yǎng)方式得到的目的菌株對(duì)玉米秸稈降解效率最高可達(dá)28.9%，初步被確定為厚壁菌門中芽孢桿菌屬（Bacillus），進(jìn)一步證明結(jié)合高通量測(cè)序結(jié)果快速選擇生物質(zhì)廢棄物發(fā)酵體系中秸稈降解菌具有可行性。

關(guān)鍵詞：微生物群落;聯(lián)合發(fā)酵;秸稈降解;生物質(zhì)廢棄物

中圖分類號(hào)：S141.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）03-0591-08

Microbial diversity and screening of straw-degrading bacteria in different fermentation processes of biomass waste

YIN Meng，SUN Yu-jiao，LI Jie，XU Shang-wei，ZHAO Juan-juan

（College of Water Science， Beijing Normal University， Beijing 100875， China）

Abstract：The 16s rRNA high-throughput sequencing technology was used to study the characteristics of microbial communities during the co-fermentation of corn straw， livestock manure and sludge under different oxygen conditions. In order to find the strains with great potential in the return of straw to the field a selection medium was used to quickly screen the strains which could degrade straw. The results of high-throughput sequencing showed that Firmicutes， Bacteroidetes and Proteobacteria occupied absolute advantages in the co-fermentation system of straw， livestock manure and sludge. The nutrient structure and microbial community structure in fermentation system were different under different compositing conditions， and the condition of low oxygen content was more conducive to the degradation of straw. The highest degradation efficiency of target strain obtained by pure culture method was 28.9%， and the strain could be initially identified as Bacillus in the Firmicutes phylum. These results proved that it was feasible to select straw-degrading bacteria in co-fermentation system by combining high-throughput sequencing results.

Key words：microbial community;combined fermentation;straw degradation;biomass waste

畜禽糞便中含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和豐富的礦物質(zhì)，但當(dāng)前中國(guó)大多數(shù)畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)于畜禽糞便廢棄物缺乏有效的處理方法。污染源普查數(shù)據(jù)顯示，全國(guó)畜禽糞便產(chǎn)生量由2010年的3.252×109 t上漲至2017年的3.818×109 t，但其綜合利用效率仍不足60% [1]。堆肥等常見(jiàn)的畜禽糞便處理方式存在處理不徹底、效率低等缺點(diǎn)，而多項(xiàng)研究結(jié)果表明秸稈與糞便聯(lián)合發(fā)酵可以改善發(fā)酵底物的C/N比，使發(fā)酵體系更為穩(wěn)定、高效[2-3]。

污水處理廠污泥產(chǎn)量大，處理費(fèi)用高[4]。同時(shí)活性污泥中含有大量有機(jī)質(zhì)[5]，因此常作為發(fā)酵底物。但堆肥污泥存在含水率高、透氣性差、碳氮比低等問(wèn)題，而作物秸稈憑借有機(jī)營(yíng)養(yǎng)豐富、碳氮比含量高的特點(diǎn)[6]，可以作為調(diào)理劑為污泥消化提供良好環(huán)境。Meng等研究結(jié)果表明污泥、蘑菇渣、小麥秸稈共堆肥不僅能提高有機(jī)質(zhì)的降解率和堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量，而且還能促進(jìn)氨的吸收，減少氨的排放[7]。

2018年中國(guó)糧食總產(chǎn)量超過(guò)6.57×108 t，而作物秸稈產(chǎn)量約為1.04×109 t，占全世界秸稈總產(chǎn)量的20%～30%[8]。其中，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3種有機(jī)化合物占秸稈總固體物的80%以上[9]。由于秸稈具有復(fù)雜高能氫鍵晶體結(jié)構(gòu)，自然情況下難以降解，成為其資源化利用的技術(shù)瓶頸，結(jié)合生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)秸稈高效降解成為近些年來(lái)的研究重點(diǎn)。高速發(fā)展的第2代高通量測(cè)序技術(shù)可直接對(duì)混合微生物樣品進(jìn)行快速測(cè)序，成為解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的重要工具[9]。Meng等[10]研究了牛糞與玉米秸稈堆肥過(guò)程中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，Chen等[11]研究了長(zhǎng)期秸稈還田條件下土壤細(xì)菌群落的變化。

利用玉米秸稈、畜禽糞便、活性污泥聯(lián)合發(fā)酵，一方面能提高畜禽糞便、活性污泥發(fā)酵效率，解決其對(duì)環(huán)境的危害，減少其對(duì)土地資源的占用，另一方面可加快玉米秸稈腐解，促進(jìn)其再生利用。生態(tài)環(huán)境中自然因素、人為因素等都會(huì)引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，因此了解秸稈等生物質(zhì)廢棄物聯(lián)合發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)于改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、鞏固生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性等具有重要實(shí)踐意義[12]。本試驗(yàn)以玉米秸稈、畜禽糞便、活性污泥為底物，借助高通量測(cè)序等微生物群落分析核心技術(shù)，探究不同氧含量下聯(lián)合發(fā)酵過(guò)程中微生物的群落特征變化，并強(qiáng)化可培養(yǎng)菌群，通過(guò)分離培養(yǎng)方式篩選玉米秸稈降解菌，與新一代測(cè)序分析方法結(jié)合探究其發(fā)酵過(guò)程微生物群落結(jié)構(gòu)改變與秸稈降解之間規(guī)律，為秸稈資源化、生物質(zhì)廢棄物再生利用提供理論依據(jù)，同時(shí)為秸稈還田再利用提供菌種資源。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1玉米秸稈、畜禽糞便與活性污泥玉米秸稈曬干后經(jīng)破碎機(jī)打碎使其粒徑小于10 mm。新鮮牛糞樣品、發(fā)酵1年后的牛糞土壤混合物采集于河北省某養(yǎng)牛場(chǎng)。凍存的豬糞采集于北京某養(yǎng)豬場(chǎng)。活性污泥樣品采集于北京市某中水站曝氣反應(yīng)階段，污泥取回后靜置一段時(shí)間，倒去上清液后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2培養(yǎng)基秸稈粉選擇培養(yǎng)基：秸稈粉 5.00 g，MgSO4·7H2O 0. 50 g，KCl 0. 50 g，Na2HPO4 1.80 g，KH2PO4 0.30 g，NaCl 5.00 g，瓊脂粉15.00 g，定容至1 000 ml，pH 7～8。LB培養(yǎng)基：NaCl 10.00 g，胰蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，定容至1 000 ml，用于菌種分離后的富集生長(zhǎng)。無(wú)機(jī)培養(yǎng)液：MgSO4·7H2O 0.50 g，KCl 0.50 g，Na2HPO4 1.80 g，KH2PO4 0.30 g，NaCl 5.00 g，定容至1 000 ml，pH 7～8。

1.2試驗(yàn)裝置與方法

1.2.1試驗(yàn)裝置試驗(yàn)裝置為自制發(fā)酵罐（圖1）。發(fā)酵罐上層與空氣接觸良好，氧氣含量充足;中層與空氣接觸受到阻礙，氧氣含量低，可以滿足兼性厭氧菌或好氧菌的生長(zhǎng);底層難以與空氣接觸，氧氣含量極低。取新鮮牛糞、發(fā)酵1年后的牛糞土壤混合物、少量?jī)龃娴呢i糞與中水站污泥（未脫水）按體積比1∶1∶1∶1混合，取與上述泥糞混合物相同體積的玉米秸稈與之混合后置于15 cm×15 cm×30 cm的發(fā)酵罐中，發(fā)酵處理21 d后從發(fā)酵罐上、中、下層出口處取樣。此外，將10.00 g發(fā)酵罐中泥糞混合物與1.00 g秸稈粉放入2個(gè)250 ml的錐形瓶中，加入超純水定容至200 ml，作為強(qiáng)化可培養(yǎng)菌體系，記為A、B兩組。

1.2.2微生物多樣性分析分別對(duì)豬糞（記為X1）、發(fā)酵罐上、中、下層發(fā)酵21 d后的樣品（分別記為X2、X3、X4）、發(fā)酵罐中發(fā)酵前樣品（記為X5）、強(qiáng)化可培養(yǎng)體系搖瓶培養(yǎng)15 d后的樣品（A組記為X6、B組記為X7）的微生物群落進(jìn)行分析。利用CTAB法抽提土壤基因組DNA，將純化的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用于DNA測(cè)序，測(cè)序樣品通過(guò)TruSeq DNA kit（Illumina，美國(guó)）進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，采用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)16S rDNA的V3V4高變區(qū)，所用引物序列為338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。隨后通過(guò)生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列分析和物種注釋，了解樣品微生物群落組成情況，利用Observed species 指數(shù)和Chao1 指數(shù)表征群落中物種的數(shù)量，利用Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)綜合評(píng)估群落中物種的豐富度和均勻度，通過(guò)多樣性分析進(jìn)一步比較樣品之間的差異性。

1.2.3菌種分離培養(yǎng)設(shè)置A、B兩組強(qiáng)化可培養(yǎng)體系，更好地評(píng)價(jià)可培養(yǎng)菌群系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。與A組相比，B組加入1 ml可更好地發(fā)揮系統(tǒng)中各類微生物效果的EM菌劑，分別加水定容至200 ml，置于磁力攪拌器上攪拌。搖瓶培養(yǎng)15 d后取A組上清液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，將稀釋了104、105、106倍后的樣品涂布于選擇培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿倒置放入恒溫生化培養(yǎng)箱中，34 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后取出培養(yǎng)皿觀察菌落生長(zhǎng)情況。選擇部分單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，同時(shí)接入LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4目的菌種分析鑒定以所得秸稈降解目的菌DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：20～30 ng/μl模板1.5 μl，10 pmol/μl上、下游引物各1.0 μl，2×Master Mix 12.5 μl，ddH2O 9.0 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;60 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min;設(shè)置30個(gè)循環(huán);72 ℃后保溫5 min。所用引物為通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492R： 5′-GGCTACCTTGTT ACGACT T-3′。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，測(cè)序。登錄NCBI網(wǎng)站，利用Blast程序?qū)y(cè)得數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比較分析。

1.2.5秸稈粉降解率測(cè)定稱取1.00 g玉米秸稈粉（直徑2 mm）置于40 ml無(wú)機(jī)培養(yǎng)液中，加入4 ml擴(kuò)大培養(yǎng)所得菌液，對(duì)照組不加菌液，室溫下150 r/min搖床培養(yǎng)5 d。離心棄去上清液，用蒸餾水反復(fù)清洗3次，每次清洗后離心棄去上清液[13]。60 ℃恒溫烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量精確至0.01 g，通過(guò)質(zhì)量差計(jì)算菌液對(duì)秸稈粉的降解能力。

2結(jié)果與分析

2.1生物質(zhì)廢棄物不同發(fā)酵條件下微生物多樣性變化

為揭示秸稈、畜禽糞便、活性污泥聯(lián)合發(fā)酵過(guò)程中微生物的演替規(guī)律，分別對(duì)發(fā)酵罐上、中、下層發(fā)酵21 d后的樣品、發(fā)酵罐中發(fā)酵前樣品、強(qiáng)化可培養(yǎng)菌系統(tǒng)搖瓶培養(yǎng)15 d后的樣品微生物群落進(jìn)行分析，利用高通量測(cè)序分析方法分析生物質(zhì)廢棄物聯(lián)合發(fā)酵過(guò)程中群落結(jié)構(gòu)改變與秸稈降解之間的規(guī)律。

稀釋曲線可比較測(cè)序數(shù)量不同的樣本中物種的豐度，說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)是否合理。稀釋曲線（圖2）顯示，隨著樣品序列數(shù)增加曲線逐漸趨于平緩，說(shuō)明各樣品OUT（操作分類單元）覆蓋度已趨于飽和，測(cè)序深度足以檢測(cè)到各樣品中優(yōu)勢(shì)微生物。

X1為豬糞樣品，X2、X3、X4分別為發(fā)酵罐上、中、下層發(fā)酵21 d后的樣品，X5為發(fā)酵罐中發(fā)酵前樣品，X6、X7分別為A組、B組搖瓶培養(yǎng)15 d后的樣品。

發(fā)酵過(guò)程中氧含量不同使得生物質(zhì)廢棄物聯(lián)合發(fā)酵體系中微生物多樣性指數(shù)發(fā)生不同程度的變化（表1）。發(fā)酵罐中層樣品（X3）Shannon指數(shù)為6.012，顯著高于發(fā)酵前樣品（X5），說(shuō)明發(fā)酵罐中層氧氣含量較低的環(huán)境對(duì)細(xì)菌多樣性的促進(jìn)作用較強(qiáng)，可有效增強(qiáng)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性。而在氧含量充足（X2）及缺氧條件（X4）下，其Shannon 指數(shù)分別為5.135、4.738，說(shuō)明富氧及缺氧條件對(duì)發(fā)酵體系中細(xì)菌多樣性有所抑制。Simpson指數(shù)等變化趨勢(shì)也同時(shí)表明發(fā)酵過(guò)程中氧氣含量的不同會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵體系中細(xì)菌多樣性發(fā)生變化，低氧條件更有利于發(fā)酵體系中細(xì)菌群落穩(wěn)定性的維持。有研究結(jié)果表明，發(fā)酵體系中氧含量不同，發(fā)酵方式不同，功能微生物也不同[14-15]。

各樣品見(jiàn)圖2注。

不同氧含量條件下秸稈等生物質(zhì)廢棄物聯(lián)合發(fā)酵各樣品的OTU分布圖（圖3）顯示，與發(fā)酵前樣品（X5）相比，X4樣品的重疊OUT數(shù)最高，與發(fā)酵前樣品有更高的相似性;X3樣品的獨(dú)有OUT數(shù)最高，這表明當(dāng)玉米秸稈、畜禽糞便、活性污泥在低氧含量條件下聯(lián)合發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生較多新的細(xì)菌群落。

樣品X2、X3、X4、X5見(jiàn)圖2注。

2.2不同發(fā)酵條件對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

利用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)7個(gè)樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，共檢測(cè)到154 420條有效序列，4 617個(gè)OUT，得到的細(xì)菌有33個(gè)門類，65個(gè)綱，94個(gè)目，162個(gè)科，260個(gè)屬。同時(shí)選取相對(duì)豐度在1%（默認(rèn)值）以上的物種繪制物種相對(duì)豐度分布圖，在門和科的分類學(xué)水平上對(duì)細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析。

圖4為秸稈等生物質(zhì)廢棄物在不同氧含量條件下聯(lián)合發(fā)酵樣品細(xì)菌在門分類學(xué)水平下的分類，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）在各樣品中所占比例為3.81%～54.24%，厚壁菌門（Firmicutes）為7.30%～65.88%，變形菌門（Proteobacteria）為4.53%～49.52%，放線菌門（Actinobacteria）為0.31%～15.00%，這與杜洋[8]的研究結(jié)果相似。與發(fā)酵前樣品（X1、X5）相比，秸稈、畜禽糞便、活性污泥聯(lián)合發(fā)酵21 d后的樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變， 其中Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度總量占細(xì)菌界總量的84%以上，這是因?yàn)槠鋵?duì)碳水化合物、蛋白質(zhì)等復(fù)雜有機(jī)物具有水解、酸化能力[16]。不同氧含量下秸稈等生物質(zhì)廢棄物聯(lián)合發(fā)酵樣品群落結(jié)構(gòu)變化各不相同，發(fā)酵罐底層氧氣含量極低的條件下樣品與發(fā)酵前樣品相比細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化并不顯著，其余各試驗(yàn)組Proteobacteria相對(duì)豐度49.51%（X2）、37.03%（X3）、36.10%（X6）、29.35%（X7）均高于發(fā)酵前樣品（X5），Proteobacteria細(xì)菌為細(xì)菌界中最大的一門，均為革蘭氏陰性菌，各成員代謝類型不同，對(duì)有機(jī)物的去除具有很大作用[17]。與發(fā)酵前樣品相比，發(fā)酵罐中層樣品（X3）、2組強(qiáng)化可培養(yǎng)菌系統(tǒng)樣品（X6、X7）中Bacteroidetes相對(duì)豐度顯著提高。已有研究結(jié)果表明Bacteroidetes細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程中利用周圍環(huán)境中的物質(zhì)生長(zhǎng)，Bacteroidetes 作為多種厭氧消化反應(yīng)器中的一種優(yōu)勢(shì)菌門，對(duì)纖維素、碳水化合物和半纖維素及其他多糖物質(zhì)等均具有一定的降解能力[18-19]。唐濤濤等[20]研究結(jié)果表明Bacteroidetes相對(duì)豐度隨秸稈添加量的增加而增加。賈洋洋[15]將玉米秸稈堆成大堆發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在表層下60～80 cm處環(huán)境基本滿足好氧或兼性厭氧菌的生長(zhǎng)，為秸稈降解的主要位置。Bacteroidetes相對(duì)豐度明顯與其他生境明顯不同，證明Bacteroidetes與秸稈降解息息相關(guān)，也說(shuō)明氧含量較低的條件更有利于本研究發(fā)酵底物中玉米秸稈的降解。而Firmicutes細(xì)胞壁中肽聚糖質(zhì)量濃度高，大多可產(chǎn)生芽孢，借以抵抗脫水和極端環(huán)境，因此成為發(fā)酵初期主要優(yōu)勢(shì)菌門。Firmicutes中芽孢桿菌綱細(xì)菌可形成抗逆性極強(qiáng)的芽孢，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，在環(huán)保、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中具有重要作用[17]。同時(shí)Firmicutes細(xì)菌能夠降解蛋白質(zhì)、纖維素等大分子化合物，可協(xié)助Bacteroidetes降解秸稈中富含的纖維素[21-22]。富氧條件模擬好氧堆肥情況，與其他試驗(yàn)組相比，富氧條件下Actinobacteria相對(duì)豐度顯著提高，進(jìn)一步表明氧含量不同是造成發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)差異的重要原因之一。

為深入了解不同氧含量對(duì)秸稈、畜禽糞便、活性污泥聯(lián)合發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，在科分類學(xué)水平上對(duì)細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析。結(jié)果（圖5）表明優(yōu)勢(shì)菌科包括梭菌科（Clostridiaceae，2.54%～41.20%）、卟啉單胞菌科（Porphyromonadaceae，0.20%～29.32%）、芽孢桿菌科（Bacillaceae，0.10%～1.08%）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae，0.35%～8.97%）等。不同含氧量下底物發(fā)酵后微生物群落結(jié)構(gòu)顯著不同，發(fā)酵罐中層及兩組強(qiáng)化可培養(yǎng)系統(tǒng)中Porphyromonadaceae豐度明顯增加。王春芳等[23]從堆肥中富集得到的2組秸稈降解菌系共有的優(yōu)勢(shì)物種之一為Porphyromonadaceae，并確定其有秸稈降解能力?？镄≈榈萚24]在農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈厭氧降解研究過(guò)程中同樣分離得到1株P(guān)orphyromonadaceae細(xì)菌，進(jìn)一步說(shuō)明這種含氧條件下秸稈等底物共發(fā)酵更有利于玉米秸稈的降解。除此之外，還有一些微生物存在于發(fā)酵體系中，如Clostridiaceae，該種群具有較普遍的纖維素分解能力[25]，是降解秸稈纖維素的重要微生物資源，其產(chǎn)生的纖維素酶將各組分聚集在一起，形成纖維小體[23]，因此這些微生物的存在也有利于秸稈纖維的降解。

各樣品見(jiàn)圖2注。

各樣品見(jiàn)圖2注。

圖6顯示，不同氧含量下秸稈等生物質(zhì)廢棄物發(fā)酵對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同影響，形成各不相同的優(yōu)勢(shì)菌屬，比如，與發(fā)酵前樣品（X5）相比，在氧含量充足的條件（X2）下Acinetobacter相對(duì)豐度增長(zhǎng)顯著，由5.60%增長(zhǎng)至22.64%。研究者曾以水稻秸稈為唯一碳營(yíng)養(yǎng)源進(jìn)行秸稈降解菌群的篩選，發(fā)現(xiàn)Arthrobacter細(xì)菌能夠合成分泌纖維素酶以及木質(zhì)素酶以促進(jìn)木質(zhì)纖維素的降解[26]。而在氧氣含量較低的條件（X3）下Sphingopyxis相對(duì)豐度有所增加;在基本無(wú)氧條件（X4）下Carnobacterium、Enterococcus等相對(duì)豐度變化明顯，分別由1.7.%、0.27%增長(zhǎng)至12.83%、4.01%。Enterococcus屬于好氧細(xì)菌，能消耗利用可溶性碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)成分引起秸稈腐敗變質(zhì)[27]。顯然，秸稈等生物質(zhì)廢棄物聯(lián)合發(fā)酵一方面有利于微生物種類、總體數(shù)量的增加，另一方面可提高與秸稈降解相關(guān)的菌種含量，但不同處理方式下微生物優(yōu)勢(shì)種屬各不相同。在OUT水平下的主坐標(biāo)分析結(jié)果（圖7）表明，基本無(wú)氧條件下的樣品（X4）與發(fā)酵前樣品（X5）群落結(jié)構(gòu)更為相近，而氧含量充足的條件（X2）及氧氣含量較低的條件（X3）下群落結(jié)構(gòu)變化更為顯著，驗(yàn)證了不同氧含量下秸稈等生物質(zhì)廢棄物聯(lián)合發(fā)酵對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同影響。

X1～X7各樣品見(jiàn)圖2注。

X1～X7各樣品見(jiàn)圖2注。

2.3功能菌種的鑒定及其對(duì)秸稈降解效果

在秸稈粉選擇培養(yǎng)基上初步分離得到4株秸稈降解菌。對(duì)其16S rRNA序列進(jìn)行測(cè)定，將其與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果如表2所示。

常溫下，以玉米秸稈為唯一碳源，以10%的接種量將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液接種至滅菌無(wú)機(jī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d，采用差減法測(cè)定菌液對(duì)秸稈的降解效率。結(jié)果（圖8）表明，從強(qiáng)化可培養(yǎng)體系中馴化分離所得4株菌株對(duì)玉米秸稈均有明顯降解效果，其中Bacillus amyloliquefaciens對(duì)玉米秸稈的降解率達(dá)到28.9%，明顯優(yōu)于王加友等[28]分離得到的SY-403菌株。原因可能是該菌株可以產(chǎn)生半纖維素酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、纖維素酶等秸稈降解酶，通過(guò)斷裂秸稈中木質(zhì)素單體之間的連接鍵，使其成為小分子芳香族化合物等[29]。

圖84株單菌株對(duì)玉米秸稈的降解效率

Fig.8Straw degradation efficiency of single bacterial strains

分離所獲得的4株秸稈降解菌均為芽孢桿菌科，其在7組樣品中相對(duì)含量如圖9所示。不同發(fā)酵條件對(duì)生物質(zhì)廢棄物聯(lián)合發(fā)酵體系中微生物產(chǎn)生不同影響。與其他試驗(yàn)組相比，低氧含量條件（X3）下Bacillaceae相對(duì)豐度顯著增長(zhǎng)，進(jìn)一步表明低氧條件下秸稈粉等生物質(zhì)廢棄物聯(lián)合發(fā)酵更有利于秸稈的降解。但是，傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法分離得到的微生物僅占總數(shù)的1%[30]，因此分離富集培養(yǎng)方法很難反應(yīng)自然條件下微生物多樣性信息[31]，而高通量測(cè)序能夠繞過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)直接獲得原位環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)信息。分析原位生物質(zhì)廢棄物降解功能菌群優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)含量，可以為解析環(huán)境中微生物群落物種組成、功能提供重要參考。

X1～X7各樣品見(jiàn)圖2注。

3結(jié)論

氧含量不同對(duì)玉米秸稈、畜禽糞便、活性污泥發(fā)酵體系中微生物群落結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生顯著影響。高通量測(cè)序結(jié)果表明：在發(fā)酵體系中，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度高，占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。其中，發(fā)酵罐中層（X3）、2組強(qiáng)化可培養(yǎng)菌系統(tǒng)（X6、X7）中可促進(jìn)碳水化合物、秸稈纖維素和半纖維素及其他多糖物質(zhì)等有機(jī)物降解的Bacteroidetes相對(duì)豐度變化尤為顯著，說(shuō)明氧含量較低的條件更有利于秸稈的降解。

通過(guò)純培養(yǎng)方式獲得的4株秸稈降解菌均為芽孢桿菌屬，其對(duì)玉米秸稈降解效率最高可達(dá)28.9%。高通量測(cè)序結(jié)果說(shuō)明與其他試驗(yàn)組相比，在較低氧含量條件（X3）下Bacillaceae相對(duì)豐度增長(zhǎng)明顯，進(jìn)一步證明氧含量較低的條件有利于秸稈降解。利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方式與新一代測(cè)序方法結(jié)合，探究生物質(zhì)廢棄聯(lián)合發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性變化與秸稈降解之間的規(guī)律，可以為完善生物質(zhì)廢棄物再利用提供理論依據(jù)，也為秸稈還田提供菌種資源。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱曉春，杜曉丹，賈向春，等.規(guī)?；膛Ｄ翀?chǎng)糞污資源化利用標(biāo)準(zhǔn)化研究[J].中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化，2019（21）：179-183.

[2]KIM M， YANG Y， MORIKAWA-SAKURA M S， et al. Hydrogen production by anaerobic co-digestion of rice straw and sewage sludge[J]. International Journal of Hydrogen Energy，2012， 37（4）： 3142-3149.

[3]WANG X， YANG G， FENG Y， et al. Optimizing feeding composition and carbon-nitrogen ratios for improved methane yield during anaerobic co-digestion of dairy， chicken manure and wheat straw[J]. Bioresource Technology， 2012， 120： 78-83.

[4]ZHAO J， GUI L， WANG Q， et al. Aged refuse enhances anaerobic digestion of waste activated sludge[J]. Water Research， 2017， 123： 724-733.

[20]唐濤濤，李江，楊愛(ài)江，等. 秸稈類型及配比變化對(duì)污泥厭氧消化中微生物群落的影響[J]. 化工進(jìn)展， 2020，39（2）： 667-678.

[21]于靜，谷潔，王小娟，等. 微生物菌劑對(duì)雞糞堆肥過(guò)程中氨氣排放和微生物群落的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2019， 28（11）： 1861-1870.

[22]令利軍，何楠，白雪，等. 基于高通量測(cè)序的玉米秸稈自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)特征[J]. 蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2017， 53（4）： 526-533.

[23]王春芳，馬詩(shī)淳，黃艷，等. 降解水稻秸稈的復(fù)合菌系及其微生物群落結(jié)構(gòu)演替[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2016， 56（12）： 1856-1868.

[24]匡小珠，邱艷玲，師曉爽，等. 一株新屬水平厭氧發(fā)酵性細(xì)菌的分離與鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010，38（17）： 8840-8843.

[25]TSUCHIDATE T， TATENO T， OKAI N， et al. Glutamate production from β-glucan using endoglucanase-secreting Corynebacterium glutamicum[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2011， 90（3）： 895-901.

[26]康志超. 耐低溫木質(zhì)纖維素降解菌群的構(gòu)建及其應(yīng)用研究[D]. 長(zhǎng)春：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)（中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所）， 2019.

[27]任海偉，孫安琪，任軍樂(lè)，等. 添加白菜尾菜和甲酸對(duì)干玉米秸稈貯存品質(zhì)的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào). 2019， 28（8）： 61-71.

[28]王加友，趙彭年，楊德玉，等. 一株纖維素分解菌的篩選、鑒定及其對(duì)玉米秸稈的降解效果[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展， 2018， 8（2）： 132-139.

[29]李紅亞，李術(shù)娜，王樹香，等. 產(chǎn)芽孢木質(zhì)素降解菌MN-8的篩選及其對(duì)木質(zhì)素的降解[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014， 47（2）： 324-333.

[30]ALAIN K， QUERELLOU J. Cultivating the uncultured： limits， advances and future challenges[J]. Extremophiles， 2009， 13（4）： 583-594.

[31]ROSSELLO M R， AMAN R. The species concept for prokaryotes[J].FEMS Microbiology Reviews，2001， 25（1）：39-67.

（責(zé)任編輯：張震林）