杜尚廣，余波

·生物技術(shù)與方法·

木薯基因的電子克隆與生物信息學(xué)分析

杜尚廣，余波

南昌師范學(xué)院 生物系，江西 南昌 330000

是植物響應(yīng)高溫脅迫的關(guān)鍵基因，在防止蛋白變性、保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和維持植物正常生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用，克隆基因是揭示木薯抵抗高溫脅迫分子機(jī)制的基礎(chǔ)。為得到木薯同源基因及分析其表達(dá)蛋白的性質(zhì)，文中采用電子克隆技術(shù)對新基因進(jìn)行組裝和衍生，并使用生物信息學(xué)分析方法，對預(yù)測蛋白的一級至高級結(jié)構(gòu)、親水性/疏水性、信號肽、蛋白同源性和系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行全面解析。結(jié)果表明，基因含有969個堿基對，其開放閱讀框有705個堿基，預(yù)測蛋白含234個氨基酸。預(yù)測蛋白是非跨膜蛋白，具有堿性和親水性，主要定位于葉綠體內(nèi)。通過多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，木薯與巴西橡膠樹、蓖麻和麻瘋樹等植物的HSP21蛋白同源性較高。結(jié)果可為該基因的克隆和轉(zhuǎn)化提供參考依據(jù)。

木薯，基因，電子克隆，生物信息學(xué)

木薯 (Crantz)，又稱樹薯，與甘薯、馬鈴薯并稱為全球三大薯類，它是國內(nèi)外廣泛種植的大戟科木薯屬糧食作物，也是一種價值很高的工業(yè)材料和養(yǎng)殖飼料，被譽(yù)為“淀粉之王”、“地下糧倉”[1]。木薯具有耐貧瘠[2]、耐干 旱[3]、喜高溫[4]的特點，單位面積產(chǎn)量較高，是一種適應(yīng)性很強(qiáng)的作物。目前木薯研究主要集中在種質(zhì)抗寒、農(nóng)藝性狀等方面，對抗高溫分子機(jī)制的研究較少[5]。

小熱休克蛋白(Small heat shock proteins，sHSPs) 基因廣泛存在于植物中，它是熱激蛋白基因家族中一類重要的熱應(yīng)激基因，高溫脅迫會激發(fā)該基因的表達(dá)[6-7]。sHSPs能有效抑制蛋白質(zhì)變性、保持細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架穩(wěn)定及誘導(dǎo)抵抗高溫脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，所以它在維持植物正常生命活動中發(fā)揮重要作用[8-11]。高溫環(huán)境下，sHSPs能夠有效調(diào)節(jié)植物細(xì)胞膜的流動性，并與構(gòu)象改變的蛋白質(zhì)結(jié)合，等溫度恢復(fù)正常時，蛋白質(zhì)與之分離并恢復(fù)正常的構(gòu)象；并且sHSPs能防止細(xì)胞發(fā)生非正常凋亡，有效減少高溫對植物的傷害[12-14]。

HSP21熱激蛋白是一類重要的sHSP蛋白，是一種進(jìn)化上比較保守的蛋白質(zhì)，它廣泛分布于植物的各個部位[15]。對擬南芥、水稻和煙草等模式植物研究發(fā)現(xiàn)，HSP21熱激蛋白不僅在高溫中抵抗熱脅迫，也在其他脅迫時保護(hù)細(xì)胞，并在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[16-17]。近年來，sHSP基因的功能在模式植物中得到廣泛的研究，而木薯sHSP基因的功能還存在許多盲區(qū)，甚至基因尚未被克隆[16-17]。木薯是廣泛種植于熱帶和亞熱帶的耐熱性作物，克隆基因可為其表達(dá)載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化以及熱脅迫下光合保護(hù)機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的基因克隆技術(shù)主要包含簡并序列克隆技術(shù)、定位克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽克隆技術(shù)等，這些方法雖能較好地完成基因克隆的目的，但實驗步驟繁瑣、試劑用量大且時間太長，并耗費(fèi)大量人力和物力[18-19]?；螂娮涌寺〖夹g(shù)是利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫對目標(biāo)基因的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST序列) 進(jìn)行采集、組裝和衍生，得到所需要的cDNA序列，該技術(shù)不僅能準(zhǔn)確、快速地得到新基因，而且節(jié)省大量的人力物力。

本研究使用電子克隆技術(shù)，利用擬南芥基因的核苷酸序列，得到木薯相應(yīng)的EST序列，利用序列組裝軟件進(jìn)行拼結(jié)、衍生，得到木薯基因的cDNA序列，并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測其表達(dá)蛋白的性質(zhì)。這為該基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化以及熱脅迫分子機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 木薯HSP21基因的電子克隆

以擬南芥的基因序列(Gene ID：828881) 為探針，在木薯的EST庫中通過blastn搜尋同源的EST序列，選擇能夠覆蓋探針核苷酸序列的EST序列，利用CAP3在線軟件(http://doua.prabi.fr/software/cap3) 對序列進(jìn)行組裝和衍生，得到的cDNA繼續(xù)對比，直至無新的EST序列可組裝。

1.2 木薯HSP21基因的序列分析

分別利用DNAMAN、ORFfinder完成氨基酸序列的翻譯和開放閱讀框的尋找；分別利用在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/和https://web. expasy.org/protscale/)分析表達(dá)蛋白的基本理化指數(shù)、親水性/疏水性[1-3]；分別利用在線軟件ProtComp v9.0和TMHMM工具分析該蛋白亞細(xì)胞定位和跨膜區(qū)域；利用NetPhos 3.0和SignalP 4.1在線軟件分析磷酸化位點與信號肽；使用SOPMA和SWISS-MODEL在線軟件分析二級及高級結(jié)構(gòu)。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用ClustalX 2.0對木薯、巴西橡膠樹、蓖麻、麻瘋樹等12種不同物種的HSP21氨基酸序列進(jìn)行多重比對[1-3]，參數(shù)默認(rèn)，保存aln文件；然后在MEGA X軟件中打開該aln文件，建立HSP21同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，以Kimura雙參數(shù)模型計算遺傳距離，設(shè)置檢驗方法(Bootstrap method)，循環(huán)次數(shù)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯HSP21基因cDNA克隆

利用擬南芥核苷酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行木薯EST序列的blastn，得到4條相關(guān)的EST序列，并具有重疊群特點，使用CAP3在線軟件拼裝和衍生，獲得一段總長為969個堿基的cDNA序列(圖1)。使用ORFfinder軟件分析可知，此cDNA的ORF框為112–816 堿基(圖2)，起始和終止密碼子分別是ATG和TGA，表達(dá)蛋白含有234個氨基酸。Blastx分析表明，該序列與巴西橡膠樹、蓖麻的HSP21蛋白具有較高的親緣關(guān)系[19-21]，序列一致性分別為83%和73%，且能比對到同源蛋白的首尾兩端，即該cDNA序列是完整的，命名基因為，表達(dá)蛋白為MeHSP21。

圖1 木薯HSP21基因的cDNA拼接圖

2.2 MeHSP21基因表達(dá)蛋白理化性質(zhì)分析

使用ProtParam tool分析cDNA表達(dá)蛋白的理化參數(shù)，該蛋白質(zhì)分子式、分子量和理論等電點分別為C1134H1847N327O359S10、26.10 kDa和7.71，是堿性蛋白質(zhì)；脂肪系數(shù)、負(fù)電荷殘基(天冬氨酸+谷氨酸) 和正電荷殘基(精氨酸+賴氨酸) 分別是74.91、35.00和36.00；不穩(wěn)定系數(shù)和平均總親水性分別是36.01和–0.584，屬于穩(wěn)定親水蛋白 (表1)。預(yù)測蛋白含有20種氨基酸，含量最多的是絲氨酸(Ser)，最少的是組氨酸(His) 和酪氨酸(Tyr)。

2.3 MeHSP21基因表達(dá)蛋白疏水性/親水性分析

對木薯MeHSP21蛋白的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行ProtScale分析，該多肽鏈的第216位Phe和第 174位的Lys分別具有最高分值(1.500) 和最低分(–2.867)，即前者疏水性最強(qiáng)，后者親水性最強(qiáng)(圖3)。利用ProtParam分析可知，氨基酸序列平均疏水指數(shù)為–0.584，即該蛋白為親水性蛋白。

2.4 亞細(xì)胞定位和跨膜區(qū)分析

使用ProtComp v.9.0在線軟件分析目標(biāo)蛋白亞細(xì)胞定位 (表2)，在葉綠體中此蛋白質(zhì)具有最大分?jǐn)?shù)(9.27)；即表達(dá)蛋白可能是主要定位于葉綠體內(nèi)的功能蛋白。利用TMHMM v.2.0在線分析 (圖4)，此蛋白質(zhì)沒有明顯的跨膜區(qū)，為非生物膜上的功能蛋白。

2.5 磷酸化位點與信號肽分析

蛋白質(zhì)磷酸化是成熟后修飾的重要方式，磷酸化修飾和表達(dá)蛋白的功能成正相關(guān)[22-24]。利用NetPhos 3.0服務(wù)在線分析 (圖5)，此蛋白含有的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點數(shù)目分別是19、8、0。利用SignalP 4.1信號肽分析，第17位的賴氨酸殘基擁有最高原始剪切位點分值(C-score) 和最高綜合剪切位點分值(Y-score)，分別為0.132和0.147，且多肽鏈?zhǔn)孜坏鞍彼釟埢淖罡咝盘栯姆种?S-score) 為0.181 (圖6)。所有分值均低于平均分0.5，即該蛋白是無信號肽結(jié)構(gòu)的非分泌蛋白。

圖2 木薯HSP21基因的cDNA及預(yù)測蛋白序列分析

表1 表達(dá)蛋白理化性質(zhì)預(yù)測

圖3 木薯HSP21蛋白疏水性/親水性預(yù)測

圖4 木薯HSP21蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測

表2 木薯HSP21蛋白亞細(xì)胞定位分析

Note: “-” represents a value of “0.00”.

圖6 木薯HSP21蛋白信號肽分析

2.6 高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

使用SOPMA分析MeHSP21蛋白的二級結(jié)構(gòu)可知，多肽鏈中含有3種氨基酸序列，分別是16.24%的α螺旋、17.52%的延伸鏈和66.24%的無規(guī)則卷曲序列 (圖7)。選取“5nms.pdb”模板，利用SWISS-MODEL預(yù)測該蛋白三級結(jié)構(gòu)，序列一致性和覆蓋度分別是77.86%、60%，空間結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成；利用VMD 1.9.3軟件繪制其三維結(jié)構(gòu)，見圖8。

2.7 氨基酸同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

利用NCBI數(shù)據(jù)庫對木薯MeHSP21的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，木薯與巴西橡膠樹(XP_021679758.1)、哥倫比亞錦葵(XP_021290181.1)、蓖麻(XP_002532054.1)、可可(EOY23687.1)、長蒴黃(OMO97779.1)、麻瘋樹(XP_012071995.1)、圓果黃麻(OMO95089.1) 等植物的HSP21同源蛋白序列一致性分別為83%、74%、73%、74%、73%、74%、72%。利用DNAMAN對HSP21的氨基酸序列多重比對 (圖9)，以上8種植物的HSP21蛋白具有一定的相似性，觀察發(fā)現(xiàn)，HSP21的72–234氨基酸序列具有很高的相似性，其中 136–234氨基酸序列(ACD結(jié)構(gòu)域，α-crystallin domain)高度相似。

圖7 木薯HSP21蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析

圖8 木薯HSP21蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析

利用ClustalX 2.0和MEGA X對HSP21蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析 (圖10)[1-3]，木薯與巴西橡膠樹、蓖麻、麻瘋樹處于同一分支，這4種植物同屬于大戟科，具有很高的同源性；而櫻桃李、草莓等薔薇科植物的HSP21同源蛋白亦聚在另一分支，這與它們在植物進(jìn)化系統(tǒng)所在位置完全吻 合[25-27]。

3 討論

木薯是我國南方地區(qū)廣泛種植的薯類作物，以其地下塊莖含有豐富的淀粉而成為一種世界性的糧食作物[28]，并且，它又是重要的工業(yè)原料和動物飼料[29]，因此具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[30]。利用基因克隆技術(shù)改良木薯品種是開發(fā)其種質(zhì)資源的基礎(chǔ)，隨著萬種植物基因組計劃的開展和深度測序水平的不斷提高，越來越多的植物基因組被測序。電子克隆技術(shù)因具有快速、準(zhǔn)確和成本低的優(yōu)點在基因功能研究中發(fā)揮重要的作用。

圖9 木薯與其他植物的HSP21氨基酸序列多重比對

圖10 不同植物中HSP21同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

科學(xué)家現(xiàn)已完成了木薯野生祖先種和栽培種的全基因組測序，并克隆出K+通道蛋白AKT1、鈣調(diào)蛋白轉(zhuǎn)錄因子CAMTA、金屬硫蛋白MT和乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白EIL等蛋白質(zhì)的相關(guān)基因，闡釋了木薯離子吸收、生長發(fā)育調(diào)控、活性氧耐受及免疫應(yīng)答等機(jī)理，但對熱脅迫抵抗的分子機(jī)制知之甚少[31-32]。在30 ℃的高溫下，植物葉綠體結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重、類囊體膜功能異常、光系統(tǒng)Ⅰ和Ⅱ活力大幅降低，光合作用遭受嚴(yán)重抑制[33-34]，HSP21蛋白是定位于木薯葉綠體內(nèi)的功能蛋白，在熱脅迫中起到防止蛋白變性、穩(wěn)定葉綠體結(jié)構(gòu)和維持細(xì)胞光合作用正常進(jìn)行的作用[7,12]。因此，克隆該基因?qū)沂緹崦{迫下光合功能保護(hù)的分子機(jī)制具有十分積極的意義。

研究表明，HSP21親水蛋白存在于葉綠體內(nèi)，是葉綠體發(fā)育必需的功能蛋白[12]，本研究結(jié)果與之吻合(圖3、4、6)。在不同植物中，HSP21氨基酸序列雖有一定的變異性，但有些結(jié)構(gòu)特征是保守的[35-36]。對擬南芥、水稻和煙草等研究發(fā)現(xiàn)，HSP21蛋白的N端是由長度可變的氨基酸序列組成(平均長度55個氨基酸)，C端的ACD結(jié)構(gòu)域由 6–8個反向平行的β折疊構(gòu)成(約90個氨基酸)[37-39]。本研究發(fā)現(xiàn)，木薯C端ACD結(jié)構(gòu)域含有98個氨基酸，由6個β折疊構(gòu)成(圖8–9)，這和以往報道吻合[37-39]。和其他植物相比，木薯HSP21蛋白N端的序列一致性較小 (含有50個氨基酸)，N端區(qū)域能夠調(diào)節(jié)HSP21與變性蛋白的結(jié)合[39]，可能在木薯抵抗高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。

本文利用擬南芥基因序列，得到木薯的相應(yīng)EST序列，利用軟件進(jìn)行拼結(jié)、衍生，得到木薯基因的cDNA序列，并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測表達(dá)蛋白的性質(zhì)。該蛋白是含有234個氨基酸、具有堿性和親水性的非跨膜蛋白，主要在葉綠體內(nèi)發(fā)揮作用。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，木薯MeHSP21蛋白與巴西橡膠樹、蓖麻和麻瘋樹等植物的HSP21蛋白同源性較高。本研究為該基因的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。

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cloning and bioinformatics analysis ofin

Shangguang Du, and Bo Yu

,,330000,,

gene is a key gene to respond high temperature stress in plant and plays an important role in preventing protein denaturation, protecting cell structure and maintaining normal growth and development. Therefore, cloninggene is the basis for revealing the molecular mechanism of resistance to high temperature stress in cassava. To obtain cassavahomologous gene and analyze the properties of predicted protein, electronic cloning technology was used to assemble and derivate new gene in this study, and bioinformatics analysis method was used to analyze the primary to highest structure, hydrophilicity/hydrophobicity, signal peptide, protein homology and phylogenetic evolution of expressed protein.gene was 969 bp, its open reading frame was 705 bp, and the predicted protein contains 234 amino acids. The predicted protein is a non-transmembrane protein that is alkaline and hydrophilic, and is mainly localized in the chloroplast. Through multiple sequence alignment and phylogenetic analysis, it was found that the cassava HSP21 protein has high homology with other plants such as,, and. The results could provide reference for the study of cloning and transformation of this gene.

Cassava,,cloning, bioinformatics

10.13345/j.cjb.190505

November 12, 2019;

January 9, 2020

Supported by:Key Project of Science and Technology Research of Jiangxi Provincial Department of Education (No. GJJ181070), Key Research and Development Program of Science and Technology Plan of Jiangxi Province (No. 20192BBFL60008), Science and Technology Innovation Team Project of Nanchang Normal University(No. NSTD20143005).

Bo Yu. Tel: +86-791-83817248; E-mail: yubojxie@163.com

Shangguang Du. Tel: +86-791-83817248; E-mail: duguangss@foxmail.com

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目 (No. GJJ181070)，江西省科技計劃項目重點研發(fā)計劃 (No. 20192BBFL60008)，南昌師范學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目 (No. NSTD20143005) 資助。

杜尚廣, 余波. 木薯基因的電子克隆與生物信息學(xué)分析. 生物工程學(xué)報, 2020, 36(7): 1422–1430.

Du SG, Yu B.cloning and bioinformatics analysis ofin. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1422–1430.

(本文責(zé)編 陳宏宇)