武桂萍，曹文利，鄔俊峰，徐偉

(北京老年醫(yī)院感染疾病科,北京 100095)

相關(guān)研究顯示，2012年全世界范圍內(nèi)新發(fā)結(jié)核病患者860萬例，依據(jù)全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示，我國15歲以上人群活動性結(jié)核病患者達499萬例[1-2]?？刂平Y(jié)核病的主要環(huán)節(jié)是控制傳染源，治愈現(xiàn)癥肺結(jié)核患者，而控制結(jié)核的關(guān)鍵為快速診斷。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)涂片的抗酸染色鏡檢是臨床診斷結(jié)核病最常用的方法，但其檢測的靈敏度較低；液體培養(yǎng)可提高靈敏度，但結(jié)果的回報時間較長，無法滿足對結(jié)核病流行病學(xué)的控制[3]。

近年來，免疫學(xué)技術(shù)與分子生物學(xué)的發(fā)展，為MTB耐藥性檢測與結(jié)核病快速診斷提供了新方法。控制結(jié)核傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為結(jié)核病的早診斷與早治療，因此尋求一種合理有效的診斷方法以提高結(jié)核病確診率十分重要。Xpret MTB/利福平耐藥基因檢測(rifampin resistance gene detection，RIF)為新型利福平耐藥性分析與MTB感染分子診斷平臺，由美國Cepheid公司研發(fā)，當(dāng)前臨床對于該分子診斷技術(shù)關(guān)注度較高[4-5]。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗(tuberculosis infection T cell spot test，T-SPOT.TB)主要依據(jù)MTB的抗原特性，對單個核細(xì)胞分解γ干擾素后所產(chǎn)生的刺激量來判別其是否有MTB感染。本研究主要分析痰Xpret MTB/RIF和血T-SPOT.TB對老年肺結(jié)核患者的臨床診斷價值，為患者診療提供借鑒。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年2月至2019年2月北京老年醫(yī)院感染疾病科收治的162例疑似老年肺結(jié)核患者為研究對象，患者均經(jīng)臨床最終確診。診斷標(biāo)準(zhǔn)：①典型肺結(jié)核臨床癥狀和胸部X線及CT表現(xiàn)；②抗結(jié)核治療有效；③臨床可排除其他非結(jié)核性肺部疾患；④結(jié)核菌素試驗強陽性，血清抗結(jié)核抗體陽性；⑤痰結(jié)核菌聚合酶鏈反應(yīng)和探針檢測呈陽性；⑥肺外組織病理證實結(jié)核病變；⑦支氣管肺泡灌洗液中檢出抗酸分枝桿菌；⑧支氣管或肺部組織病理證實結(jié)核病變。具備①～⑥中3項或⑦～⑧中任何1項可確診。

1.2方法 取患者2份下呼吸道的合格痰樣本，一份進行MTB快速培養(yǎng)和金胺法抗酸染色，另一份進行Xpret MTB/RIF試驗；取肘靜脈血5 mL，應(yīng)用肝素鋰進行抗凝，進行T-SPOT.TB檢測。

1.2.1Xpret MTB/RIF試驗 試劑盒購自美國Cepheid公司(批號：1404C186)，將所采集患者下呼吸道痰樣本置入樣本處理液(痰液2倍體積)，混勻后在室溫下靜置10 min，選取2 mL置入試劑盒內(nèi)，放置于4通道的Gene Xpert平臺內(nèi)自動運行。2 h 后自動讀取利福平的耐藥結(jié)果與MTB檢測結(jié)果。讀取結(jié)果是“no result”“error”或“invalid”時重復(fù)檢測一次，根據(jù)MTB檢測結(jié)果即探針循環(huán)閾值判斷：當(dāng)內(nèi)對照探針Ct值≤38為陽性，對照探針Ct值>38為陰性。

1.2.2SPOT.TB檢測 試劑盒購自英國Oxford公司(批號：TEC260478)，取患者肘靜脈血5 mL，應(yīng)用肝素鋰進行抗凝，隨后分離單個核細(xì)胞，洗滌后對細(xì)胞計數(shù)；培養(yǎng)濾液蛋白10、結(jié)核特異抗原前期所分泌抗原靶蛋白6及單個核細(xì)胞，同時置入預(yù)包被的有γ干擾素抗體反應(yīng)孔內(nèi)，在含5% CO2、37 ℃下孵育過夜，次日置入二抗，孵育1 h洗板，底物置入后采用顯色液孵育5 min，蒸餾水終止反應(yīng)，記錄斑點形成細(xì)胞數(shù)，每個斑點表示1個效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。判讀結(jié)果：陰性對照孔的斑點數(shù)≥6，孔斑點數(shù)檢測≥2倍陰性對照孔斑點數(shù)則判定為陽性；陰性對照孔斑點數(shù)<6。

1.3MTB快速培養(yǎng)及抗酸染色 依據(jù)BACTEC MGIT 960分歧桿菌分析系統(tǒng)手冊[6]及《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[7]行相關(guān)操作。痰涂片行金胺法抗酸染色，結(jié)果依據(jù)《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[8]進行判斷。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)，特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)，準(zhǔn)確度= (真陽性+真陰性)/總例數(shù)，陽性預(yù)測值=真陽性/(真陽性+假陽性)，陰性預(yù)測值=真陰性/(真陰性+假陰性)，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1金標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果 162例疑似老年肺結(jié)核患者中，根據(jù)胸部CT、手術(shù)活組織檢查、痰培養(yǎng)及臨床癥狀等指標(biāo)最終確診肺結(jié)核患者88例，陽性率為54.32%；非肺結(jié)核患者74例，包括細(xì)菌性肺炎34例，慢性支氣管炎21例，慢性阻塞性肺炎11例，其他8例。

2.2痰Xpret MTB/RIF和T-SPOT.TB診斷效能比較 痰Xpret MTB/RIF共檢出陽性40例，陰性122例，T-SPOT.TB共檢出陽性110例，陰性52例，見表1。痰Xpret MTB/RIF和T-SPOT.TB診斷老年肺結(jié)核的靈敏度分別為45.45%、93.18%，特異度分別為100.00%、62.16%，Xpret MTB/RIF診斷肺結(jié)核靈敏度低于T-SPOT.TB，特異度高于T-SPOT.TB(χ2=4.506，P=0.038；χ2=5.690，P=0.014)，見表2。

表1 痰Xpret MTB/RIF和T-SPOT.TB的檢查結(jié)果 (例)

3 討 論

我國為全世界主要的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，流行病學(xué)研究顯示，我國新發(fā)病患者數(shù)為130萬例，僅次于印度[9]。我國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示，菌陽肺結(jié)核、涂陽肺結(jié)核與活動性肺結(jié)核的患病率分別為119/10萬、66/10萬及459/10萬，其中男性菌陽肺結(jié)核、涂陽肺結(jié)核及活動性肺結(jié)核的患病率均高于女性，且結(jié)核病發(fā)病率隨著年齡的增長而升高[10]。當(dāng)前，臨床對于診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)為結(jié)核菌培養(yǎng)，但周期過長，假陽性與假陰性的比例較高，而且對于肺外結(jié)核患者與菌陰患者診斷困難。

結(jié)核菌素試驗的操作簡便且價格低廉，臨床應(yīng)用廣泛，但由于受交叉反應(yīng)和免疫力情況影響，其特異性與敏感性較低。常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)對結(jié)核感染進行檢測，需要擴張后行電泳，速度快，但無法定量且容易發(fā)生交叉感染，特異性較低。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法為近年興起的結(jié)核確診方法，可定量檢測DNA，其因具有準(zhǔn)確率高及速度快等優(yōu)勢而在臨床廣泛應(yīng)用，但其標(biāo)本來源不易獲得，所以此方法受到了一定制約。痰涂片為一種操作簡便、費用低、診斷快速、在臨床廣泛應(yīng)用的肺結(jié)核診斷方法，但該方法對死活菌和非MTB取法的區(qū)分受制于痰液內(nèi)分枝桿菌的數(shù)量，所以診斷敏感性低，漏檢人數(shù)增加，且無法診斷肺外結(jié)核患者，臨床應(yīng)用也受到一定的制約。既往臨床對結(jié)核病的診斷多依據(jù)患者痰涂片的抗酸染色，但痰涂片對于標(biāo)本含菌量的要求較高，造成對結(jié)核病患者診斷敏感性較低的因素主要為肺結(jié)核患者中多數(shù)為涂陰肺結(jié)核。臨床缺少細(xì)菌學(xué)的診斷，對于菌陰肺結(jié)核診斷比菌陽肺結(jié)核困難，所以臨床對肺結(jié)核有誤診現(xiàn)象[11]。

MTB感染者外周血單核細(xì)胞內(nèi)存在MTB特異性活化T淋巴細(xì)胞，上述淋巴細(xì)胞在受到MTB特異性抗原刺激后分泌γ干擾素，培養(yǎng)濾液蛋白10及6 kDa 早期分泌性抗原性靶為MTB復(fù)合群基因內(nèi)RD1區(qū)域rv3874及rv3875編碼結(jié)核特異性蛋白抗原，能夠從結(jié)核感染者T細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)出較強的γ干擾素釋放反應(yīng)，并以此設(shè)計了T-SPOT.TB，能夠推測體內(nèi)是否有對MTB反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞，進而進行診斷。同時無論患者是否有臨床癥狀，檢測效應(yīng)T淋巴細(xì)胞在血清內(nèi)含量均可以作為機體是否被感染的指標(biāo)，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的存活期較短，多在病原體被消滅后消失。T-SPOT.TB檢測血清抗原特異T淋巴細(xì)胞及γ干擾素最敏感，基本不受CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量少的影響，此方法對于臨床結(jié)核病合并免疫缺陷患者比較適宜[12-13]。T-SPOT.TB主要檢測培養(yǎng)濾液蛋白10所導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)γ干擾素反應(yīng)及MTB所分解的6 kDa早期分泌性抗原性靶劑量，其對菌陰結(jié)核病和前期結(jié)核病患者診斷價值較高[14-15]。本研究結(jié)果顯示，T-SPOT.TB診斷老年肺結(jié)核的靈敏度為93.18%，特異度為62.16%，且靈敏度遠高于痰Xpret MTB/RIF，故認(rèn)為此方法對肺結(jié)核的輔助診斷價值較高，具有一定的臨床應(yīng)用價值；其靈敏度高，特異度相對較低，提醒廣大臨床醫(yī)師在診斷活動性肺結(jié)核時，不能僅憑T-SPOT.TB陽性做出診斷，還應(yīng)結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及痰檢結(jié)果等進行綜合判斷。

Xpret MTB/RIF試驗為世界衛(wèi)生組織所推薦的結(jié)核病檢測分子診斷平臺，其技術(shù)基礎(chǔ)為半巢式實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)，靶序列為rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)內(nèi)81 bp核心區(qū)，2 h內(nèi)能夠檢測出利福平與MTB耐藥性，利福平的單藥耐藥較少，臨床一般將利福平耐藥作為耐多藥結(jié)核病的標(biāo)志物。有研究顯示，Xpret MTB/RIF對于肺外結(jié)核病診斷價值較高，其特異度為0.99，靈敏度為0.78[16]。Xpret MTB/RIF在2 h內(nèi)即可檢測出是否存在陽性現(xiàn)象，所以相對于痰液培養(yǎng)優(yōu)勢顯著。另外，夏輝和趙雁林[17]對我國應(yīng)用Xpret技術(shù)前景分析建議將Xpret技術(shù)整合至我國的結(jié)核病防治規(guī)劃中。Xpret MTB/RIF能夠?qū)TB核酸直接檢測，還可檢測出利福平耐藥性，這對于快速診斷耐藥結(jié)核病價值較高，同時操作簡便，可避免基因檢測所出現(xiàn)的污染等問題[18]。本研究結(jié)果顯示，痰Xpret MTB/RIF診斷老年肺結(jié)核的靈敏度為45.45%，特異度為100%。故能從病原學(xué)證據(jù)上快速診斷肺結(jié)核，而且還能檢測出是否對利福平耐藥，對臨床有重要的指導(dǎo)意義。但痰Xpret MTB/RIF技術(shù)與痰涂片一樣無法區(qū)分結(jié)核桿菌是否存活，故存在一定的假陽性[19-20]。

表2 痰Xpret MTB/RIF和T-SPOT.TB對老年肺結(jié)核的診斷效能比較

綜上所述，Xpret MTB/RIF診斷肺結(jié)核靈敏度低于T-SPOT.TB，特異度高于T-SPOT.TB,痰Xpret MTB/RIF可對肺結(jié)核患者進行輔助診斷，T-SPOT.TB檢測可作為后續(xù)診斷試驗提高臨床診斷準(zhǔn)確性。在臨床上對疑似肺結(jié)核的患者進行這兩項檢測對診斷具有重要意義。