卞論, 林冠峰, 吳英松

南方醫(yī)科大學檢驗與生物技術(shù)學院, 廣州 510515

狂犬病是由狂犬病毒屬(Lyssavirus)的嗜神經(jīng)病毒引起的能感染人類和其他哺乳類動物的傳染性疾病，發(fā)病后死亡率幾乎百分之百。每年均有60 000人死于狂犬病，而且這個數(shù)字還在持續(xù)增長[1-2]，但是在感染病毒與發(fā)病之間進行有效的暴露后預防可以將死亡率降低至幾乎零。因此有效的狂犬病暴露后預防方法在提高狂犬病患者生存幾率方面極為重要?？袢”┞逗箢A防方式與暴露程度有關(guān)，狂犬病的暴露程度可分為三種：Ⅰ類暴露為接觸貓狗等動物時皮膚被舔，但依然保持完整，如能確認接觸的動物并未感染狂犬病毒，則不需要進行處理；Ⅱ類暴露為皮膚被咬傷或輕微抓傷，但是并未出血，這種情況只需要主動免疫，即進行狂犬病疫苗注射；Ⅲ類暴露為皮膚被咬傷或抓傷或者粘膜與已破損的皮膚被動物體液污染，這種情況則需要以暴露后預防(post-exposure prophylaxis，PEP)方式進行處理[3]，主要有三個步驟：①使用清水沖洗傷口，盡量避免傷口殘留狂犬病毒；②采取主動免疫措施，即注射狂犬病毒滅活疫苗；③使用抗狂犬病毒中和抗體浸潤注射，以達到在主動免疫產(chǎn)生足量抗體之前，快速及時地中和患處及體內(nèi)狂犬病毒的目的，避免狂犬病毒入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在國內(nèi)就曾發(fā)生過Ⅲ類暴露后僅接種狂犬病疫苗并未注射抗狂犬病毒中和抗體而死亡的案例[4-5]，這也證明了及時注射中和抗體在狂犬病防治中的重要性。中和抗體是B淋巴細胞產(chǎn)生的抗體，能夠與病原微生物表面的抗原結(jié)合，從而阻止該病原微生物黏附靶細胞受體，防止其侵入細胞。由于中和抗體有著成本高、產(chǎn)量小等局限，難以在基層地區(qū)生產(chǎn)和普及。歷代科學家致力于改進抗體技術(shù)并應(yīng)用于中和抗體研制，提高中和抗體生產(chǎn)效率。中和抗體經(jīng)由多抗血清、單克隆抗體及基因工程抗體等技術(shù)的發(fā)展歷程，其研制趨于成熟，本文就抗狂犬病毒中和抗體的發(fā)展歷程、不同類型中和抗體的優(yōu)缺點以及中和抗體的未來研究期望作了綜述，以期為新一代狂犬疫苗的研發(fā)提供參考。

1 狂犬病疫苗簡史

作為人類歷史中出現(xiàn)的最早的疾病之一，對于狂犬病的相關(guān)記載可以追朔至古埃及[6]。17世紀的英文文獻中以這種傳染病的癥狀(該病的患者會過度口渴和害怕水)為其命名恐水癥(hydrophobia)[7-10]。

1885年路易斯·巴斯德通過將狂犬病動物的脊髓進行干燥處理制備出世界上第一支用于預防狂犬病的疫苗[11]，開啟了暴露后狂犬病預防的新時代。在之后的五十年里，研究者們采用了不同的措施對巴斯德最初通過簡單而粗糙的干燥方式制備出的狂犬病疫苗進行了改進，以提高安全性和治療效果。

疫苗的制造工藝發(fā)展至今，目前已處于細胞培養(yǎng)疫苗的時代。其中以人二倍體細胞培養(yǎng)狂犬病疫苗作為基準，這是一種使用人類二倍體細胞接種固定病毒后進行培養(yǎng)繁殖，再經(jīng)過濃縮、滅活等步驟制成的疫苗[7]。這類疫苗治療效果好，注射后較少產(chǎn)生副反應(yīng)，是理想的疫苗[8]。

作為第一種純化濃縮無佐劑的凍干狂犬病疫苗，人二倍體細胞狂犬疫苗(human diploid cell rabies vaccine，HDCV)從1974年上市以來，因其較高的安全性、較好的免疫原性、極少產(chǎn)生副作用等優(yōu)點，被評價為最理想的狂犬病疫苗。但由于HDCV細胞培養(yǎng)技術(shù)難度大、成本高，主要應(yīng)用在發(fā)達國家。目前國內(nèi)狂犬病疫苗市場占比前三的遼寧成大公司、寧波榮安公司和廣州諾誠公司的產(chǎn)品也主要是以非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)狂犬病疫苗為主。而以HDCV作為主要產(chǎn)品的成都康華公司[9]、遼寧邁豐公司[10]市場占比還不足3%，這也說明HDCV其在發(fā)展中國家普及率較低的窘境。

2 狂犬病毒中和抗體的功能

狂犬病毒中和抗體的作用方式主要分為三種：①中和抗體能夠在補體的參與作用下使病毒感染的細胞溶解破碎。當狂犬病毒在宿主體內(nèi)的細胞中進行復制增殖時，細胞膜會表達病毒蛋白抗原，而這種抗原會被中和抗體識別并產(chǎn)生相互作用，在補體的協(xié)助下發(fā)生溶解破碎；②中和抗體會結(jié)合體內(nèi)的游離病毒，這會阻斷病毒進入細胞的過程，二者組成的免疫復合物也會被吞噬細胞識別并吞噬和清除；③抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用，即表達有IgG抗體的Fc受體的NK細胞和巨噬細胞等，通過和已結(jié)合于病毒感染細胞表面的IgG抗體Fc段結(jié)合，以此來殺傷病毒感染的靶細胞[12]。

3 狂犬病毒中和抗體發(fā)展歷程

中和抗體的發(fā)展歷程大概分為三個階段：第一代抗體的發(fā)展始于20世紀初期，早在1895年，Hericourt和Richet[13]就通過將癌細胞注入動物體內(nèi)，取其產(chǎn)生的抗血清，用于治療癌癥病人，即使用抗原免疫動物獲取的能中和對應(yīng)抗原的多抗血清；第二代抗體，即單克隆抗體，是1975年由K?hler與Milstein利用雜交瘤技術(shù)制備[14]，與第一代抗體相比，單克隆抗體由于均由同一B細胞分裂得到的子細胞產(chǎn)生而擁有高純度、僅針對抗原單一表位、生產(chǎn)量較大等優(yōu)點。但是由于單抗大部分來自于鼠的雜交瘤細胞，注射后會被免疫系統(tǒng)識別產(chǎn)生人抗鼠抗體從而被中和掉，導致效果銳減[15]，同時還會引起人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)；第三代抗體，也就是基因工程抗體，其發(fā)展始于20世紀80年代中期?；蚬こ炭贵w是使用分子生物學技術(shù)對鼠源抗體進行改造，從而降低人體對其產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，例如使用DNA重組技術(shù)對單克隆抗體的鼠源部分進行替換從而構(gòu)建人鼠嵌合抗體，以實現(xiàn)鼠源單抗的人源化[16]，甚至通過噬菌體展示技術(shù)[17]與轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)[18]對抗體進行了徹底人源化處理。

3.1 抗狂犬病毒多克隆抗體(抗血清)

抗狂犬病毒多克隆抗體為第一代抗體，即通過使用抗原免疫動物獲取的能中和對應(yīng)抗原的多抗血清。目前常用于PEP的抗狂犬免疫球蛋白主要為抗狂犬病馬血清(equine anti-rabies immunoglobulin，ERIG)和抗狂犬病人血清(human anti-rabies immunoglobulin，HRIG)[19]。雖然這兩種免疫球蛋白都很有效，但是各自都有缺點。首先ERIG有著非常嚴重的副反應(yīng)，譬如嚴重的過敏反應(yīng)等[20]，而且還會抑制某些疫苗誘導產(chǎn)生的抗體。盡管有著很多缺點，ERIG在很多發(fā)展中國家仍是供不應(yīng)求[21]。相比之下，HRIG則無副反應(yīng)，但是由于HRIG需從免疫過的人血清中提取，而且需要供體的抗體滴度達到一定水平，因此產(chǎn)量有限且價格昂貴。同時由于其供體不穩(wěn)定，導致其存在著血液制品有潛在致病性、批次間有質(zhì)量差異等問題。

3.2 鼠源抗狂犬病毒單克隆抗體

為了尋找一種可以克服ERIG和HRIG缺陷的新產(chǎn)品，科學家們開始著眼于研制抗狂犬病毒單克隆抗體。從雜交瘤單克隆抗體技術(shù)[13]出現(xiàn)以來，單克隆抗體技術(shù)發(fā)展迅猛，利用單克隆抗體技術(shù)生產(chǎn)的抗體擁有高特異性，能夠解決多抗血清的部分缺陷，此外還擁有著高安全性、低成本、可量產(chǎn)等優(yōu)點[22]。在臨床診斷、預防以及治療等方面的應(yīng)用也日益廣泛，其中對治療性單克隆抗體的研究尤為深入。但由于傳統(tǒng)的單克隆抗體為鼠源性，易引發(fā)人體抗鼠抗體產(chǎn)生，甚至引發(fā)超敏反應(yīng)。因此直到基因工程抗體出現(xiàn)后，單克隆抗體作為藥物才顯示出了巨大的應(yīng)用前景。

1989年Schumacher等[14]利用雜交瘤單克隆抗體技術(shù)制備了多株針對狂犬病毒糖蛋白(glycoprotein，G蛋白)與核蛋白(nuclear protein，N蛋白)的鼠源單克隆抗體，將這些抗體混合使用即為單克隆抗體雞尾酒療法(cocktail of anti-rabies monoclonal antibodies，McAb-C)，對小鼠和地鼠進行的保護性試驗證明這種方法不僅能夠在被動免疫之后抵抗致死量狂犬病毒的攻擊，還擁有暴露后保護作用。1990年Dietzschold等[23]研究證明糖蛋白是抗狂犬病毒主要的中和抗原蛋白，為之后以糖蛋白為目的蛋白制備新疫苗及抗體的研究提供了指導方向，也為現(xiàn)代的狂犬病預防奠定了基礎(chǔ)。1991年Fu等[24]將狂犬病毒ERA毒株編碼N蛋白基因克隆至桿狀病毒中，隨后在昆蟲細胞中大量表達，經(jīng)過親和色譜法純化之后制備出了32株單克隆抗體，其中31株能夠正確識別狂犬病毒株。直到2007年，Muhamuda等[25]制備了數(shù)株針對狂犬病毒G蛋白的鼠源單克隆抗體，并使用動物模型驗證了其對于狂犬病暴露后預防的效果?？焖贌晒庠钜种圃囼灥慕Y(jié)果顯示抗體的中和效價達到1 650～75 000 IU·mL-1，能夠保護70%～100%接種了狂犬病毒的小鼠或豚鼠。這些單克隆抗體在有效蛋白濃度及中和效價方面高于商業(yè)ERIG約2 000倍。

3.3 人-鼠異源骨髓瘤雜交技術(shù)

1991年Enssle等[26]通過EB病毒使人源B淋巴細胞實現(xiàn)永生化，再與小鼠骨髓瘤雜交細胞融合制備出人源化抗狂犬病毒特異性單克隆抗體TW-1，并在之后的快速熒光灶免疫試驗和體內(nèi)實驗中均能中和病毒及保護小鼠免受感染。2000年Champion等[27]將接受過商品化疫苗接種的人B淋巴細胞通過人-鼠異源骨髓瘤雜交技術(shù)進行細胞融合并制備了數(shù)株人源化抗狂犬病毒單克隆抗體。雖然這種異源雜交瘤細胞能獲得比較穩(wěn)定的細胞克隆，但是會產(chǎn)生丟失抗體的情況，這個現(xiàn)象可能與染色體丟失有關(guān)[28]。

3.4 抗狂犬病毒基因工程抗體

由于鼠源性的單克隆抗體對于人體來說屬于異源蛋白，容易刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗鼠抗體并對其進行清除，還極易產(chǎn)生超敏反應(yīng)[29]，因此很難在臨床上進行應(yīng)用。而人源化單克隆抗體則擁有著副反應(yīng)小、不易產(chǎn)生超敏反應(yīng)等優(yōu)點，更有機會應(yīng)用于臨床治療?；蚬こ炭贵w分為如下幾種：人鼠嵌合抗體、互補決定區(qū)(complementarity determining region，CDR)移植抗體、完全人源性抗體、單鏈抗體、噬菌體抗體(表1)。

表1 幾種基因工程抗體的優(yōu)缺點Table1 Advantage and disadvantage of genetically engineered antibody

3.4.1人鼠嵌合抗體 1984年Morrison等[30]通過獲取能夠分泌與已知抗原結(jié)合的特異性抗體的骨髓瘤雜交細胞系，提取其編碼抗體可變區(qū)域的基因，并使用重組DNA技術(shù)將其連接至人類免疫球蛋白恒定區(qū)域基因，創(chuàng)造出了有抗原結(jié)合特異性的人鼠嵌合抗體分子，這也是人類歷史上第一次研究出人源化的單克隆抗體。人鼠嵌合抗體有著很多優(yōu)點：①能夠自由地選擇抗體的亞型、大小、結(jié)構(gòu)域等；②其不但保留了親本鼠源單克隆抗體的高特異性及親和力，而且減少了其中70%的鼠源成分；③其中的人源Fc段能夠有效地介導各種生物學效應(yīng)，例如抗體依賴細胞介導的細胞毒作用等。

3.4.2CDR移植抗體 雖然嵌合抗體的恒定區(qū)已經(jīng)改造為人源化，但是由于其可變區(qū)仍是鼠源的，因此仍會引起機體不同程度地產(chǎn)生人抗鼠抗體[31]。而CDR移植抗體則是將人抗體的互補決定區(qū)置換為鼠源性單克隆抗體的互補決定區(qū)，這種方法制作的抗體僅有極少部分仍為鼠源性。但是這種抗體與抗原的親和力會下降，大概僅有原抗體的30%～50%。

3.4.3完全人源性抗體 完全人源性抗體是使用基因敲除技術(shù)敲除掉小鼠的免疫球蛋白基因，并以人免疫球蛋白基因進行取代，然后再采用抗原免疫小鼠，經(jīng)過雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)得到。2007年Sloan等[32]利用攜帶人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，得到了數(shù)株具有中和活性的人源性單克隆抗體，其中的人源性抗體17C7能夠識別狂犬病毒G蛋白的構(gòu)象表位，并通過建立暴露后預防小鼠模型證實該抗體能夠保護倉鼠免受致死量狂犬病毒的感染。

3.4.4單鏈抗體 Fv片段(variable fragment)是結(jié)合抗原的最小功能片段，是由重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)通過疏水作用結(jié)合而成，而由于其重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)是由非共價鍵連接，因此其在體內(nèi)很不穩(wěn)定。而隨著分子生物學的發(fā)展，人們利用DNA重組技術(shù)對Fv片段進行了改進，其中研究最多的就是單鏈抗體。

1988年Huston與Bird等[33-34]最早制備了單鏈抗體(scFv, single chain variable fragment antibody)，單鏈抗體是使用一條短肽將重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)連接而成，這種肽鏈結(jié)構(gòu)不但能夠在大腸桿菌表達中更有利于基因重組操作，同時也相應(yīng)地解決了Fv不夠穩(wěn)定的缺點。單鏈抗體的優(yōu)點主要在于其由重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)組成，因此保留了完整的抗原結(jié)合部位。而且由于其分子量小，僅有標準抗體的1/6左右，因此擁有較強的穿透力，能更迅速地到達靶向部位。但是相比較于天然抗體的雙價結(jié)構(gòu)，單鏈抗體是單價的，因此其親合力有所下降。

3.4.5噬菌體展示技術(shù) 噬菌體展示技術(shù)是把外源蛋白或者多肽的DNA序列插入至噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的合適位置，從而使外源基因隨著外殼蛋白一同表達，同時通過噬菌體的重新組裝而展示到其表面的技術(shù)。大量獲取的人源基因工程抗體也因為噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)成為可能[35]。1997年Muller等[36]通過噬菌體展示技術(shù)從分泌糖蛋白單克隆抗體的30AA5雜交瘤細胞中分離出了能夠中和狂犬病毒的單鏈抗體片段。2005年Kramer等[37]從接種疫苗的獻血者血液中提取抗體基因，成功構(gòu)建了人源抗狂犬病毒噬菌體抗體庫，最終得到了21株全長人免疫球蛋白。

3.5 雞尾酒單克隆抗體療法

事實上，由于狂犬病毒擁有較多基因型[38]，且G蛋白序列并不保守，因此針對單一抗原表位的中和抗體并不能達到廣譜療效。因此怎樣將針對不同抗原表位的中和抗體聯(lián)合使用也就成為了治療性抗狂犬病毒抗體研究的重心。早在1989年Schumacher等[39]就將針對N蛋白與G蛋白的單克隆抗體進行聯(lián)用并稱之為單克隆抗體雞尾酒療法。2005年Goudsmit等[40]把針對狂犬病毒糖蛋白Ⅰ號位點的CR57中和抗體和Ⅲ號位點的CR4098中和抗體混合使用，中和了26種經(jīng)典毒株，證明了雞尾酒療法的可行性。2009年Müller等[41]開發(fā)了一種由5種鼠源性單克隆抗體聯(lián)用的雞尾酒療法，有望取代HRIG在發(fā)展中國家得到廣泛使用。2018年Xi等[42]使用CR57和CR4098制備了一系列的單鏈Fv片段和亮氨酸拉鏈Fv片段，并使用小鼠和倉鼠模型證明了亮氨酸拉鏈Fv雞尾酒療法比單鏈Fv雞尾酒擁有更好的保護效果。

4 展望

雖然已經(jīng)有很多關(guān)于抗狂犬病毒治療性抗體的專利，但是至今仍沒有一種治療性抗體投放市場。目前用于暴露后預防注射的抗體仍主要為ERIG和HRIG，亟需一種能夠量產(chǎn)并且擁有較好的穩(wěn)定性、安全性和經(jīng)濟性的治療性抗體投入市場。此外，已經(jīng)有研究表明，血腦屏障在防治狂犬病毒方面發(fā)揮著重要作用[43]，而狂犬病毒則可以通過維持血腦屏障的完整性來逃逸免疫[44]。因此能否利用一些細胞因子幫助治療性抗體穿越血腦屏障或者通過改造治療性抗體本身使其能穿過血腦屏障，這些都是值得研究的，這也為科學家們對抗狂犬病毒抗體的研究提供了新的方向。

2019年Marosi等[45]使用免疫調(diào)節(jié)抑制劑和HRIG同時應(yīng)用于狂犬病小鼠模型，最后證實無論是暴露前還是暴露后處理組，免疫抑制劑與HRIG聯(lián)用處理都展現(xiàn)出了更高的保護效果。實驗還證實了促炎癥細胞因子與分子通路抑制劑可以提高小鼠模型的生存率，并且配合HRIG效果更好。這些研究結(jié)果說明抗狂犬病毒抗體在一些物質(zhì)的協(xié)同作用下可以發(fā)揮更好的預防作用，也為狂犬病抗體研究提供了新的方向。

目前已上市的抗體藥物主要為針對腫瘤或自身免疫疾病方面，用于抗病毒的抗體藥物僅有三種，其中用于狂犬病治療的單抗藥物僅有一種——Rabishield。而由于狂犬病毒G蛋白的不保守性，單獨一種抗體的使用并不能有效地進行狂犬病防治。因此，針對不同抗原表位的狂犬病抗體的研究也是未來狂犬病抗體研究的主要方向之一。

總的來說，狂犬病的防治不僅要做好暴露前預防，同時要在提高暴露后預防有效性、延長暴露后患者存活時間等方面加強研究?？茖W家們也需要在這些方面更加努力，使狂犬病的防治措施更加成熟、有效、經(jīng)濟。