駱小英，陳俊輝，魏東

華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640

近年來，利用微藻來處理富含氮磷等污染物的工農(nóng)業(yè)廢水已經(jīng)成為研究熱點。這不僅是因為微藻能夠充分利用廢水中的有機碳及無機氮磷促進(jìn)自身生長，而且還能夠?qū)⑦@些富營養(yǎng)化的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)物如高級燃料、高蛋白飼料等，有助于解決資源短缺和環(huán)境污染問題，符合當(dāng)前建設(shè)資源節(jié)約型及環(huán)境友好型社會的要求[1]。工業(yè)的快速發(fā)展帶來了經(jīng)濟(jì)上的快速增長，同時也產(chǎn)生了更多的廢氣、廢水和廢渣。特別是廢氣中的NOX以及廢水中硝酸根離子的大量排放，嚴(yán)重威脅了人類健康和生態(tài)環(huán)境。通常工業(yè)廢水中NO3–-N含量為200 mg/L，而生產(chǎn)炸藥、化肥、果膠、玻璃紙和金屬加工等行業(yè)的工業(yè)廢水含有的NO3–-N含量則超過1 000 mg/L[2]。若將這些高硝酸鹽含量的廢水直接排放到自然水體中，可能通過飲用水等途徑進(jìn)入人體，引發(fā)藍(lán)嬰綜合征、成年人胃癌、甲氧蛋白血癥等疾病[3]，同時也會進(jìn)一步加劇水體的富營養(yǎng)化，引起赤潮和水華等現(xiàn)象。目前，國內(nèi)外處理硝酸鹽廢水的方法主要分為物化處理和生化處理[4]。物化處理存在成本高并需要后期的進(jìn)一步處理等問題；生化方法往往是利用反硝化細(xì)菌進(jìn)行反硝化，但處理周期長，極易造成二次環(huán)境污染。此外，若單純地將硝酸根中的氮轉(zhuǎn)化為氮氣，則是一種資源上的巨大浪費。如何將“三廢”變“三寶”，是實現(xiàn)資源化利用的重要內(nèi)容，而采用微藻培養(yǎng)技術(shù)處理廢水可以從根本上解決上述問題，真正實現(xiàn)高氮廢水的資源化利用。目前在水質(zhì)治理方面研究比較多的微藻主要是綠藻，特別是小球藻屬的藻種[5]。蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa是最常見的小球藻藻種之一。它不僅生長速度快、營養(yǎng)方式多樣、耐受能力強[6]，而且已經(jīng)有大量的研究將蛋白核小球藻與污水處理相結(jié)合[7-8]，實現(xiàn)了廢水減排，并獲得了富含蛋白質(zhì)的生物質(zhì)資源。

本文首先在搖瓶培養(yǎng)條件下系統(tǒng)研究了不同培養(yǎng)模式和光照模式 (光強恒定及階梯變化)對蛋白核小球藻的生長、硝酸根同化速率及藻體蛋白和色素含量的影響；然后將獲得的優(yōu)化培養(yǎng)條件，在5 L光發(fā)酵罐中進(jìn)行實驗室小試培養(yǎng)，以期進(jìn)一步提高蛋白核小球藻同化硝酸根的能力，為今后利用蛋白核小球藻處理工業(yè)廢硝酸或硝酸鹽廢水并聯(lián)產(chǎn)高蛋白微藻生物質(zhì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，提供廢水資源化利用、變廢為寶的創(chuàng)新技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 藻種及保種培養(yǎng)

蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa系北京大學(xué)陳峰教授惠贈，采用 Basal培養(yǎng)基進(jìn)行斜面轉(zhuǎn)接保藏，保藏溫度為4 ℃[9]。

1.2 實驗試劑及儀器

葡萄糖、硝酸鈉和硝酸等實驗所用試劑均為分析純；AL104型電子天平和Seven Easy型pH計均購自瑞士 Mettler Toledo公司；Allegra 25R型高速冷凍離心機購自美國 Beckman Coulter公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHZ-DA型恒溫?fù)u床購自太倉實驗設(shè)備廠；AMA240型高壓滅菌鍋購自英國 ASTELL公司；AW442P4 流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司；HI83200多參數(shù)水質(zhì)分析儀購自意大利 HANNA公司；K9840半自動凱氏定氮儀購自中國 Hanon公司；SBA-40D生物傳感器購自山東省科學(xué)院；UV2300紫外-可見分光光度計購自天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)實驗

本研究采用改良的 Basal培養(yǎng)基作為模擬廢水。其中，葡萄糖和硝酸鈉作為實驗初始的碳氮源，初始葡萄糖濃度依據(jù)實驗設(shè)計而變，硝酸鈉濃度為15 g/L，鹽度為15‰[10]。

研究中主要選用不同培養(yǎng)模式和光照模式為主要考察對象。首先在搖瓶培養(yǎng)體系中，全面評價這些條件對蛋白核小球藻的生長、硝酸根同化速率及胞內(nèi)積累含氮化合物含量的影響；然后在5 L的光發(fā)酵罐中對最優(yōu)條件進(jìn)行小試培養(yǎng)驗證，從而獲得最大硝態(tài)氮同化速率和最大小球藻生物量產(chǎn)率。

1.3.2 不同培養(yǎng)模式的搖瓶培養(yǎng)實驗

在搖瓶中進(jìn)行4種培養(yǎng)模式的比較，分別為分批培養(yǎng)、25%培養(yǎng)基回流的補料分批培養(yǎng) (下文統(tǒng)稱25%回流補料分批)、50%培養(yǎng)基回流的補料分批培養(yǎng) (下文統(tǒng)稱50%回流補料分批) 和培養(yǎng)基不回流的補料分批培養(yǎng) (下文統(tǒng)稱補料分批培養(yǎng))。簡述如下：將混養(yǎng)培養(yǎng)的種子液按約1×108CFU/mL接入到搖瓶中，連續(xù)培養(yǎng)的初始葡萄糖濃度為50 g/L，而25%回流補料分批、50%回流補料分批和補料分批培養(yǎng)條件下的初始葡萄糖濃度均為20 g/L。培養(yǎng)過程中以500 g/L葡萄糖母液作為碳源補充。當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度低于 10 g/L，補加葡萄糖至20–25 g/L。培養(yǎng)至第4天，分別取25%回流補料分批和 50%回流補料分批中培養(yǎng)液總體積的 25%和 50%，離心后回流上清液到搖瓶中。培養(yǎng)時間為6 d，培養(yǎng)溫度為 (30±1) ℃，搖床轉(zhuǎn)速為 150 r/min，連續(xù)光照，光照強度為210 μmol/(m2·s)。

1.3.3 不同光照模式的搖瓶培養(yǎng)實驗

兩種光照模式為階梯式光強和恒定光強，具體培養(yǎng)條件為：恒定光強培養(yǎng)時光照強度為210 μmol/(m2·s)，階梯式光強初始值為120 μmol/(m2·s)。初始葡萄糖濃度均為20 g/L。階梯式光強模式培養(yǎng)的小球藻從第2天開始，每天增加30 μmol/(m2·s)，第4天增加到 210 μmol/(m2·s)后即保持不變。同時，在第2、3天分別向兩種光照模式培養(yǎng)液中補加葡萄糖至20 g/L。保持初始接種密度、補糖水平及培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速與兩種培養(yǎng)模式下相同。連續(xù)光照，培養(yǎng)5 d。

1.3.4 發(fā)酵罐補料分批培養(yǎng)

小球藻的補料分批培養(yǎng)在5 L光發(fā)酵罐中進(jìn)行。光發(fā)酵罐由5 L玻璃發(fā)酵罐配置環(huán)繞LED光照系統(tǒng)組成，工作體積為3.5 L，具體方法如下：將培養(yǎng)6 d的種子液接種到裝有已滅菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為發(fā)酵罐工作體積的7%，并保證接種密度與搖瓶實驗保持一致。培養(yǎng)過程中采用連續(xù)光照的混養(yǎng)補料分批培養(yǎng)，光照強度根據(jù)細(xì)胞密度的變化從 120 μmol/(m2·s) 不斷增加到560 μmol/(m2·s)，培養(yǎng)基的 pH 和溫度分別為(6.5±0.05) ℃和(30±2) ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為 150–200 r/min，通氣量為 2.5–10 L/min，消泡劑濃度為 0.3%(W/V)，培養(yǎng)到128 h后結(jié)束培養(yǎng)。

培養(yǎng)過程中的補料流加方法為：根據(jù)蛋白核小球藻的生長情況，每12 h一次性添加500 g/L葡萄糖母液若干毫升，以保證培養(yǎng)基中還原糖濃度在20–35 g/L；同時，通過在線自動流加1 mol/L濃硝酸母液作為流加氮源同時，維持培養(yǎng)基 pH值穩(wěn)定在6.5–7.0之間；培養(yǎng)期間滴加適量消泡劑控制培養(yǎng)基中泡沫的生成，避免產(chǎn)生過多泡沫而抑制小球藻的正常生長。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量測定

蛋白核小球藻的生物量采用干重法和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測定。干重法：吸取 2 mL藻液置于已準(zhǔn)確稱重的 2 mL離心管中，離心后將所得藻泥用超純水反復(fù)清洗離心2次，將最終得到的藻泥放入60 ℃恒溫烘箱中烘干至恒重。用分析天平稱量并計算得到烘干藻粉的重量。生物量產(chǎn)率 (單位：g/(L·d)) 的計算根據(jù)公式：

其中DW1、DW2分別代表t1和t2時間點的干重濃度。

流式細(xì)胞術(shù)：將藻液樣品適當(dāng)稀釋，采用CytoFLEXS流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞密度，流速為10 μL/min，閾值設(shè)置為SYTO通道1 000 CFU/mL讀取30 s，根據(jù)得到稀釋后的細(xì)胞密度[11]。

比生長速率(單位：d–1)的計算根據(jù)公式：

其中Ct1、Ct2分別代表t1和t2時間點的細(xì)胞密度。

1.4.2 葡萄糖濃度測定

葡萄糖濃度采用 SBA-40D生物傳感分析儀進(jìn)行測定，矯正范圍為0.5–1.0 g/L。測定前，取待測樣品的上清液，采用針筒過濾器(0.45 μm濾膜)先進(jìn)行過濾，然后將其稀釋至葡萄糖測定濃度的矯正范圍內(nèi)。用1.0 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)，待定標(biāo)通過后，用微量注射器吸取25 μL稀釋好的上清液進(jìn)行測定，每個樣品重復(fù)測定3次后取平均值，測定讀數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為待測樣品的葡萄糖濃度。

1.4.3 硝酸根離子濃度測定

使用意大利HANNA HI83200多參數(shù)水質(zhì)分析儀測定硝酸根的濃度。硝酸根平均同化速率(單位：g/(L·d))的計算根據(jù)公式：

其中Nt1、Nt2分別代表t1和t2時間點的硝酸根濃度。

1.4.4 蛋白質(zhì)含量測定

采用 FOSS公司的半自動凱氏定氮儀測定蛋白質(zhì)含量。

1.4.5 色素含量測定

稱取凍干后的藻粉10 mg于2 mL的凍存管中并加入適量的陶瓷珠，然后加入90%丙酮溶液1 mL，液氮反復(fù)凍融后利用振蕩器多次振蕩提取到藻粉呈現(xiàn)白色后，吸取上清液并合并定容到10 mL，6 000 r/min離心10 min，再次吸取上清液定容到10 mL，最后將定容后的樣品稀釋到一定濃度，利用紫外分光光度計測定波長分別為 470 nm、646 nm和663 nm下的吸光度，采用以下公式計算得到葉綠素 a、葉綠素 b和葉黃素濃度(單位為 μg/mL)[10]。

其中Ca、Cb和Ct分別表示葉綠素a、葉綠素b和葉黃素濃度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Origin V8.5 Software和SPSS Statistics對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶培養(yǎng)中培養(yǎng)模式對硝酸根同化速率、藻蛋白與色素合成的影響

本實驗在 250 mL搖瓶中進(jìn)行小球藻的混養(yǎng)培養(yǎng)，考察了培養(yǎng)模式對小球藻細(xì)胞吸收同化硝酸根的影響。其中，在補料分批培養(yǎng)模式下設(shè)計培養(yǎng)基回流，是因為此時培養(yǎng)基中還有較高的硝酸根離子殘留，暫未滿足工業(yè)污染物中NO3–直接排放不超過15 mg/L或間接排放不超過40 mg/L的要求和WHO 2017年安全飲用水中NO3-N質(zhì)量濃度最大允許值 (11.3 mg/L) 的標(biāo)準(zhǔn) (即最大NO3質(zhì)量濃度為50 mg/L)[12-13]。本研究中，培養(yǎng)基回流就是利用微藻繼續(xù)對培養(yǎng)基中的硝酸根離子進(jìn)行同化固定，直到培養(yǎng)基中的硝酸根離子全部消耗完后才會直接排放。實驗結(jié)果如圖1所示。所采用的 4種培養(yǎng)模式分別為分批培養(yǎng)、25%回流補料分批、50%回流補料分批和補料分批培養(yǎng)。

圖1 不同培養(yǎng)模式下蛋白核小球藻細(xì)胞生長 (A)、細(xì)胞密度 (B) 及培養(yǎng)基葡萄糖 (C) 和硝酸根 (D) 濃度變化Fig. 1 Biomass (A) and cell density (B) of C. pyrenoidosa grown under different cultivation modes with changes of glucose and NO3– concentration (C–D).

如圖1A和1B所示，在接種初期，微藻的生長存在短暫的延滯期，此時培養(yǎng)基尚未流加或更新，小球藻細(xì)胞的干重濃度和細(xì)胞密度均隨著培養(yǎng)時間的延長而呈現(xiàn)不斷增加的趨勢；同時，在不同培養(yǎng)模式下，微藻培養(yǎng)基中硝酸根含量均呈下降的趨勢 (圖1C)。值得注意的是，從培養(yǎng)的第4天開始，即進(jìn)行培養(yǎng)基回流后，在25%回流補料分批和50%回流補料分批的培養(yǎng)條件下，小球藻的生物量干重都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。同時，通過計算可知，小球藻在補料分批條件下，細(xì)胞的比生長速率為0.13 d–1，而在25%回流補料分批和50%回流補料分批條件下的比生長速率分別為 0.27 d–1和 0.11 d–1。50%回流補料分批的比生長速率較補料分批培養(yǎng)條件下略低，可能是因為小球藻無法在短時間內(nèi)通過快速繁殖以彌補因收獲過多的藻細(xì)胞而造成的細(xì)胞生物量干重降低(圖1A)。另外，由圖1C可知，在培養(yǎng)第4天，即未進(jìn)行培養(yǎng)基回流前，25%回流補料分批和50%回流補料分批實驗組中其殘余的硝酸根含量分別為2.91 g/L和2.68 g/L；從開始回流到實驗結(jié)束，25%回流補料分批、50%回流補料分批和補料分批培養(yǎng)，其后期的硝酸根平均同化速率分別為0.93 g/L、0.87 g/L和0.91 g/L。由此可見小球藻在25%回流補料分批條件下其同化硝酸根的能力比補料分批培養(yǎng)略高。這一結(jié)果與Liu等通過連續(xù)預(yù)收獲螺旋藻優(yōu)化光分布并控制生物量濃度以提高微藻對于氮素利用率的實驗結(jié)果相一致，說明適宜的收獲率能提高微藻對培養(yǎng)基中氮素的去除效果[14]。培養(yǎng)基離心收集藻細(xì)胞并回流培養(yǎng)基的過程中，一方面降低了培養(yǎng)體系中的藻細(xì)胞密度，增強單個細(xì)胞吸收利用光的有效面積，重新優(yōu)化了光照分配，有利于微藻細(xì)胞生長和對硝酸根的吸收同化；另一方面回流的培養(yǎng)基中殘留硝酸根繼續(xù)作為氮源供微藻細(xì)胞生長，減少了直接排放造成的環(huán)境污染[14-15]。

從整個培養(yǎng)過程來看，在補料分批培養(yǎng)模式下，培養(yǎng)第0–1天，藻細(xì)胞密度增長最緩慢，培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗速率也較低 (圖 1A)。第1天后，藻細(xì)胞增長迅速，葡萄糖和硝酸根消耗與細(xì)胞生長相一致，都呈現(xiàn)較高的速率。同時可以觀察到，分批培養(yǎng)下細(xì)胞在培養(yǎng)初期增長較慢，出現(xiàn)較長的延滯期，推測可能是高濃度的葡萄糖抑制了小球藻細(xì)胞的生長增殖[16]。當(dāng)培養(yǎng)至第6天時，培養(yǎng)基中硝酸根全部消耗完畢，細(xì)胞干重和細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，分別為 35.95 g/L和6.78×108CFU/mL。補料分批培養(yǎng)模式下，藻細(xì)胞的最大生物量與本實驗其他培養(yǎng)方式相比增加較多，存在顯著性差異 (P<0.01)。這說明補料分批培養(yǎng)是最適宜小球藻細(xì)胞生長的培養(yǎng)模式。

不同培養(yǎng)模式下小球藻細(xì)胞生長和培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)的消耗情況如表1所示。由表1可知，不同培養(yǎng)模式顯著影響小球藻細(xì)胞生物量及營養(yǎng)物質(zhì)的消耗 (P<0.05)。25%回流補料分批和 50%回流補料分批均可以獲得較高的葡萄糖消耗量和硝酸根同化速率，但是并未完全轉(zhuǎn)化為小球藻生物量；同分批培養(yǎng)相比，其最大生物量還要略低。而在補料分批培養(yǎng)模式下，藻細(xì)胞最大生物量干重和生物量產(chǎn)率，均顯著高于本實驗中的其他3種培養(yǎng)模式 (P<0.01)；與此同時，小球藻在補料分批培養(yǎng)模式下的硝酸根平均同化速率也表現(xiàn)出極優(yōu)的效果，達(dá)到2.06 g/(L·d) (P<0.01)。這可能是由于補料分批培養(yǎng)模式下，小球藻細(xì)胞一直處于碳充足的狀態(tài)，營養(yǎng)物質(zhì)比較豐富，更加適宜藻細(xì)胞生長，同時保證了較高的細(xì)胞密度，促進(jìn)了培養(yǎng)過程中小球藻同化硝酸根的速率。以上研究結(jié)果表明，補料分批培養(yǎng)可以顯著提高細(xì)胞密度和最終的生物量濃度[17]，是最適宜小球藻高密度發(fā)酵培養(yǎng)并同時高效同化吸收硝態(tài)氮的培養(yǎng)模式。

不同培養(yǎng)模式下小球藻胞內(nèi)類胡蘿卜素、總?cè)~綠素和蛋白質(zhì)含量的影響情況如圖2所示。四種不同的培養(yǎng)模式對于小球藻胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響程度，從高到低排序為：分批培養(yǎng)>50%回流補料分批>補料分批培養(yǎng)>25%回流補料分批。其中分批培養(yǎng)模式下蛋白質(zhì)的最終含量可以占干重的45.04%，略高于本實驗中的其他3種培養(yǎng)模式；在色素積累方面，分批培養(yǎng)模式獲得最大的色素積累量，其總類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量分別為干重的 0.52%和 4.02%，相對于其他 3種培養(yǎng)模式具有顯著差異 (P<0.01)。由以上結(jié)果可知，分批培養(yǎng)模式更有利于小球藻胞內(nèi)色素和蛋白質(zhì)的合成和積累。這可能是因為在分批培養(yǎng)過程中的C/N比隨培養(yǎng)時間不斷下降，而較低的C/N比更能促進(jìn)微藻中含氮化合物如葉綠素和蛋白質(zhì)的合成積累[18]。

表1 不同培養(yǎng)模式下蛋白核小球藻細(xì)胞生物量產(chǎn)率和營養(yǎng)物質(zhì)消耗Table 1 Biomass productivity and nutrient consumption of C. pyrenoidosa cells under different cultivation modes

圖2 不同培養(yǎng)模式下蛋白核小球藻細(xì)胞內(nèi)色素和蛋白質(zhì)含量Fig. 2 Pigments and protein contents in C. pyrenoidosa cells under different cultivation modes. The light intensity was constant at 210 μmol/(m2·s).

2.2 不同光照模式下硝酸根同化速率和細(xì)胞生長

本實驗重點考察了不同光照模式對于搖瓶培養(yǎng)小球藻過程中的硝酸根同化速率和藻細(xì)胞生長的影響，結(jié)果如圖3所示。培養(yǎng)過程中，小球藻在兩種不同的光照模式下對于葡萄糖的同化速率都較快，并在培養(yǎng)的第2、3天時培養(yǎng)基中的葡萄糖基本都消耗完畢。此時，分別添加20 g/L葡萄糖，再培養(yǎng)到第5天時，硝酸鹽基本消耗完畢。培養(yǎng)過程中共消耗葡萄糖60 g/L。與此同時，蛋白核小球藻在兩種不同的光照模式下均生長良好，細(xì)胞的生長呈現(xiàn)相同的變化趨勢，即在階梯式光強和恒定光強下培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞干重最大值分別達(dá)到了 28.90、28.85 g/L，細(xì)胞密度分別達(dá)到7.22×108、7.58×108CFU/mL。此外，在不同光照模式下，小球藻對于培養(yǎng)基中的葡萄糖和硝酸根同化量，也呈現(xiàn)相同的變化趨勢。

圖3 恒定和階梯式光強下細(xì)胞生長 (A) 及培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)消耗 (B)Fig. 3 Cell growth (A) and nutrient consumption in medium (B) under constant and staged illumination modes. B1: 150 μmol/(m2·s); B2: 180 μmol/(m2·s); B3:210 μmol/(m2·s). After that, the light intensity was constant at 210 μmol/(m2·s).

不同光照模式對不同培養(yǎng)時間段小球藻硝酸根的平均同化速率和藻細(xì)胞比生長速率的影響如表2所示。由表2可知，在恒定和階梯式光強下，蛋白核小球藻在培養(yǎng)初期均迅速繁殖。在恒定光強下，小球藻的比生長速率和硝酸根平均同化速率在第2天達(dá)到最大值，分別為0.39 d–1和4.46 g/(L·d)。在階梯式光強培養(yǎng)模式下，當(dāng)?shù)谝淮伍_始補加葡萄糖時，即培養(yǎng)第 2–3天時，將光照強度從120 μmol/(m2·s)提高到 150 μmol/(m2·s)，其硝酸根平均同化速率出現(xiàn)了明顯的增加，并顯著高于同時期下的恒定光強培養(yǎng)模式下的增加量 (P<0.01)。當(dāng)?shù)?次補加葡萄糖時，同時將光照強度提高到180 μmol/(m2·s)，即培養(yǎng)第 3–4 天時，小球藻的比生長速率達(dá)到最大值為0.65 d–1，顯著高于恒定光強下的最高比生長速率 (P<0.01)，且硝酸根平均同化速率顯著高于同時期下的恒定光強培養(yǎng)模式 (P<0.01)。當(dāng)培養(yǎng)第4–5天時，階梯式光強和恒定光強之間的差距逐漸縮小，比生長速率之間無顯著性差異。

最后，綜合比較不同光照模式對于小球藻的硝酸根平均同化速率和平均比生長速率可知，恒定光強模式下的硝酸根平均同化速率略高于階梯式光強，但兩者之間的細(xì)胞平均比生長速率之間無顯著性差異。有研究表明，光是微藻進(jìn)行光合作用的主要能量來源，光通過提供能量將電子從水轉(zhuǎn)移到NADP+，形成NADPH (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸) 和產(chǎn)生 ATP (腺苷三磷酸)，為細(xì)胞的生命代謝提供需要的原材料。有研究證實，在黑暗條件下微藻無法進(jìn)行光合作用，死亡速率高于生長速率，藻類停止生長；隨著光照強度增強，光合速率逐漸提高，小球藻的生長速率隨光強的增加而不斷提高；當(dāng)光照強度超過光飽和值，小球藻的生長速率隨光照強度的增加而下降，這可能是因為過高的光照強度抑制了光合系統(tǒng)Ⅱ的活性，同時使與光合作用相關(guān)的色素和酶受到光氧化傷害而使光合作用速率下降[19-20]。由此可見，光對于微藻細(xì)胞的生長具有重要影響。同時，光照強度對于微藻同化硝酸根的能力也具有重要影響。有研究表明，光照強度的增加會提高微藻同化硝酸根的速率，這可能是因為小球藻在外界吸收的氮主要通過轉(zhuǎn)化為含氮化合物的形式在體內(nèi)儲存，并且細(xì)胞內(nèi)含氮化合物的含量與光合速率呈正相關(guān)的關(guān)系[21]。同時，有研究也發(fā)現(xiàn)，在光照條件下，藍(lán)藻等微藻可以通過 Calvin-Benson循環(huán)為細(xì)胞氮吸收和同化途徑的代謝過程提供光合作用產(chǎn)生的ATP、細(xì)胞還原力NADPH和鐵氧還蛋白 (Fd)，從而顯著提高藍(lán)藻對于硝態(tài)氮的同化能力[22-23]。另外，也有研究指出，在非營養(yǎng)條件的限制下，光照強度的增加可以提高細(xì)胞內(nèi)的光合作用，促進(jìn)藻細(xì)胞分裂增殖的能力，從而提高了培養(yǎng)基中硝酸根的同化[24]。這與本研究中發(fā)現(xiàn)的培養(yǎng)第2–3天時提高光強促進(jìn)小球藻細(xì)胞生長和硝酸根同化速率的結(jié)果基本一致。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)因光照強度導(dǎo)致細(xì)胞生長和硝酸根平均同化速率的差異在后期逐漸縮小，推測可能是因為細(xì)胞密度的增加，增強了細(xì)胞之間的掩蔽作用，降低了分配到每一個細(xì)胞的光照強度，從而減弱了光照強度對細(xì)胞生長的影響[10]。

表2 恒定和階梯式光照模式下蛋白核小球藻的硝酸根平均同化速率和比生長速率Table 2 The average NO3– consumption rate and specific growth rate of C. pyrenoidosa under constant and staged illumination conditions

兩種不同光照模式對于蛋白核小球藻細(xì)胞內(nèi)色素和蛋白質(zhì)含量的影響情況如圖4所示。在恒定光強下，其蛋白質(zhì)含量占干重的44.01%，比階梯式光強下培養(yǎng)增加了 3.66%。但是，在階梯式光強下，小球藻胞內(nèi)總類胡蘿卜素和總?cè)~綠素占干重的百分比含量分別為 0.73%和 3.83%，顯著高于恒定光強 (P<0.01)。推測這可能是因為恒定高光強下，光強過高對于藻細(xì)胞的葉綠體具有損傷作用，不利于葉綠素的合成，同時其中過量的光能以熱能的形式被消耗，并不能被葉綠體的光合作用吸收而用于細(xì)胞生長；而在從低光強到高光強逐漸過渡的過程中，光強的逐步增強，一定程度上會減少過高光強對于細(xì)胞的損傷，同時提高葉綠體中光合作用的電子傳遞速率，從而最終促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)葉綠素的積累[25]。

圖4 恒定和階梯式光照模式下蛋白核小球藻細(xì)胞內(nèi)色素和蛋白質(zhì)含量Fig. 4 Contents of pigments and proteins in C. pyrenoidosa cells under constant and staged illumination conditions.

2.3 補料分批培養(yǎng)

圖5展示了蛋白核小球藻在5 L光發(fā)酵罐中進(jìn)行混養(yǎng)補料分批培養(yǎng)128 h的過程中，葡萄糖和硝酸根的消耗以及藻細(xì)胞的生長情況。在整個培養(yǎng)過程中，硝酸作為補充氮源，并用來維持發(fā)酵過程中的pH值。由圖5可知，在培養(yǎng)0–24 h時，小球藻的生長出現(xiàn)短暫的延滯，同時培養(yǎng)基中的葡萄糖幾乎沒有出現(xiàn)消耗，小球藻同化硝酸根的速率十分緩慢。培養(yǎng)24 h后，葡萄糖消耗迅速，期間不斷流加葡萄糖母液，維持培養(yǎng)基中葡萄糖濃度在25–30 g/L，此時蛋白核小球藻的干重含量隨著葡萄糖消耗量的增加而不斷增加，并在112 h達(dá)到最大值 (66.22 g/L)；小球藻的快速生長與高效的硝酸根同化速率是一致的。小球藻對硝酸根的最大同化速率出現(xiàn)在64 h，在該時間段最大值可達(dá)到35.10 g/(L·d)；之后，在72–88 h時，小球藻的硝酸根同化速率逐漸降低，培養(yǎng)基中的硝酸根在88 h之后未出現(xiàn)明顯消耗，但88 h時小球藻的生物量產(chǎn)率達(dá)到最大值為 24.35 g/(L·d)。推測其原因可能是培養(yǎng)基中逐步增高的氮磷比，降低了細(xì)胞吸收利用氮的能力[26]；同時可以發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)至 112 h后，細(xì)胞干重基本保持穩(wěn)定。在0 h到128 h的整個發(fā)酵過程中，蛋白核小球藻的硝酸根平均同化速率為4.38 g/(L·d)，達(dá)到較高的吸收同化速率。目前研究報道的微藻細(xì)胞對于硝酸根的同化速率為2.08 g/(L·d)[27]，而本研究結(jié)果顯著高于該值，這說明采用蛋白核小球藻來吸收同化硝酸根具有重要的生產(chǎn)優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

圖5 光發(fā)酵罐補料分批培養(yǎng)過程中葡萄糖和硝酸根濃度以及細(xì)胞生物量的濃度變化Fig. 5 Changes in glucose and NO3– concentration with biomass yield in the fed-batch cultivation in 5 L photo fermenter of C. pyrenoidosa.

蛋白核小球藻在5 L光發(fā)酵罐中進(jìn)行補料分批培養(yǎng)過程中的色素和蛋白質(zhì)的變化情況如圖 6所示。由圖6可知，蛋白質(zhì)含量隨培養(yǎng)時間的增加，大約呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢?？?cè)~綠素和總類胡蘿卜素的含量隨培養(yǎng)時間表現(xiàn)出與蛋白質(zhì)含量相同的趨勢，并且在培養(yǎng)至72 h時，達(dá)到最大值，分別占干重的 3.07%和 0.57%。同本研究中搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果對比可知，發(fā)酵罐培養(yǎng)小球藻，其胞內(nèi)的總?cè)~綠素和總類胡蘿卜素的含量略有下降。同文獻(xiàn)對比可知，其色素含量差別較小[28]。此外，蛋白質(zhì)含量在小球藻細(xì)胞內(nèi)最高可以達(dá)到干重的 47.13%，是藻細(xì)胞內(nèi)最主要的含氮化合物。但是通過文獻(xiàn)對比可知，整個培養(yǎng)過程中，藻細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)含量低于之前文獻(xiàn)報道過的蛋白核小球藻中蛋白質(zhì)的含量 (可高達(dá)50%以上)[26]。有研究報道指出培養(yǎng)過程中高的C/N比會刺激細(xì)胞內(nèi)糖類和脂肪等含碳化合物的合成，不利于蛋白質(zhì)和色素等含氮化合物的積累[29]。由此可見，發(fā)酵過程中的C/N比及其變化情況，對于蛋白核小球藻高效同化硝酸根具有重要的影響，后續(xù)實驗中需要對碳氮比進(jìn)一步優(yōu)化，以提高小球藻對于培養(yǎng)液中硝酸根同化速率以及藻細(xì)胞生物量的轉(zhuǎn)化效率。

圖6 光發(fā)酵罐補料分批培養(yǎng)過程中色素和蛋白質(zhì)含量的變化Fig. 6 Changes in pigments and protein contents in the fed-batch cultivation in 5 L photo fermenter.

利用微藻處理工業(yè)廢硝酸或硝酸鹽廢水，其實用性主要取決于能否根據(jù)工業(yè)生產(chǎn)中廢水的連續(xù)化及量大的特點提出合理而又有效的解決辦法。針對工業(yè)廢硝酸或硝酸鹽廢水連續(xù)化排放的特點，本研究采用分批培養(yǎng)取得了良好的效果。如果能實現(xiàn)多批次培養(yǎng)，有利于實現(xiàn)富含硝酸根廢水的連續(xù)化處理。因此，采用這種混養(yǎng)小球藻多批次處理硝酸根廢水具有良好的應(yīng)用前景。目前研究表明，微藻在處理城市污水、畜禽糞便和工業(yè)廢水等不同類型的廢水處理方面有巨大潛力。微藻對培養(yǎng)環(huán)境中氮、磷的去除與細(xì)胞生物量的積累密切相關(guān)，并受生長條件和培養(yǎng)體系的影響[30]。實際生產(chǎn)中利用微藻處理工業(yè)廢水的主要方式有以下幾種：一是通過未攪拌的開放系統(tǒng)，圓形池塘和跑道池等開放系統(tǒng)。這些系統(tǒng)建造及配套設(shè)施簡單、價格相對低廉，但占地面積大、培養(yǎng)環(huán)境差、可替代藻種較少，同時易受天氣影響、培養(yǎng)過程中易受細(xì)菌等其他外來物的污染，因此處理廢水的能力十分有限[30]。二是通過現(xiàn)在研究比較熱門的光發(fā)酵系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。這是一種更可持續(xù)、更經(jīng)濟(jì)的方法，可以幫助微藻保持最佳的純培養(yǎng)條件，不受外界環(huán)境的干擾[31]。本研究主要通過光發(fā)酵系統(tǒng)，可以抵抗外界的多種干擾，通過補料分批培養(yǎng)和培養(yǎng)基回流等培養(yǎng)策略，實現(xiàn)微藻連續(xù)化生產(chǎn)，能較好地適應(yīng)工業(yè)廢水排放的連續(xù)化特點。而對于硝酸根廢水量大的特點，本實驗結(jié)果將為后續(xù)的大規(guī)模批量工業(yè)化培養(yǎng)提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。有研究表明，利用光發(fā)酵系統(tǒng)混養(yǎng)培養(yǎng)小球藻處理工業(yè)煙道氣轉(zhuǎn)化的硝酸鹽廢水，通過5 L到50 L生物反應(yīng)器的比例放大，實現(xiàn)了小球藻對于氮的平均同化速率為0.45 g/(L·d)，并獲得了 1.83 g/(L·d) 的高脂產(chǎn)率[27]。本研究中小球藻能夠高效同化硝態(tài)氮，其同化速率顯著高于之前的研究，同時能夠獲得較高的蛋白含量?，F(xiàn)有成果可以作為后期工業(yè)化培養(yǎng)的優(yōu)化條件，從而最終實現(xiàn)硝態(tài)氮廢水的大批量處理。

3 結(jié)論

本文主要研究了在混養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)模式、光照模式以及光發(fā)酵罐小試培養(yǎng)對蛋白核小球藻生長和硝酸根同化速率以及含氮化合物積累的影響。結(jié)果表明，在補料分批培養(yǎng)的模式下，蛋白核小球藻的最終生物量最大，可達(dá)到35.95 g/L。階梯式增加光強，可以提高蛋白核小球藻的最高比生長速率至0.65 d–1。在光發(fā)酵培養(yǎng)條件下，補料分批以及階梯式光強的調(diào)節(jié)模式有助于提高蛋白核小球藻的硝酸根平均同化速率，可達(dá)到4.38 g/(L·d)，生物量最高可達(dá)到66.22 g/L。后續(xù)研究中需進(jìn)一步優(yōu)化光發(fā)酵罐補料分批培養(yǎng)過程中的C/N比等參數(shù)，并對優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行光發(fā)酵驗證。這將有助于利用微藻光發(fā)酵技術(shù)高效處理工業(yè)廢硝酸或硝酸鹽廢水，實現(xiàn)硝態(tài)氮廢水的連續(xù)化和規(guī)?；幚恚瑢U水中硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為高蛋白微藻生物質(zhì)資源，變廢為寶。