劉翠玲， 鄒 琰， 吳瑩瑩， 王英俊， 劉 童， 宋愛(ài)環(huán), 唐學(xué)璽， 劉洪軍??

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2.山東省海洋生物研究院，青島市海洋生物種質(zhì)資源挖掘與利用工程實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266104)

日本蟳(Charybdisjaponica)俗稱石甲紅，石鉗爬，花蓋蟹，屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda) 梭子蟹科(Portunidae)蟳屬(Charybdis)，分布于日本、馬來(lái)西亞、紅海、臺(tái)灣島以及中國(guó)大陸的廣東、福建、浙江、山東半島等地[1]。其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且具有滋補(bǔ)、清熱等藥用價(jià)值，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的一類海產(chǎn)蟹類。目前，中國(guó)對(duì)于蝦蟹類的研究較少，主要有銳脊單肢蝦(Sicyonaingentis)[2]、南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamd)[3]、鋸緣青蟹(Scyllaserrata)[4]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[5]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[6]、日本蟳(Charybdisjaponica)[7]等的研究。中國(guó)對(duì)于日本蟳的研究多主要集中在日本蟳的群落特征[8-9]、生理生化[10-11]、養(yǎng)殖繁殖方面[12-13]，對(duì)于精子方面的研究較少，本研究旨在通過(guò)篩選多種不同的精子獲取方法和冷凍保護(hù)劑組合選擇最適的日本蟳超低溫冷凍保存的方法，為日本蟳生殖調(diào)控與育種提供科學(xué)依據(jù)。日本蟳精子超低溫冷凍保存在保護(hù)物種多樣性方面有著廣泛的研究意義和應(yīng)用前景，對(duì)于提高日本蟳種質(zhì)、選擇培育日本蟳優(yōu)良品種、提高養(yǎng)殖產(chǎn)量具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所采用的性腺成熟日本蟳來(lái)自于山東省萊州市，體重(212.9±34.2) g、殼長(zhǎng)(7.25±1.76) cm、殼寬(9.55±0.97) cm、殼高(3.55±0.46) cm。將日本蟳放入3%的高錳酸鉀浸泡30 min，用滅菌的解剖刀、鑷子將精巢部分迅速解剖，取出輸精管，置于裝有少量無(wú)鈣離子人工海水(Ca2+-FASW)[14]的小玻璃皿中，4 ℃保存，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精子的制備 機(jī)械法：稱取一定量的輸精管，置于研缽中，加入一定量滅菌的去鈣人工海水，輕輕均勻研磨3 min，勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管，離心棄上清，加入Ca2+-FASW，打成精子懸著液，4 ℃保存待檢，計(jì)算精子濃度[14]。

搓洗法：稱取一定量的輸精管，分別置于250、300、350、400、450、500目的篩絹上，搓洗，加入一定量的滅菌無(wú)鈣海水，釋出精子，將透過(guò)篩絹的勻漿液全部轉(zhuǎn)移到滅菌的離心管中，經(jīng)離心棄上清，加入Ca2+-FASW，打成精子懸著液，4 ℃保存待檢，計(jì)算精子的濃度[14]。

胰蛋白酶消化法：稱取一定量的輸精管，設(shè)置不同濃度胰蛋白酶濃度(0.012 5%、0.025%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%)、處理時(shí)間(5、10 min)、處理溫度37 ℃，消化完成后使用小牛血清蛋白終止實(shí)驗(yàn)，去掉多余酶液，加入適量的Ca2+-FASW，打成精子懸著液，4 ℃保存待檢，計(jì)算精子的濃度、存活率[7]。

1.2.2 稀釋液種類對(duì)日本蟳精子超低溫冷凍保存的影響 選取8種不同的稀釋液(天然海水、去鈣人工海水、任氏液、人工海水、NaCl -KCl溶液、 10%NaCl溶液、5%NaCl溶液、檸檬酸鈉-甘氨酸溶液)以5%(V/V)DMSO為保護(hù)液，精液與保護(hù)液按1∶4混合，平衡20 min使用程序降溫儀(Kyro360-1.7)，采用-5 ℃/min降至-20 ℃；-20 ℃平衡5 min,-10 ℃/min降至-80 ℃；-80 ℃平衡5 min降溫程序進(jìn)行程序降溫，后置于液氮中保存。

1.2.3 保護(hù)劑種類對(duì)日本蟳精子超低溫冷凍保存的影響 以去鈣人工海水為稀釋液，設(shè)置不同濃度(5%、10%和15%)的GLY、DMSO、PG抗凍保護(hù)液混合。實(shí)驗(yàn)中其他條件均與1.2.2相同。

1.2.4 平衡時(shí)間對(duì)日本蟳精子超低溫冷凍保存的影響 以去鈣人工海水為稀釋液，設(shè)置0、10、20、30和40 min，5組不同的平衡時(shí)間。其他條件均與1.2.2相同。

1.2.5降溫程序?qū)θ毡鞠y精子超低溫冷凍保存的影響 以去鈣人工海水為稀釋液，設(shè)置6種不同的降溫程序(見(jiàn)表1)。其他條件均與1.2.2相同。

表1 不同降溫程序

1.2.6 復(fù)蘇條件對(duì)日本蟳精子超低溫冷凍保存的影響 以去鈣人工海水為稀釋液，室溫解凍為對(duì)照組，設(shè)置30、35、37.5、40 ℃為實(shí)驗(yàn)組。其他條件等均與1.2.2相同。

1.3 精子質(zhì)量與濃度的測(cè)定

采用曙紅染色法，用精子計(jì)數(shù)板(清華同方)計(jì)數(shù)游離精子。在光學(xué)顯微鏡下，存活精子形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整，且不被染色。死精子被染成紅色，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組計(jì)數(shù)5次，計(jì)算精子的濃度[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0和EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。用方差分析(One-way ANOVA)來(lái)檢驗(yàn)精子冷凍前后活性差異的顯著性，并利用EXCEL軟件做柱狀圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 精子制備方法

2.1.1 機(jī)械法 在采用機(jī)械研磨法破碎精莢，獲得游離的精子實(shí)驗(yàn)中，精子的密度可達(dá)2.78×1012個(gè)/mL，精子的存活率為84.90%。

2.1.2 搓洗法 選擇不同目數(shù)的篩絹進(jìn)行精莢的破碎，獲得游離精子實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果最好的是500目的篩絹，精子濃度達(dá)3.84×1012個(gè)/mL。其次是450目的篩絹，精子濃度達(dá)3.05×1012個(gè)/mL。效果最差的是300目篩絹，精子濃度為1.01×1012個(gè)/mL。

表2 不同篩絹目數(shù)處理后精子的濃度

2.1.3 胰蛋白酶消化法 選擇不同濃度的胰蛋白酶消化5、10 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，效果最好的是低濃度的胰蛋白酶。0.05%的胰蛋白酶消化5 min，精子的死亡率為12.16%，其次是0.012 5%的胰蛋白酶消化5 min，效果最差的是0.2%的胰蛋白酶消化10 min，精子的死亡率高達(dá)83.73%，其次是0.2%的胰蛋白酶消化5 min。

表3 不同濃度胰蛋白酶處理精莢后精子的死亡率

2.2 精子的超低溫冷凍保存

2.2.1不同稀釋液種類對(duì)日本蟳精子超低溫冷凍保存的影響 如圖1所示，不同稀釋液冷凍保存日本蟳精子，凍精復(fù)蘇后存活率差異顯著，效果最好的是去鈣人工海水，精子存活率達(dá)83.76%，其次是天然海水，精子存活率達(dá)70.0%，效果最差的是5%NaCl溶液，精子存活率為0。次之是檸檬酸鈉-甘氨酸，存活率僅為3.32%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，稀釋液對(duì)精子的存活率有較大的影響，適宜的稀釋液可以使得精子在超低溫冷凍保存后仍能保持較高的存活率，不適宜的稀釋液可以使得精子在超低溫冷凍保存后精子全部死亡。

(相同字母表示差異不顯著(P>0.05),不同字母表示差異顯著(P<0.05)。The same letter means that the difference is not significant(P>0.05),and the different letter means that the difference is significant(P<0.05).)

2.2.2 保護(hù)劑種類對(duì)日本蟳精子超低溫冷凍保存的影響 如圖2所示，不同的精子冷凍保護(hù)劑中，凍精復(fù)蘇效果最好的為5% DMSO，精子存活率達(dá)89.24%；其次是5% PG，存活率為83.71%；效果較差的是5% GLY和15% GLY，但精子存活率仍能達(dá)70%以上。綜合來(lái)看DMSO是3種抗凍保護(hù)劑中最適合的抗凍保護(hù)劑，且隨著濃度的增加，精子冷凍保存的效果隨之減弱。PG的效果次之，抗凍保護(hù)的趨勢(shì)與DMSO相似。GLY是3種抗凍保護(hù)劑中效果最差的，10% GLY的效果是3種濃度梯度中最好的。

(相同字母表示差異不顯著(P>0.05), 不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。The same letter means that the difference is not significant(P>0.05),and the different letter means that the difference is significant(P<0.05).)

2.2.3 平衡時(shí)間對(duì)日本蟳精子超低溫冷凍保存的影響 如圖3所示，不同平衡時(shí)間對(duì)日本蟳精子冷凍保存后，凍精的存活率有著明顯的差異。其中，平衡20 min的實(shí)驗(yàn)組冷凍保存效果最好，其精子存活率達(dá)83.25%；其次是平衡30、40 min，精子存活率分別為69.33%、68.08%；效果最差的是沒(méi)有平衡的實(shí)驗(yàn)組，存活率僅為51.90%。最適平衡時(shí)間是平衡20 min，超過(guò)20 min或者低于20 min都會(huì)降低精子冷凍保存的存活率，且超過(guò)或者低于20 min的時(shí)間越長(zhǎng)，精子的冷凍保存的存活率越低。

(相同字母表示差異不顯著(P>0.05),不同字母表示差異顯著(P<0.05)。The same letter means that the difference is not significant(P>0.05),and the different letter means that the difference is significant(P<0.05).)

2.2.4 降溫程序?qū)θ毡鞠y精子超低溫冷凍保存的影響 如圖4所示，程序1的冷凍保存效果最好，達(dá)84.53%；其次為程序3、程序2，精子的存活率分別為83.13%、82.41%。效果最差的是程序4，存活率僅為63.23%，其次是程序5、程序6，精子存活率為64.77%、

(相同字母表示差異不顯著(P>0.05),不同字母表示差異顯著(P<0.05)。The same letter means that the difference is not significant(P>0.05),and the different letter means that the difference is significant(P<0.05).)

66.88%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在精子超低溫冷凍保存中，在0～-80℃的降溫過(guò)程中需要一個(gè)緩沖的時(shí)間段。

2.2.5 復(fù)蘇條件對(duì)日本蟳精子超低溫冷凍保存的影響 如圖5所示，不同復(fù)蘇條件下，凍精存活率效果最好的是水浴37.5 ℃，精子存活率可達(dá)87.83%，其次是35 ℃水浴解凍，存活率85.45%。40和30 ℃的效果較接近，分別為82.12%、80.22%。效果最差的是24 ℃室溫條件下的解凍，存活率為78.20%。

(相同字母表示差異不顯著(P>0.05), 不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。The same letter means that the difference is not significant(P>0.05),and the different letter means that the difference is significant(P<0.05).)

3 討論

3.1 日本蟳精子的獲取

十足目甲殼動(dòng)物具有比較特殊的生殖系統(tǒng)，精子是以精莢的形式在生殖系統(tǒng)中成熟發(fā)育的。如需要獲得游離的精子必須破壞精莢壁，在這個(gè)過(guò)程中勢(shì)必會(huì)對(duì)精子造成損傷。目前常見(jiàn)的獲取精子的方式有：機(jī)械研磨法、搓洗法和胰蛋白酶消化法。本次研究中對(duì)3種精子獲取的方法進(jìn)行比較，選擇最適合的日本蟳精子的獲取方式，盡量增加精子的游離濃度，減少機(jī)械損傷。機(jī)械研磨法由于操作簡(jiǎn)單，已經(jīng)在中國(guó)絨螯蟹[16]、日本蟳[7]、凡納濱對(duì)蝦[17]中使用。實(shí)驗(yàn)中，研磨法獲得的游離的精子的數(shù)量少，且精子的破損嚴(yán)重，死亡率高，不利于后期實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)開(kāi)展。胰蛋白酶是一類專一水解賴氨酸氨基和精氨酸羥基所形成的肽鍵的酶類。十足目甲殼類動(dòng)物精莢的主要成分就是粘多糖，使用胰蛋白酶能夠較有效的消化精莢壁獲得游離的精子。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)胰蛋白酶的濃度和消化時(shí)間進(jìn)行研究，結(jié)果表明，低濃度的胰蛋白酶消化精莢的效果最好，較高濃度的胰蛋白酶會(huì)對(duì)精子造成損傷，致使精子畸形，使得大部分的精子發(fā)生頂體反應(yīng)。馬強(qiáng)等在河蟹精子的制備過(guò)程中采用了0.2%的胰蛋白酶消化5 min，獲得較高的游離精子數(shù)[18]。產(chǎn)生差異的原因有可能是兩者精莢大小的差別，日本蟳的精莢要比河蟹的小的多，胰蛋白酶所需的濃度就小一些。搓洗法操作簡(jiǎn)單快速，精子的畸形率比較低，但是仍然無(wú)法避免對(duì)精子的損傷，而且要選擇合適的篩絹，以求獲得足夠數(shù)量的游離精子。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)篩絹目數(shù)進(jìn)行篩選，得出500目的篩絹是實(shí)驗(yàn)效果最好的，獲得的游離的精子數(shù)最多，可以保障后期實(shí)驗(yàn)的需要。張彬等在凡納濱對(duì)蝦精子的制備過(guò)程進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)搓洗法是最適合凡納濱對(duì)蝦的精子制備方法[19]。

3.2 稀釋液與保存液的篩選

超低溫保存研究中，精子冷凍保存液主要由稀釋液和抗凍劑組成，目的是為了在冷凍過(guò)程中給精子提供適宜的生理環(huán)境，調(diào)節(jié)滲透壓排出多余水分，防止冰晶造成的凍傷，從而保護(hù)精子完整的細(xì)胞膜，獲得高精子活力[20]。為了提高精子的保存年限和解凍后的精子質(zhì)量，科研工作者對(duì)精子冷凍保護(hù)液以及解凍復(fù)蘇的優(yōu)化進(jìn)行了大量研究，包括精液稀釋比例、保護(hù)液種類、平衡時(shí)間、解凍復(fù)活溫度的篩選等[21]。

實(shí)驗(yàn)以天然海水為對(duì)照組，參考選擇不同魚(yú)蝦蟹精子冷凍保存實(shí)驗(yàn)中選擇的稀釋液，進(jìn)行精子冷凍保存實(shí)驗(yàn)。1996年，柯亞夫等就以天然海水為稀釋液對(duì)中國(guó)對(duì)蝦進(jìn)行冷凍保存的實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為稀釋液中缺少M(fèi)g2+、Ca2+、K+都會(huì)降低精子冷凍保存后的存活率[22]。Vuthiphandchai等對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦的納精囊冷凍保存進(jìn)行了研究，使用無(wú)鈣人工海水作為稀釋液時(shí)保存效果最佳解凍后存活率達(dá)71.6%～72.2%[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去除Ca2+的人工海水的效果最好，天然海水和人工海水的效果均不如Ca2+-FASW。Ca2+是血漿的重要成分，蘇德學(xué)認(rèn)為白斑狗魚(yú)精子在CaCl2溶液中活力減弱，引起精子聚集現(xiàn)象，影響精子活力[24]。柴毅等在研究幾種化學(xué)因子對(duì)白緣?mèng)~央精子活力的影響中也得到相似的觀點(diǎn)[25]。因此推斷Ca2+的存在也可能對(duì)日本蟳精子產(chǎn)生抑制作用，發(fā)生聚集反應(yīng)，降低了精子的存活率，使得精子在超低溫冷凍保存中存活率下降。

保護(hù)劑能夠自由的穿透細(xì)胞膜，減小冷凍和解凍過(guò)程中細(xì)胞滲透性損傷，并阻止冰晶形成。冷凍保護(hù)劑本身對(duì)精子也有一定的損傷[26]。不同動(dòng)物種質(zhì)細(xì)胞對(duì)保護(hù)劑的適應(yīng)性和敏感性不同。目前最常用的抗凍劑有DMSO、PG、GLY等，其中GLY和DMSO是許多水生無(wú)脊椎動(dòng)物精子的良好冷凍保護(hù)劑。2008年，廖馨等[27]采用8% DMSO作為冷凍保護(hù)劑保存青蝦精子，獲得60%的存活率。王文琪等[28]以7.5%的PG為保護(hù)劑對(duì)3種蝦進(jìn)行精子冷凍保存，獲得成功。Bhavanishankar S等[4]發(fā)現(xiàn)GLY中冷凍保存的鋸緣青蟹精子比在DMSO中有更高的成活率，在12.5% GLY精子的成活率最高。Anchordoguy等保存銳脊單肢蝦時(shí)，發(fā)現(xiàn)5% DMSO保存效果最好，精子復(fù)蘇后存活率最高[2]。本實(shí)驗(yàn)中，3種抗凍保護(hù)劑的效果差異并不明顯，3種抗凍保護(hù)劑都對(duì)日本蟳精子冷凍保存產(chǎn)生了較好的保護(hù)作用，其中DMSO的效果最好，5% DMSO的保護(hù)效果最好，且隨著濃度的增加，精子冷凍保存的效果隨之減弱。PG的效果次之，抗凍保護(hù)的趨勢(shì)與DMSO相似。GLY是3種抗凍保護(hù)劑中效果最差的，但精子存活率仍能達(dá)70%以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明選擇最適的稀釋液后，3種常見(jiàn)的抗凍保護(hù)劑對(duì)精子的存活率的影響并不大。

凍液與精液混合液進(jìn)行平衡，這樣有利于抗凍劑更好地發(fā)揮作用。精子隨著溫度下降其代謝活動(dòng)也降低，平衡可以對(duì)低溫冷凍有一個(gè)逐步適應(yīng)的過(guò)程，不至于突然過(guò)冷導(dǎo)致死亡。青蝦精子4 ℃平衡30 min，很有必要[27]。許星鴻等認(rèn)為日本蟳精子樣品先于4 ℃冰箱中平衡30 min，效果較好[7]。不同平衡時(shí)間對(duì)日本蟳精子超低溫冷凍保存的影響不同，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明平衡時(shí)間不同效果差別明顯，平衡時(shí)間為0～40 min。隨著平衡時(shí)間的減少，精子存活率上升，當(dāng)平衡時(shí)間低于20 min后，精子的存活率下降。最適的精子平衡時(shí)間為20 min，過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)造成精子存活率的降低。

3.3 精子降溫程序與復(fù)蘇程序的篩選

降溫速率是決定冷凍成功與否的重要因素，降溫速度過(guò)慢會(huì)使精子在0～-60 ℃溫域內(nèi)停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，胞外環(huán)境中水分可能首先結(jié)冰使?jié)B透壓升高，胞內(nèi)水分滲出以平衡滲透壓，而導(dǎo)致胞內(nèi)因電解質(zhì)過(guò)高帶來(lái)不利影響，甚至導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重脫水、收縮變形，最終死亡；降溫速度過(guò)快時(shí)，胞內(nèi)水分可能來(lái)不及滲出胞外而在胞內(nèi)形成冰晶，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷，降溫速率是決定冷凍成功與否的重要因素[20]。Anchordoguy等[2]保存銳脊單肢蝦時(shí)認(rèn)為比較慢的降溫速率能取得較高的存活率，這與柯亞夫等對(duì)中國(guó)對(duì)蝦精子冷凍保存的研究結(jié)果相近。本實(shí)驗(yàn)表明在0～-80 ℃過(guò)程中應(yīng)給日本蟳精子一個(gè)緩沖的時(shí)間段，即在-20 ℃條件下，平衡5 min，會(huì)使得日本蟳精子的存活率明顯的上升。

復(fù)蘇方法是否合適很大程度上影響冷凍保存的效果，應(yīng)針對(duì)不同的冷卻過(guò)程選擇不同復(fù)蘇方法，復(fù)蘇速度本身的效果又與細(xì)胞的種類、冷凍時(shí)使用的保護(hù)液、降溫速度以及控制降溫的溫度(即移入液氮前所達(dá)到的溫度)有關(guān)。綠殼貽貝精子冷凍復(fù)蘇方法是室溫條件下，在盛有海水的容器中解凍，融解后才開(kāi)始測(cè)定其各項(xiàng)指標(biāo)[29]。Shishova等[30]研究歐洲青蛙精子冷凍，用40 ℃水浴對(duì)凍精解凍。Embong等[31]報(bào)道了非洲鯰魚(yú)(Clariasgariepirrus)凍精復(fù)蘇，采用在30 ℃水浴解凍30 s。本實(shí)驗(yàn)中采取37.5 ℃對(duì)日本蟳精子進(jìn)行解凍，與大部分實(shí)驗(yàn)選擇的解凍溫度接近。