白秀娟，姜恩澤，蘇 杭，朱宇航，許 愿，徐逸男，李 雪，韓志強，徐 超

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱，150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

KIT基因，又名c-KIT基因，編碼的肥大/干細胞生長因子受體（Mast/stem cell growth factor receptors）最初于貓肉瘤病毒中被發(fā)現(xiàn)[1]。在色素沉著方面，KIT基因主要調(diào)控黑色素細胞前體沿特定路徑遷移到真皮、表皮、內(nèi)耳和眼脈絡(luò)膜的過程[2]。KIT基因非正常編碼或表達量較少時，黑色素細胞不會正常增殖和遷移，機體產(chǎn)生不同程度白化[3]。白癜風患者KIT基因表達量極顯著低于正常人[4]。目前，KIT基因在動物中已發(fā)現(xiàn)多種突變體。狐貍白色被毛與KIT基因外顯子12缺失有關(guān)[5]。KIT基因易位使牛表現(xiàn)不同程度白斑[6]。阿拉伯駱駝白色斑點與KIT基因突變有關(guān)[7]。研究表明KIT基因在毛色調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

烏蘇里貉（Nyctereutes procyonoides）屬于犬科（Canidae），經(jīng)濟價值較高的毛皮動物。研究表明野豬KIT基因與毛色表型不相關(guān)[8]，烏蘇里貉KIT基因編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)與毛色相關(guān)單核苷酸位點[9-10]，烏蘇里貉KIT基因與毛色關(guān)系未見報道，為了解烏蘇里貉KIT基因及編碼蛋白結(jié)構(gòu)特性，基于機器學習和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等在線軟件對其編碼蛋白一級、二級、三級結(jié)構(gòu)作全面生物信息學分析。研究結(jié)果旨在比較烏蘇里貉與其他動物KIT基因提供參考，為了解KIT基因潛在功能提供新思路。

1 材料與方法

1.1 KIT基因轉(zhuǎn)錄本定量

根據(jù)中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所上傳到SRA數(shù)據(jù)庫的烏蘇里貉皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù):野生貉（SRS1620675，SRS1620679，SRS1620678），白貉（SRR4158185，SRR4158184，SRR4158183），紅棕貉（SRR4034955， SRR4034954，SRR4034953）各3只，原始數(shù)據(jù)均由Illumina HiSeqTM 2000雙端測序獲得，按文獻[11]方法分析轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)。為獲得clean reads便于后續(xù)分析，將接頭、低質(zhì)量序列和未知核苷酸序列過濾，使用Trinity軟件序列組裝，獲得盡可能長非冗余unigenes。通過Bowtie軟件比對unigenes。使用RSEM工具精確量化每個樣本轉(zhuǎn)錄豐度。使用FPKM方法計算每個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因表達水平。最后，分別提取不同毛色烏蘇里貉KIT基因表達量方差分析。

1.2mRNA序列收集

從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索已公布的烏蘇里貉KIT基因mRNA序列，登錄號:KM083121，保存完整CDS序列，以便進一步生物信息學分析。

1.3 烏蘇里貉KIT基因序列分析

使用DNAMAN軟件中display sequence程序分析CDS序列總長度及4種堿基含量。通過在線軟件ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析CDS區(qū)開放閱讀框。

1.4 烏蘇里貉KIT基因編碼蛋白一級結(jié)構(gòu)預(yù)測

為了解烏蘇里貉KIT基因編碼蛋白一級結(jié)構(gòu)特征，運用Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件預(yù)測KIT基因編碼蛋白理化性質(zhì)。運用基于Hphob./Kyte＆Doolittle模型在線軟件Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）預(yù)測KIT蛋白親水性和疏水性。運用在線軟件NetOGly 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）和 NetNG-ly 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNG-lyc/）分別預(yù)測KIT蛋白O-糖基位點和N-糖基位點。最后，使用在線軟件NetPhos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測烏蘇里貉KIT蛋白磷酸化位點[12]。

1.5 烏蘇里貉KIT基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)及定位分析

使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線軟件預(yù)測烏蘇里貉KIT蛋白二級結(jié)構(gòu)[12]。運用在線軟件SingalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）定 位分析KIT蛋白信號肽[13]。通過TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線工具預(yù)測分析KIT蛋白質(zhì)跨膜區(qū)位置[14]。通過在線軟件PSORT（https://www.genscript.com/psort.html）和 Softberry（http://linux1.softberry.com/）網(wǎng)站預(yù)測KIT蛋白亞細胞定位。通過NCBI Conserved Domain（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）尋找KIT蛋白保守結(jié)構(gòu)域[13]。

1.6 烏蘇里貉KIT基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)及蛋白互作分析

通過SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）網(wǎng)站構(gòu)建KIT蛋白三級結(jié)構(gòu)模型。運用 STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl）交互數(shù)據(jù)庫分析與KIT蛋白密切作用的蛋白質(zhì)。

1.7 不同物種KIT基因編碼蛋白序列進化分析

根據(jù)烏蘇里貉KIT蛋白序列，運行BLAST，獲得家犬（AAD28369.1，Canis lupus familiaris）、家貓（NP_001009837.3，F(xiàn)elis catus）、野豬（AFK92989.1，Sus scrofa）、牦牛（XP_005905988.1，Bos mutus）、藏羚羊（XP_005961702.1，Pantholops hodgsonii）、家 馬（NP_001157338.2，Equus caballus）、 家 牛（XP_005207994.2，Bos taurus）7個物種KIT蛋白序列，運用在線軟件Clustal Omeaga（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）對8個物種KIT蛋白序列比對分析，通過MEGA5.1軟件中鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種毛色KIT基因定量表達

在3種毛色烏蘇里貉轉(zhuǎn)錄本定量表達中，白貉KIT基因表達量最高，為1.4746，其次為紅棕貉（0.0748），野生貉KIT基因表達量最低（0.0246），且白貉KIT基因表達量顯著高于紅棕貉和野生貉（P＜0.05）。

2.2 烏蘇里貉KIT基因序列

DNAMAN序列分析結(jié)果顯示，烏蘇里貉KIT基因CDS區(qū)長度為2 919 bp，4種堿基含量依次為A（27.4%，800）＞T（25.6%，748）＞G（24.6%，719）＞C（22.4%，652），其中A+T含量（53%）略高于G+C含量（47%），說明該基因穩(wěn)定性較差，ssDNA分子質(zhì)量為902.77，dsDNA分子質(zhì)量為1 799.47。ORF finder開放閱讀框預(yù)測結(jié)果顯示，起始密碼子ATG編碼Met，終止密碼子TGA不編碼氨基酸，該序列共編碼972個氨基酸。

2.3 烏蘇里貉KIT基因編碼蛋白一級結(jié)構(gòu)特性

2.3.1 理化特性

在線工具Protparam分析理化性質(zhì)結(jié)果表明，烏蘇里貉KIT基因編碼蛋白分子式為C4863H7546N1294O1451S52，由15 206個原子組成，分子質(zhì)量為109 022.33，消光系數(shù)在280 nm處測量值為135 120，推測烏蘇里貉體內(nèi)半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為37.79（＜40），為穩(wěn)定氨基酸，脂肪族氨基酸指數(shù)為81.39，該蛋白質(zhì)序列等電點為6.15，屬于酸性蛋白質(zhì)。

2.3.2 親水性和疏水性

在線工具Proscal分析親水性和疏水性結(jié)果表明，烏蘇里貉KIT基因編碼蛋白中疏水性氨基酸（Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Pro）399個，親水性氨基酸（Gly、Thr、Ser、Cys、Asn、Gln、Tyr、Lys、Arg、His、Asp、Glu）573個，其中，第14位氨基酸為最大疏水性氨基酸（3.589），第364位氨基酸為最大親水性氨基酸（-2.789），且親水性氨基酸（＜0）多于疏水性氨基酸（＞0），平均親水系數(shù)為負值（-0.224），因此該蛋白質(zhì)是親水性蛋白質(zhì)，結(jié)果見圖1。

2.3.3 烏蘇里貉KIT蛋白的糖基位點和磷酸化位點預(yù)測

在線軟件NetOGly 4.0 Server分析結(jié)果顯示，烏蘇里貉KIT蛋白共存在12個O-糖基位點，分別在第 28、 30、 38、 709、 939、 950、 955、 958、959、961、962、963位氨基酸。NetNGly 1.0 Server分析結(jié)果表明，烏蘇里貉KIT蛋白共存在9個N-糖基位點，位置分別在第94、130、145、283、300、352、367、400、486位氨基酸。通過Net-Phos分析磷酸化位點結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏蘇里貉KIT蛋白共60個磷酸化位點分值高于0.5，其中包括35個絲氨酸（Ser）、10個蘇氨酸（Thr）、15個酪氨酸（Tyr），具體位置如表1所示。

2.4 烏蘇里貉KIT蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

通過SOPMA在線軟件預(yù)測烏蘇里貉KIT蛋白二級結(jié)構(gòu)。預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白有247個（25.41%）氨基酸形成α螺旋；220個（22.63%）氨基酸形成延伸直鏈；50個（5.14%）氨基酸形成β-轉(zhuǎn)角；455個（46.81%）氨基酸形成無規(guī)卷曲，因此無規(guī)卷曲為烏蘇里貉KIT蛋白主要二級結(jié)構(gòu)。

2.5 預(yù)測烏蘇里貉KIT蛋白結(jié)構(gòu)及定位

2.5.1 信號肽和跨膜區(qū)

在線分析軟件TMHMM預(yù)測該蛋白存在兩個跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，分別在第517～539、649～671位氨基酸，其余第1～516、672～972位氨基酸位于細胞膜外側(cè)，第540～648位氨基酸位于細胞膜內(nèi)側(cè)（見圖2）。

在線SignalP軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)信號肽結(jié)果顯示，該蛋白在第1～25位氨基酸為信號肽序列，因此推測該蛋白為分泌型蛋白（見圖3）。

2.5.2 保守結(jié)構(gòu)域

NCBI Conserved Domain預(yù)測結(jié)果表明，烏蘇里貉KIT蛋白共有4個保守結(jié)構(gòu)域，包括2個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域（Ig），分別位于第216～305、426～505位氨基酸殘基，1個干細胞因子受體第四免疫球蛋白樣域（Ig4_SCFR），位于第311～411位氨基酸殘基，1個蛋白激酶C（PKc-like），位于第549～924位氨基酸殘基（見圖4）。

2.5.3 亞細胞定位

在線軟件PSORT預(yù)測烏蘇里貉KIT基因編碼蛋白亞細胞定位結(jié)果顯示，該蛋白存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（21.7%）、高爾基體（13.0%）、細胞膜（34.8%）、細胞外（30.4%），Softberry網(wǎng)站分析該蛋白定位在細胞膜上評分為10.0（滿分）。

2.6 烏蘇里貉KIT蛋白同源建模

通過SWISS-MODEL對烏蘇里貉KIT蛋白同源建模，系統(tǒng)根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)跆K里貉KIT蛋白分為兩大板塊。根據(jù)烏蘇里貉KIT蛋白第33～507位氨基酸同源建模獲得三級結(jié)構(gòu)，如圖5a所示，包含KIT蛋白2個Ig和1個Ig4_SCFR。根據(jù)烏蘇里貉KIT蛋白第547～927位氨基酸同源建模獲得三級結(jié)構(gòu)，如圖5b所示，包含1個PKc-like。

2.7 KIT蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

運用STRING預(yù)測與KIT蛋白相互作用蛋白質(zhì)，如圖6所示，其中共有5個蛋白相關(guān)系數(shù)在0.950以上，包括KIT配體（KITLG），相關(guān)系數(shù)0.998；磷酸肌苷-3激酶（PIK3R1)，相關(guān)系數(shù)0.962；磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3激酶（PIK3CA），相關(guān)系數(shù)0.961；還有兩個RAS家族原癌基因NRAS、HRAS，相關(guān)系數(shù)分別為0.960、0.957。

2.8 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

通過鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中重復(fù)參數(shù)為1 000，采用鄰近法計算距離，從系統(tǒng)發(fā)育樹中可見，如圖7所示，烏蘇里貉和家犬進化距離較近，與家貓聚合為1支，家牛、牦牛、藏羚羊、野豬、家馬聚合為另1支。

3 討論

3.1 烏蘇里貉KIT基因表達量與黑色素含量關(guān)系

黑色素細胞起源于胚胎發(fā)育時神經(jīng)嵴細胞，KIT基因可調(diào)控神經(jīng)嵴細胞分化、存活和遷移[15-16]，是黑色素細胞成熟關(guān)鍵。理論上，KIT基因表達量較多利于黑色素細胞成熟，可產(chǎn)生較多黑色素，機體顏色加深。斑嘴野鴨KIT基因在褐羽和黃白羽中表達量均顯著高于白羽（P＜0.05）[17]，騮色蒙古馬KIT基因表達量極顯著高于白色蒙古馬（P＜0.01）[3]，Du等研究結(jié)果表明，白貉被毛中黑色素含量顯著低于野生貉[11]。3種毛色烏蘇里貉轉(zhuǎn)錄本定量結(jié)果表示，KIT基因在白貉中表達量最高，其次是紅棕貉，而野生貉KIT基因表達量最低，與烏蘇里貉KIT基因表達量和毛色表型關(guān)系不符，可能是烏蘇里貉KIT基因及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)與其他動物不同所致。

3.2 烏蘇里貉KIT蛋白結(jié)構(gòu)分析

文章從全球最大基因數(shù)據(jù)庫GenBank中檢索到烏蘇里貉KIT基因CDS序列作生物信息學分析，結(jié)果表明，KIT基因CDS序列全長2 919 bp，共編碼972個氨基酸。使用TMHMM和SignalP在線網(wǎng)站，基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法分別精準預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和信號肽，根據(jù)分析結(jié)果推測該信號肽位于氨基酸序列N端且分布在細胞膜外側(cè)，信號肽可調(diào)控大多數(shù)蛋白質(zhì)分泌[18-19]。根據(jù)跨膜區(qū)和結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果，2個Ig和1個Ig4_SCFR位于氨基酸序列N端且分布在細胞膜外側(cè)，1個PKc-like位于氨基酸序列C端且分布在細胞膜外側(cè)。根據(jù)跨膜區(qū)和糖基化分析結(jié)果預(yù)測，O-糖基和N-糖基全部在細胞膜外側(cè)，且O-糖基主要分布在氨基酸序列C端，少數(shù)分布在N端。N-糖基分布在氨基酸序列N端。烏蘇里貉KIT蛋白首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中作N端糖基化修飾，再轉(zhuǎn)運到高爾基體中作復(fù)雜的糖基化修飾，最后到細胞膜表面表現(xiàn)生物學功能[20-21]。Softberry和PSORT為預(yù)測蛋白質(zhì)亞細胞定位常用在線網(wǎng)站，Softberry網(wǎng)站功能全面，預(yù)測結(jié)果以評分表示，內(nèi)容較詳細。PSORT網(wǎng)站功能較單一，預(yù)測結(jié)果百分比表示。通過PSORT網(wǎng)站對烏蘇里貉KIT蛋白亞細胞定位預(yù)測分析結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)主要在細胞膜上發(fā)揮功能，與Softberry預(yù)測結(jié)果一致。根據(jù)跨膜區(qū)和磷酸化分析結(jié)果，KIT蛋白磷酸化位點有7個在細胞膜內(nèi)側(cè)，53個在細胞膜外側(cè)，其中氨基酸序列N端存在30個，氨基酸序列C端存在23個，兩個跨膜區(qū)均不存在磷酸化位點。因此，研究結(jié)果闡明烏蘇里貉KIT基因編碼蛋白的性質(zhì)，可為進一步研究提供參考數(shù)據(jù)。

3.3 KIT基因及蛋白序列比較分析

根據(jù)BLAST分析結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)烏蘇里貉、家犬和家貓聚合為一大支，表明烏蘇里貉KIT蛋白結(jié)構(gòu)與家犬、家貓相似。紅褐貉第二外顯子長為276 bp，與家犬、家貓同源性分別為97%、92%，且對野生貉、白貉、紅褐貉第二外顯子分析未發(fā)現(xiàn)突變位點[9]，張巧靈等分析羊駝KIT基因exon10-19表明，其酪氨酸激酶活性位點僅橫跨12個氨基酸，而烏蘇里貉酪氨酸激酶549～924位于氨基酸殘基之間[22]，約占KIT蛋白總長度一半。不同動物KIT蛋白結(jié)構(gòu)不同，酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域活性可影響KIT蛋白磷酸化，磷酸化轉(zhuǎn)化調(diào)控對干細胞遷移和下游信號轉(zhuǎn)導具有關(guān)鍵作用[23]。在具有白色斑點的冰島馬皮膚中發(fā)現(xiàn)，KIT基因17號外顯子中缺失一個堿基，證實該缺失可阻礙黑色素細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域功能。狐貍KIT基因17號外顯子缺失導致酪氨酸激酶域結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，赤狐被毛表現(xiàn)為鉑金色[24]。藍狐KIT基因12號外顯子缺失導致酪氨酸激酶活性發(fā)生改變，被毛表現(xiàn)為白色[5]。而在烏蘇里貉KIT基因中并未發(fā)現(xiàn)與毛色相關(guān)的單核苷酸位點[10]，F(xiàn)rischknecht報道全長7 125 bp的FERV1插入KIT基因內(nèi)含子1中，導致貓產(chǎn)生白色斑點[25]。目前，對于各物種KIT基因結(jié)構(gòu)研究較少，烏蘇里貉KIT蛋白研究結(jié)果可為進一步比較分析提供參考。烏蘇里貉KIT基因轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控研究仍較少，是否存在miRNA調(diào)控仍未知，由于抗體有限，測定不同毛色烏蘇里貉KIT蛋白表達量仍有難度。推測烏蘇里貉毛色也可能受KIT基因非編碼區(qū)調(diào)控，或是通過一種負反饋調(diào)節(jié)黑色素形成。