張鳳濤，李曉紅，王景景，孫洪濤，陳翀，陳鋒

由于高原低壓、低氧環(huán)境的影響，長期居住或急進(jìn)高原人群常常會(huì)有不同程度的高原肺動(dòng)脈高壓（high altitude pulmonary hypertension，HAPH）。高原肺水腫與HAPH 聯(lián)系密切，高原肺水腫是HAPH、肺泡液累積等因素綜合作用的結(jié)果。研究認(rèn)為，HAPH是導(dǎo)致高原肺水腫發(fā)病的關(guān)鍵因素，是目前常見的一種治療不及時(shí)可致高病死率的呼吸系統(tǒng)疾病，因此深入了解和探究高原病發(fā)病機(jī)制，對高原病的防治具有重要意義［1］。HAPH 與心血管舒張有密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，apelin可通過舒張血管來降低肺動(dòng)脈高壓上升程度以緩解HAPH［2］。HAPH 在低壓低氧條件下可誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α等因子上調(diào)［3］，其中miR-322表達(dá)上調(diào)明顯，說明其在HAPH形成中有重要的作用［4］。miRNA 是一類高度保守的非編碼RNA，可以抑制mRNA的翻譯功能或使其降解［5］。本實(shí)驗(yàn)擬使用SD大鼠建立缺氧性肺動(dòng)脈高壓模型，通過腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染封閉miR-322相關(guān)序列實(shí)現(xiàn)差異性表達(dá)，以期闡述miR-322對apelin的影響及調(diào)控肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SPF級雄性SD大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號SCXK-（軍）2012-0004。大鼠飼養(yǎng)于清潔、通風(fēng)良好環(huán)境，自由攝食、飲水?？俁NA提取試劑盒、miRNA提取試劑盒（中國福際公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622）和apelin 抗體（abcam 公司），α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（boster公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、Alexa 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗（servicebio公司），Quantscript RTKit和Real Master Mix（Probe）購自天根生化科技有限公司?？蛰d腺病毒以及miR-322-5P封閉腺病毒由和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司合成。TaqMan探針及引物委托中美泰和公司完成。

1.2 方法

1.2.1 HAPH動(dòng)物模型建立 40只大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為常氧組、低氧組、空載體組及miR-322沉默組（n=10），剔除實(shí)驗(yàn)過程中死亡大鼠后常氧組10 只，低氧組、空載體組、miR-322沉默組各9只。病毒轉(zhuǎn)染采用氣道轉(zhuǎn)染法［6］，轉(zhuǎn)染完成后與低氧組相同方法造模。低壓氧艙模擬6 000 m海拔高度，艙內(nèi)大氣壓47.5 kPa，9.5%～10.1%O2連續(xù)低氧培養(yǎng)21 d，制備低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型［7］，常規(guī)飼料喂養(yǎng)；常氧組自由呼吸進(jìn)食，其他條件相同。

1.2.2 大鼠處理與取材 大鼠飼養(yǎng)21 d后，造模大鼠從低壓氧艙中快速取出，與常氧組大鼠均采用異氟烷吸入法麻醉，右心漂浮導(dǎo)管法檢測肺動(dòng)脈壓，計(jì)算各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）并取頸動(dòng)脈血0.5 mL 進(jìn)行肺動(dòng)脈氧分壓［p（O2）］檢測；放血處死各組大鼠，隨機(jī)數(shù)字表法抽取每組大鼠5 只，取肺組織約100 mg 提取總蛋白用于Western blot 檢測，20 mg 提取總RNA，30 mg提取miRNA用于PCR檢測。

1.2.3 HE染色觀察肺組織形態(tài) 肺組織置于10%福爾馬林中固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、HE染色后在光鏡下（×200）觀察肺組織學(xué)形態(tài)，每張切片隨機(jī)讀取3個(gè)視野。

1.2.4 免疫熒光染色觀察α-SMA 表達(dá) 石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，抗原修復(fù)，山羊血清封閉，加入α-SMA 一抗，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）避光洗滌后孵育二抗，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下（×400）觀察。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測肺組織miR-322以及apelinmRNA 表達(dá) 嚴(yán)格按照試劑使用說明書提取總RNA 及miRNA，用TaqMAN 探針法進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，每個(gè)樣本做3 個(gè)復(fù)孔。以10 倍稀釋模板樣本進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，以內(nèi)參照基因（GAPDH）進(jìn)行相對定量，采用2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算miR-322和apelinmRNA表達(dá)水平。qPCR引物見表1。

Tab.1 Primer sequence of qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.6 Western blot 法檢測肺組織apelin 蛋白表達(dá) 取約100 mg 肺組織，加入RIPA 裂解液1 mL，冰上研磨制備成勻漿。4 ℃離心10 min，留取上清液并用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。每組取45 μg，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（80 V，100 min）分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉，經(jīng)封閉后加入apelin一抗（1∶500）4 ℃過夜，次日PBST（含1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，PBS-Tween-20）漂洗3 次，每次10 min；加入二抗（1∶5 000），室溫?fù)u床1 h后，PBST漂洗3次，每次10 min，加入ECL化學(xué)發(fā)光劑曝光顯影。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠p（O2）與mPAP 比較 與常氧組比較，低氧組、空載體組及miR-322 沉默組p（O2）均下降，mPAP 均升高；與低氧組比較，miR-322 沉默組p（O2）上升，mPAP 下降（P＜0.05），低氧組和空載體組2指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of oxygen partial pressure and mean pulmonary artery pressure between four groups表2 各組大鼠肺動(dòng)脈氧分壓和平均肺動(dòng)脈壓比較（mmHg，）

Tab.2 Comparison of oxygen partial pressure and mean pulmonary artery pressure between four groups表2 各組大鼠肺動(dòng)脈氧分壓和平均肺動(dòng)脈壓比較（mmHg，）

＊P＜0.05；a與常氧組比較，b與低氧組比較，c與空載體組比較，P＜0.05；表3同；1 mmHg=0.133 kPa

mPAP 14.59±1.42 24.96±1.11a 24.95±1.60a 21.61±1.66abc 107.690＊組別常氧組低氧組空載體組miR-322沉默組F n 10 9 9 9 p(O2)98.94±1.90 72.68±4.29a 74.11±4.07a 81.72±4.07abc 104.197＊

2.2 各組肺組織形態(tài)學(xué)變化 常氧組肺泡間隔正常，組織結(jié)構(gòu)良好。與常氧組比較，低氧組肺泡間隔明顯增寬，肺泡及肺間隔可見紅細(xì)胞，肺泡腔中出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞，損傷嚴(yán)重，空載組與低氧組損傷程度相似。miR-322 沉默組較低氧組損傷程度降低，見圖1。

Fig.1 Comparison of HE staining results between four groups(HE staining,×200)圖1 各組大鼠肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化（HE染色，×200）

2.3 大鼠肺組織α-SMA表達(dá) 常氧組肺組織中α-SMA 表達(dá)量較低，低氧組較常氧組表達(dá)上升，miR-322沉默組較低氧組表達(dá)量進(jìn)一步上升，見圖2。

Fig.2 Expressions of α-SMA in lung tissue of four groups(IF，×400)圖2 各組大鼠肺組織α-SMA表達(dá)情況（免疫熒光，×400）

2.4 各組肺組織miR-322和apelin蛋白及mRNA的表達(dá)水平比較 與常氧組比較，低氧組、空載體組及miR-322 沉默組miR-322mRNA 相對表達(dá)量、apelin mRNA 和apelin 蛋白相對表達(dá)量升高；與低氧組比較，miR-322 沉默組miR-322mRNA 相對表達(dá)量降低，apelin mRNA和蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；低氧組與空載體組各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3、圖3。

Tab.3 Comparison of expressions of miR-322,apelin protein and mRNA pairs between four groups表3 各組miR-322以及apelin蛋白和mRNA相對表達(dá)水（n=5）

Tab.3 Comparison of expressions of miR-322,apelin protein and mRNA pairs between four groups表3 各組miR-322以及apelin蛋白和mRNA相對表達(dá)水（n=5）

組別常氧組低氧組空載體組miR-322沉默組F miR-322 mRNA相對表達(dá)量1.07±0.14 3.22±0.32a 3.23±0.24a 1.31±0.23bc 120.204＊apelin相對表達(dá)量mRNA 1.03±0.19 2.90±0.32a 3.19±0.38a 5.31±0.48abc 120.017＊蛋白0.90±0.16 1.13±0.11a 1.10±0.09a 1.42±0.13abc 14.764＊

Fig.3 Expressions of apelin protein in lung tissues of each group圖3 各組肺組織中apelin蛋白表達(dá)情況

3 討論

急進(jìn)高原地區(qū)的人群由于高原低壓和低氧環(huán)境的影響，常引起急性高原病。急性高原病以低氧性肺動(dòng)脈高壓引起的急性高原肺水腫最為典型，該病起病急、病情重，救治不及時(shí)可造成病死率明顯增高。急性高原肺水腫發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，體內(nèi)調(diào)控基因及影響因子多，發(fā)病機(jī)制尚不明確［8-9］。目前，關(guān)于高原型肺動(dòng)脈高壓研究發(fā)現(xiàn)，apelin可在低氧或缺氧條件下擴(kuò)張心血管以減輕肺動(dòng)脈壓上升程度［10-11］，但大多是在蛋白水平上的研究和探討，近幾年關(guān)注于基因水平上探究肺動(dòng)脈高壓的調(diào)控機(jī)制。miRNA不同基因在不同程度上參與了肺動(dòng)脈高壓的調(diào)節(jié)［12］。不同的肺動(dòng)脈高壓模型引起的miRNA 表達(dá)效果有差異，多種miRNA 如miR-145/143、miR-23b等［13-14］均可影響肺動(dòng)脈高壓的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致肺動(dòng)脈重塑。但是在高原肺動(dòng)脈高壓發(fā)病過程中apelin的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

本實(shí)驗(yàn)中21 d的低壓低氧干預(yù)使大鼠形成了典型的肺動(dòng)脈高壓，與以往實(shí)驗(yàn)研究中的大鼠肺動(dòng)脈高壓的結(jié)果一致［7］。本研究結(jié)果顯示，與常氧組比較，低氧組mPAP、α-SMA、apelin 蛋白以及miR-322mRNA 相對表達(dá)量均升高，p（O2）下降，肺組織破壞嚴(yán)重，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。與低氧組相比，miR-322 沉默組mPAP 以及miR-322mRNA 相對表達(dá)量均下降，α-SMA、p（O2）、apelin 蛋白相對表達(dá)量上升，miR-322 沉默組肺組織損傷程度減輕，表明miR-322mRNA可通過抑制apelin的表達(dá)，從而使肺動(dòng)脈壓上升，在miR-322被抑制后，apelin表達(dá)上升，降低了肺動(dòng)脈壓上升程度，同時(shí)減輕了肺組織的損傷，提示在高原型肺動(dòng)脈高壓中，miR-322 低表達(dá)可以上調(diào)apelin蛋白的表達(dá)，這與Zhu等［10-11］研究結(jié)果一致。HE染色結(jié)果顯示，低氧組肺組織損傷嚴(yán)重，而miR-322沉默組中肺組織損傷明顯減輕；免疫熒光結(jié)果表明，apelin 高表達(dá)可以促進(jìn)α-SMA 表達(dá)，增加血管擴(kuò)張程度，緩解肺動(dòng)脈壓的上升并且降低血管增厚程度，這與HE結(jié)果一致，再次證實(shí)miR-322抑制了apelin的表達(dá)，內(nèi)源性apelin 可以舒張血管，增加平滑肌活躍性，這一點(diǎn)不同于吳媛媛等［15］外源性apelin 作用效果結(jié)論，該研究認(rèn)為在臨床上要盡可能避免使用外源性apelin 治療高原肺動(dòng)脈高壓。

綜上，大鼠高原型肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺組織中miR-322 和apelin 表達(dá)明顯升高，在抑制miR-322 后，apelin表達(dá)進(jìn)一步升高，miR-322可能通過降低肺組織內(nèi)源性apelin 蛋白的表達(dá)，降低了機(jī)體的血管擴(kuò)張反應(yīng)，不利于機(jī)體適應(yīng)高原性氣候的生活。